全 文 ：3. 5
两年生移栽试管植株与种子植株皂苷量的比
较:由表 3可以看出,两年生北柴胡移栽试管植株的
根、茎叶中柴胡总皂苷及皂苷 a和 d的量均高于其同
类型的种子植株中的量,说明在北柴胡移栽试管植株
中皂苷的量较种子植株具有优势。移栽试管植株的
根为诱导产生的不定根(图 2-A) , 与种子植株具分枝
的直根(图 2-B)相比,多条直径基本相等的不定根有
效地提高了根中韧皮部与木质部面积的比值,从而提
高了柴胡皂苷的量,提高了单株根的产量和质量。
图 2
两年生陵川北柴胡移栽试管
植株( A)和种子植株( B)的根
Fig. 2
Root of biennial tes-t tube plