全 文 ：山楂叶抗超氧阴离子活性与化学特征相关指纹的探索研究
刘荣华1 , 陈兰英1 , 余伯阳2 , 黄慧莲1 , 邵 峰1 , 任 刚1*
( 1 江西中医学院 现代中药制剂教育部重点实验室, 江西 南昌 330004; 2 中国药科大学
中药复方研究室, 江苏 南京 210038)
摘 要:目的 研究山楂叶 H PLC 指纹图谱与其抗超氧阴离子( O2 - )活性之间的相互关系。方法 以山楂叶对超
氧阴离子的清除活性为评价指标,分别对 5种不同山楂叶 H PLC 指纹图谱的各指纹峰进行药效实验,建立各指纹
峰峰面积与抗超氧阴离子活性之间关系(峰效关系)的数学模型, 再通过数学、化学计量学、计算机编程与模拟等手
段将山楂叶的 H PLC 指纹图谱翻译成生物活性指纹图谱(包括药效指纹图谱和效价指纹图谱)。结果 建立了山
楂叶的质量评价新模式,该模式预测值与实际值 r= 0 846(P < 0 05) ; 5 个样品预测值均为实际值的 70%以上。结
论 该模式是融化学鉴定与生物活性评价为一体的综合质量评价体系, 弥补了已有中药质量评价模式的局限性,
为中药现代化研究提供了一条新的思路。
关键词:山楂叶; 谱效关系;质量评价模式; 生物活性指纹图谱
中图分类号: R284 2 文献标识码: A 文章编号: 0253-2670( 2010) 07- 1173- 06
Exploring study on inhibition on O2
and correlative chemical characteristic
fingerprint of Crataegi Folium
LIU Rong-hua1 , CH EN Lan-ying1 , YU Bo-yang2 , H U ANG H u-i lian1 , SH AO Feng1 , REN Gang 1
( 1 Key Labo rato ry of M odern P reparation o f TCM , M inistry of Education, Jiangx i Univ ersity of T r aditional Chinese
M edicine, Nanchang 330004, China; 2 Department of Chinese Complex Recipe Research,
China Pharmaceutical Univer sity, Nanjing 210038, China)
Abstract: Objective T o study the relat ionship betw een H PLC fingerprint and its inhibit ion on O2 in
Cr ataegi Fol ium Methods The ef fect o f Crataegi Folium on scaveng ing superox ide anion w as taken as
the target H PLC Fingerprint peaks o f five species of Cr ataegi Fol ium w er e iso lated and used for the ef-
fect ive experiment The m athem atic models of the relat ion betw een the area and the ef fect of f ingerprint
peaks w ere established According to the m athem atic models, the H PLC fingerprint w as changed into bio-
activ e fingerprint ( include ef fect f ing erprint and potency fingerprint ) w ith the help o f mathem at ics, chemo-
m etrics, bioinfor mat ics, and computer sim ulat ion, etc Results The new evaluat ive pat tern fo r the quality
of Chinese materia m edica ( CMM ) w as established T he correlation coef f icient betw een expected value and
practical v alue w as 0 846 ( P< 0 05) T he expected values of five samples w er e all mo re than 70% of tho se
in the pract ical value Conclusion This evaluat iv e pattern is an al-l ar ound evaluat ive system , w hich in-
cludes not only chem ical ident ificat ion but also ef fective evaluat ion fo r CM M T his study has made up fo r
the def iciencies o f the cur rent evaluat ive pattern for the quality of CM M and has also provided a new idea
for modern study on CM M
Key words: Crataegi Fol iumi ; chrom ato gram-ef fect relat ionship; quality ev aluat iv e pat tern; bioact ive
fingerpr int ;
指纹图谱是一种综合的量化的鉴别手段, 改变
了传统质量标准以个别成分为指标来控制内在质量
的不完善性, 是目前国内外广泛接受的一种中药质
量评价模式。然而目前国内外对中药(或植物药)指
1173中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 7 期 2010 年 7 月
* 收稿日期: 2009- 09-23 基金项目:国家自然科学基金资助项目( 30472161) ;江西省自然科学基金资助项目( 0640163)作者简介:刘荣华( 1964 ) ,男,江西省永新县人,江西中医学院现代中药制剂教育部重点实验室中药质量控制方向带头人,教授,博士,硕士生导师,主要从事中药质量评价及中药活性物质基础研究。
T el: ( 0791) 7119010 Fax : ( 0791) 7118658 E-mail: rhl iu@ 163 com
纹图谱的研究还存在不完善之处,没有以药效作为
指纹性的依据。鉴于此, 本研究提出生物活性与化
学特征相关指纹的概念,以山楂叶为研究对象, 选
择其抗冠心病的主要临床作用, 以抗超氧阴离子为
生物活性评价指标, 将 H PLC 指纹图谱上的化学指
纹峰分别收集并进行活性研究,经过数学建模、生物
信息收集整理和计算机编程及模拟等手段, 将化学
指纹峰翻译成生物活性值, 建立中药的生物活性指
纹图谱,为中药谱效关系及中药现代化研究提供一
条新的思路。
1 材料
1 1 药材: 德国单子山楂 Crataegus monogyna
Jacq 叶, 山里红 C p innat if id a Bge var maj or
NEBr 叶,山楂 C p innat if ida Bge 叶,野山楂
C cuneata Sieb& Zucc 叶, 云南山楂 C scabri-
f ol ia ( Franch ) Rehd , 5 种样品均采于 2003年 5
月,并经笔者鉴定,凭证标本存于中国药科大学植物
标本室。
1 2 试剂: Diaion H P-20大孔吸附树脂(三菱化成工
业株式会社) , 3-氨基邻苯二甲酰肼(鲁米诺, Lum-i
nol, Sigma公司) , 色谱纯乙腈( Merck 公司) , 其余均
为国产分析纯或优级纯试剂,实验用水为重蒸水。
1 3 仪器: BPCL-1-G-C 微弱发光测量仪及 BPCL
App1 7 2数据处理工作站 (中国科学院北京生物
物理研究所) ; Agilent 1100型高效液相色谱仪(包
括 H P 工作站, G1312A 型二元泵, G1313A 型微量
全自动进样器, G1316A 型柱温箱, G1314A 型可变
波长检测器)。
2 方法
2 1 山楂叶药效模型的建立和药效评价指标的确
定:山楂叶对冠心病有良好的治疗作用 [ 1~ 4] ;心肌缺
血再灌激活血液与组织间的中性粒细胞( PM N) , 使
其耗氧量增加, 产生呼吸爆发, 同时激活辅酶
( NADPH )氧化酶,使 O2 立即被还原成超氧阴离子
( O2
)
[ 5, 6]。本实验针对山楂叶抗冠心病活性, 建立
微量、快速的体外抗氧自由基实验模型, 以抗 O 2
活性为评价指标。
2 2 山楂叶 H PLC 指纹图谱的建立: 山楂叶抗氧
自由基主要活性成分为多元酚类化合物 [ 7~ 9] , 本实
验主要针对该类成分进行指纹图谱分析。
2 2 1 色谱条件: 按文献方法[ 10] , L ichro spher
ODS C18柱( 250 mm 4 6 m m, 5 m) (南京汉邦科
技有限公司) ; 柱温 25 ; 体积流量 1 mL/ m in,进样
量 10 L,检测波长为 360 nm; 梯度洗脱,流动相 A
为乙腈-四氢呋喃( 95 5)、B 为 0 5%磷酸水溶液,
流动相梯度为 0~ 12 min A 由 12% ~ 17%、12~ 30
m in A 由 17% ~ 18%、30~ 45 min A 由 18% ~
40%、45~ 55 m in A 由 40% ~ 70%、55~ 60 min A
由 70%~ 100%。
2 2 2 样品溶液制备:分别取 5种山楂叶 5 g, 60
干燥 8 h(恒重)后粉碎成 60目粉末,各取 0 5 g 置于
10 mL 量瓶中,精密加入 50%甲醇 10 mL 称质量,超
声提取45 min,加50%甲醇补足至原质量,混匀,放置
澄清后用045 m 微孔滤膜滤取上清液。
2 3 指纹峰的收集:按文献方法[ 10] ,选取具有代表
性指纹峰的几种山楂叶 20 g 左右,用 50%甲醇回流
提取,上清液浓缩至无醇味, 上 Diaion H P-20大孔
吸附树脂柱, 先用水洗至无色,再用 60%乙醇洗至
无色,减压浓缩乙醇洗脱液至干, 得山楂叶总提取
物。分别取各山楂叶提取物100 mg, 用60%甲醇定
容于 1 m L 量瓶中。取上清液按以上 H PLC条件进
样,每次进样体积为 50 L, 根据几种山楂叶的指纹
叠加图谱,多次收集信噪比5的各共有峰和不同
种山楂叶的特有峰,减压除去有机溶剂,用固相萃取
柱萃取并用甲醇洗脱, H PLC检查纯度(归一法纯度
95%以上为合格) , 不纯的指纹峰更换 H PLC 条件
进行多次分离。各指纹峰纯度合格后甲醇定容到一
定体积,备用。
2 4 指纹峰的归属:筛选一内标物, 加入各样品中,
按以上色谱条件进行 H PLC 测定, 以指纹峰与内标
峰的相对保留时间( a)对各指纹峰进行匹配和归属。
2 5 山楂叶各指纹峰的药效筛选及峰效关系数学模
型的建立:各指纹峰甲醇溶液用于抗 O2 活性筛选,
对有活性的指纹峰甲醇溶液用甲醇按倍数( 1/ 2、1/ 4、
1/ 8、1/ 16、1/ 32、1/ 64)稀释并分别进行抗氧化实
验和 H PLC测其峰面积。建立抗氧化活性与 H PLC
峰面积之间的峰效关系,并建立数学模型。
2 6 山楂叶抗 O2 生物活性指纹图谱的建立
2 6 1 药效指纹图谱的建立:借助M icro sof t Visu-
al Basic 6 0编程软件将各指纹峰数学模型编入计
算机程序,再将各山楂叶 H PLC 指纹峰面积调入程
序进行运算, 计算出各指纹峰的药效值,通过计算机
模拟将各指纹峰药效值模拟成指纹图谱, 即为药效
指纹图谱。
2 6 2 效价指纹图谱的建立:选择一种抗氧化阳性
药,建立该阳性药的抗氧化量效关系数学模型, 编入
计算机程序, 将山楂叶各指纹峰的药效值导入程序
进行运算, 得到各药效指纹峰相当于阳性药的量
1174 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 7 期 2010 年 7 月
(g) , 以 1 g 阳性药的药效为一个效价单位, 算出
指纹峰相当于多少个效价单位,即效价值,用计算机
模拟将各指纹峰的效价值绘制成图谱, 即为效价指
纹图谱。
3 结果与讨论
3 1 药效模型与药效指标: 本实验要求药效指标要
精确、稳定、可量化。经大量实验筛选, 选用邻苯三
酚-鲁米诺-碳酸缓冲液( pH 102)体系产生 O2 [ 11]。
该体系的精密度较高, RSD值达 6 99% [ 11]。
3 2 山楂叶指纹图谱的建立与指纹峰的收集:根据
以上色谱条件, 分别对所有山楂叶指纹图谱进行分
析,以不遗漏谱峰为原则,选取了野山楂叶、山里红
叶、单子山楂叶和云南山楂叶这 4个种进行指纹峰
收集。对这 4种山楂叶指纹图谱进行叠加处理,信/
噪比5的峰为要收集的指纹峰,见图 1。针对性收
集了 39个指纹峰, 经过反复纯化,各指纹峰的纯度
均在 95%。
图 1 4 种山楂叶的指纹叠加图谱及信/噪比5的标记峰
Fig 1 Overlay of HPLC fingerprint of Crataegi Folium
f rom four species and marked peaks ( S/ N5)
3 3 山楂叶各指纹峰的归属及峰效关系数学模型:
39个指纹峰分别进行活性筛选, 其中 34个指纹峰
有活性。建立这 34个指纹峰峰效关系的数学模型
(表 1)。选择杨梅素( myricet in)为内标物(图 2) , 算
出各指纹峰的 a, a相对 tR 来说要稳定的多。本实
验所有指纹峰均以 a 进行归属, 以确保该研究的重
现性。
本研究收集的活性指纹峰最终均用甲醇定容到
1 m L, 为初始溶液。通过 H PLC 比较,初始溶液峰
面积是山楂叶样品常规分析时该对应峰面积的 100
倍以上。将初始溶液进行倍数逐步稀释至对自由基
清除率接近 0,所有活性指纹峰稀释后样本数量均
在 7个以上,然后进行曲线拟和, 从表 1 可见, 拟和
度 R2 0 994。对表 1各数学模型进行试验验证,
结果表明, 当指纹峰峰面积在线性范围内时, 与其相
应数学模型预测的自由基清除率非常接近。
3 4 山楂叶的药效指纹图谱: 各指纹峰的药效值见
表 2,药效指纹图谱见图 3( b)。该图谱是建立在
H PLC指纹图谱基础上的一种生物活性指纹图谱,因
而不仅具有H PLC指纹图谱的所有特征,而且还能反
映各指纹峰的药效,从而能更好地反映中药的质量。
3 5 山楂叶的效价指纹图谱: 药效指纹图谱不能完
全反映整体效果,整体药效并不等于各指纹峰药效之
和,因为峰效曲线是二次函数或三次函数(表 1)。因
此,选择芦丁( Rut in)为阳性药,其抗氧化量效关系数
学模型为: y = 1 108 57+ 4 357 44 x - 0 067 696
x
2+ 3 151 76 10- 4 x 3 [ x 为芦丁的量g, y 为抗O2
活性,用清除率( %)表示]。通过该模型求算各指纹
峰的效价值( potency) , 见表 2;计算机模拟山楂叶效
价指纹图谱,见图 3( c)。各指纹峰的效价值之和可反
映该山楂叶的总体活性(总效价) (表 2)。不同山楂叶
的总效价有所不同,表明抗氧化活性有差异。
表 1 山楂叶各指纹峰的峰效关系数学模型
Table 1 Mathematic models of relationship between area
and effect of fingerprint peaks of Crataegi Folium
峰号 a 数学模型 R2
1 0 184 3 y= 1 993 4+ 0 003 6x- 9 10- 8x 2 0 994
2 0 209 5 y= 0 999 7+ 0 010 3x- 4 10- 6x 2 + 7 9 10- 10 x3 1 000
3 0 222 0 y= 0 899 7+ 0 006 7x+ 6 4 10- 7x 2 - 4 10- 12 x3 1 000
4 0 244 9 y= 0 822 3+ 0 008 2x- 3 10- 6x 2 + 10- 9 x3 0 999
5 0 260 6 y= 1 421 4+ 0 005 2x+ 2 2 10- 6x 2 - 6 10- 10 x3 1 000
6 0 272 6 y= 3 789 1+ 0 006 0x- 1 10- 7x 2 0 998
7 0 280 2 y= 0 579 1+ 0 036 3x- 4 10- 5x 2 + 1 9 10- 8 x 3 0 999
8 0 324 1 y= 0 969 5+ 0 020 6x- 2 10- 5x 2 + 7 8x 10- 9 x 3 0 997
9 0 333 8 y= 2 207 3+ 0 014 0x- 2 10- 5x 2 0 999
10 0 351 6 y= 1 751 3+ 0 004 0x+ 5 9 10- 6x 2 - 2 10- 9 x 3 0 996
11 0 369 1 y= 1 541 3+ 0 008 7x- 6 10- 5x 2 + 7 10- 8 x 3 1 000
12 0 397 8 y= 1 241 2+ 0 007 2x+ 1 2 10- 6x 2 - 7 10- 10 x3 0 995
13 0 428 7 y= 1 313 4+ 0 014 3x+ 1 3 10- 5x 2 - 7 10- 9 x 3 1 000
14 0 446 5 y= 1 232 5+ 0 003 3x+ 8 0 10- 7x 2 - 10- 10x 3 1 000
15 0 461 8 y= 5 161 9+ 0 002 3x- 2 10- 8x 2 0 997
16 0 482 6 y= 1 145 3+ 0 009 6x+ 7 6 10- 7x 2 - 2 10- 10 x3 0 999
17 0 501 7 y= 2 590 2+ 0 007 1x- 2 10- 7x 2 0 996
18 0 543 1 y= 3 271 1+ 0 001 3x- 6 10- 9x 2 0 996
19 0 567 1 y= 2 065 8+ 0 008 7x- 6 10- 7x 2 1 000
20 0 600 4 y= 3 782 8+ 0 001 3x- 6 10- 9x 2 0 997
21 0 621 2 y= 1 507 5+ 0 003 3x- 10- 7 x 2 0 998
22 0 636 2 y= 2 681 2+ 0 001 3x- 5 10- 9x 2 0 999
23 0 669 7 y= 1 633 8+ 0 003 4x- 10- 7 x 2 0 997
24 0 695 5 y= 1 154 9+ 0 002 9x- 3 10- 8x 2 + 9 3 10- 14 x3 1 000
25 0 755 4 y= 4 593 8+ 0 005 0x- 7 10- 8x 2 0 996
26 0 790 7 y= 1 346 3+ 0 011 7x- 2 10- 6x 2 + 1 8 10- 10 x3 0 998
27 0 827 7 y= 1 622 1+ 0 004 1x+ 2 7 10- 6x 2 - 6 10- 10 x3 1 000
28 0 842 5 y= 1 613 4+ 0 007 2x- 4 10- 7x 2 + 1 3 10- 11 x3 1 000
30 0 882 9 y= 0 991 7+ 0 012 3x- 4 10- 7x 2 - 10- 10x 3 1 000
32 0 920 5 y= 2 228 3+ 0 000 7x+ 5 6 10- 6x 2 - 8 10- 10 x3 0 997
34 0 947 8 y= 4 792 6+ 0 001 8x- 10- 8 x 2 0 995
35 0 958 0 y= 3 076 9+ 0 020 0x- 2 10- 6x 2 + 5 4 10- 11 x3 0 999
37 1 000 0 内标
38 1 050 6 y= 0 832 7+ 0 000 6x- 3 10- 9x 2 1 000
40 1 113 2 y= 3 312 1+ 0 015 8x- 6 10- 7x 2 0 996
1175中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 7 期 2010 年 7 月
1-内标 2-样品加内标 3-样品
A-山楂叶 B-山里红叶 C-单子山楂叶 D-野山楂叶 E-云南山楂叶
1-internal s tandard 2-sam ple an d internal standard 3- sam ple
A-leaves of C p innat i f ida B-leaves of C pinnati f id a var maj or C-leaves of C monog yna
D-leaves of C cuneata E-leaves of C scabr if olia
图 2 5 种山楂叶与内标物的 HPLC对照图谱
Fig 2 HPLC Chromatograms in five species of Grataegi Folium and intenal standard
表 2 5 种山楂叶各指纹峰的药效和效价
Table 2 Effect and potency of fingerprint peaks from f ive species of Crataegi Folium
药效(自由基清除率) / %
S1 S2 S3 S4 S 5
效 价
S1 S2 S3 S4 S 5
0 184 3 2 377 5 2 405 2 11 945 9 2 502 8 0 292 5 0 299 0 2 590 1 0 321 6
0 209 5 8 652 5 1 780 1
0 222 0 9 271 3 1 930 7
0 244 9 1 765 1 4 995 8 0 151 0 0 904 8
0 260 6 1 723 7 5 229 9 0 141 5 0 960 1
0 272 6 8 318 2 10 751 4 87 510 4 5 452 4 11 851 9 1 699 1 2 293 8 40 564 8 1 012 7 2566 6
0 280 2 7 042 0 5 738 5 1 391 6 1 080 6
0 324 1 8 330 7 1 702 1
0 333 8 3 261 0 3 310 5 4 415 9 3 689 1 4 177 5 0 497 8 0 509 3 0 768 1 0 597 8 0712 2
0 351 6 2 273 1 2 289 2 10 693 9 2 519 4 0 268 4 0 272 1 2 279 7 0 325 4
0 369 1 1 888 3 1 869 6 0 179 4 0 175 1
0 397 8 2 079 8 8 531 7 0 223 7 1 750 8
0 428 7 2 884 6 2 747 3 16 096 4 5 085 2 0 410 2 0 378 3 3 642 2 0 925 9
0 446 5 3 859 4 1 682 2 0 637 6 0131 9
0 461 8 9 275 9 6 919 5 6 210 5 5 887 4 5 989 3 1 931 8 1 362 2 1 192 8 1 116 0 1140 2
0 482 6 5 539 8 2 348 8 1 033 4 01 285 9
01 501 7 71 385 3 41 661 2 31 908 4 11 474 0 01 825 9 01 649 1
01 543 1 61 449 4 71 806 2 31 782 4 31 371 5 31 678 1 11 249 8 11 575 3 01 619 6 01 523 6 01 595 2
01 567 1 71 912 7 31 165 7 41 908 1 11 601 0 01 475 6 01 884 0
01 600 4 161 067 4 111 431 7 111 926 4 71 192 8 31 634 7 21 462 2 21 585 2 11 427 7
01 621 2 31 165 4 01 475 5
01 636 2 21 848 8 31 483 6 61 206 5 51 536 4 01 329 5 01 549 7 11 191 9 11 032 6
01 669 7 31 053 1 21 707 6 21 000 9 21 627 7 01 449 4 01 369 1 01 205 4 01 350 5
01 695 5 21 508 7 21 097 7 21 132 3 01 322 9 01 227 8 01 235 8
01 755 4 91 045 5 51 515 8 51 027 0 111 452 8 11 875 7 11 027 8 01 912 1 21 467 4
01 790 7 61 974 8 31 924 3 111 910 4 21 608 6 61 152 5 11 375 5 01 652 8 21 581 2 01 346 1 11 179 0
01 827 7 11 969 9 21 880 2 01 198 3 01 409 2
01 842 5 81 533 9 11 751 3
01 882 9 21 308 8 31 088 7 51 590 1 41 803 2 01 276 6 01 457 7 11 045 4 01 859 3
01 920 5 21 340 3 21 434 3 01 283 9 01 305 7
01 947 8 61 164 8 191 339 5 11 182 0 41 490 6
01 958 0 51 520 2 11 028 8
11 000 0 内标 内标
11 050 6 11 159 6 01 011 7
11 113 2 41 290 0 71 921 1 01 738 5 11 603 1
总计 181 890 8 141 497 2 691 920 0 141 924 3 191 051 1
S 1-山里红叶, S2-山楂叶, S3-野山楂叶, S 4-单子山楂叶, S5-云南山楂叶
S 1-leaves of C1 pinnati f id a var1 maj or, S2- leaves of C1 p innat i f ida , S3- leaves of C1 cunea ta, S4- leaves of C1 monog yna,
S 5-leaves of C1 scabr if ol ia
#1176# 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 7 期 2010 年 7 月
a-H PLC指纹图谱 b-药效指纹图谱 c-效价指纹图谱
a-H PLC f ingerprint b- ef fect fingerprint c-poten cy f ingerprint
图 3 5 种山楂叶的生物活性指纹图谱
Fig1 3 Bioactive f ingerprint in f ive species of Grataegi Folium
31 6 实验结果分析
31 61 1 结果的可信度分析:将各山楂叶样品效价指
纹图谱的总效价值经芦丁量效关系数学模型换算成
抗 O2 A的总药效值; 再测出不同山楂叶的实际抗
O2
A活性。用 SPSS 软件对这两组数据进行相关性
分析, 根据相关系数判断该实验方法的可信度。结
果表明,两者成显著正相关,相关系数为 r= 01 846,
P< 01 05,见表 3。说明本实验结果可信度高。
31 61 2 方法的可行性分析:生物活性指纹图谱计算
出来的总药效值与实验测得的药效值的比值(贡献
率)可反映指纹峰选择的合理性和实验方法可行性。
结果表明, 5个样品的贡献率均在 70%以上(表 3)。
说明本实验建立的方法科学, 有一定实用价值和推
广意义。
表 3 生物指纹图谱的总效价、总药效、总贡献率以及实验
测定值
Table 3 Total potency, effect, percentage of bioactive
fingerprint and their practical results
样品 总效价计算值
总药效
计算值/ %
实际药效
实验值/ %
(贡献率计算
值/实验值) / %
山里红叶 181 29 601 37 701 87 851 18
山楂叶 141 50 511 34 691 75 731 61
野山楂叶 691 92 941 09 931 69 1001 40
单子山楂叶 141 92 521 42 611 42 851 35
云南山楂叶 191 05 611 99 861 26 711 86
4 中药质量评价新模式的建立
以山楂叶清除 O 2 A生物活性与 H PLC 特征相
关指纹图谱为例, 建立中药质量评价新模式。
41 1 品种亲缘关系鉴定: 生物活性与化学特征相关
指纹图谱(生物活性指纹图谱)是建立于 HPLC指纹
图谱的基础之上的,因此具有 HPLC指纹图谱相同的
功能和特性,将各山楂叶生物活性指纹图谱的药效指
纹或效价指纹代替 HPLC指纹峰面积,通过相似度分
析,同样可以对中药品种进行亲缘关系鉴定。
41 2 主要活性峰的确定:从图 2和表 2中可以清楚
地看到各指纹峰的活性大小, 从而找出每种山楂叶
样品的生物活性 8强峰。如山楂叶的生物活性 8强
峰 A 为 01 272 6, 01 280 2, 01 461 8, 01 543 1,
01 567 1, 01 600 4, 01 755 4, 01 790 7; 山里红叶的生
物活性 8 强峰 A 为 01 272 6, 01 461 8, 01 543 1,
01 600 4, 01 636 2, 01 755 4, 01 790 7, 11 113 2。从而
确定不同种山楂叶的抗 O2 A主要活性峰。
41 3 指纹峰活性强弱比较:通过比较指纹峰效积比
(指纹峰效价值/ H PLC峰面积)大小,可以衡量指纹
峰的活性强弱。经过对这 34个指纹峰的效积比进
行比较,从中找出了 8个活性最强(效积比最大)的
峰, A分别为 01 272 6, 01 333 8, 01 428 7, 01 461 8,
01 567 1, 01 755 4, 01 790 7, 11 113 2。需要说明的是
一个峰的效积比不是固定不变的, 而是遵循峰效关
系数学模型发生变化。然而,对某一个峰来说, 效积
比的变化也有一定的范围,这就为比较指纹峰的活
性强弱提供了可能。
#1177#中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 7 期 2010 年 7 月
41 4 种间、产地间及不同采收期生物活性比较: 罗文
等[ 12] 为有效控制山楂(果实)药材质量, 建立了 10批
山楂药材的 HPLC指纹图谱。在本实验中,比较不同
山楂叶效价指纹峰的总效价值,可以更客观地反映中
药的质量。如表 3所示,山楂叶、山里红叶、野山楂
叶、单子山楂叶和云南山楂叶的总效价值分析为
18129、141 50、691 92、141 92和 19105。说明其抗 O2 A
活性大小为:野山楂叶> 云南山楂叶> 山楂叶> 单子
山楂叶U 山里红叶,结果与实验测得结果一致。
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北柴胡皂苷生物合成途径关键酶 IPPI的全长 cDNA克隆及其序列分析
隋 春1 , 战晴晴1, 2 , 魏建和1* , 陈怀琼1 , 杨成民1 , 郑亭亭1
( 11 中国医学科学院 北京协和医学院药用植物研究所,北京 100193; 21 东北林业大学生命科学学院,
黑龙江 哈尔滨 150040)
摘 要: 目的 克隆北柴胡皂苷生物合成途径关键酶异戊烯基焦磷酸异构酶( EC 51 31 31 2, isopentenyl dipho sphate
isomerase, IPPI)的全长 cDNA ,为研究柴胡皂苷的生物合成与基因调控奠定基础。方法 PCR 矩阵法快速筛选北
柴胡全长 cDNA 文库。结果 获得了北柴胡 IPPI 的全长 cDNA( GenBank No1 gq433719) , 其核苷酸序列长 1 117
bp,编码 319 个氨基酸的蛋白。NCBI Blastx 结果显示与胡萝卜 Daucus car ota subsp1 sativus ( abb52064)的 IPP I
氨基酸序列相似性最高, 一致性为 92% , 相似度为 97%。保守结构域搜索显示含有 IPPI 共有的催化活性位点、金
属结合位点及 Nudix 基序。TargetP11 1和 SignalP31 0 分析表明北柴胡 IPP I N 端含有长 26 bp 的叶绿体信号肽。
结论 首次克隆了北柴胡 IPPI的全长 cDNA , 将促进后续北柴胡 IPP I基因表达特性及其在柴胡皂苷合成代谢中
功能的研究。
关键词:北柴胡; 柴胡皂苷;异戊烯基焦磷酸异构酶( IPP I) ; cDNA 文库; PCR 矩阵法
中图分类号: R2841 2 文献标识码: A 文章编号: 0253-2670( 2010) 07- 1178- 07
Ful-l length cDNA cloning and sequence analysis of isopentenyl diphosphate isomerase
involved in saikosaponin biosynthesis pathway of Bup leurum chinense
SU I Chun
1
, ZH AN Qing-qing
1, 2
, WEI Jian-he
1
, CH EN H ua-i qiong
1
,
YANG Cheng-m in1 , ZH ENG T ing- t ing 1
( 11 Institut e o f M edicinal P lant Development, Chinese Academy of M edical Sciences and Peking Union M edical College,
Beijing 100193, China; 21 Co llege of L ife Science, Nor theast For estr y Univ ersity , H arbin 150040, China)
#1178# 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 7 期 2010 年 7 月
* 收稿日期: 2009- 09-18 基金项目:国家科技支撑计划重点项目( 2006BAI09B01) ;中央级院所长科研基金项目( YZ-1-10)作者简介:隋 春( 1976 ) ) ,女,吉林敦化人,博士,主要从事药用植物次生代谢方面的研究。
* 通讯作者 魏建和 T el: ( 010) 62818841 E- mai l: w jian h@ 2631 net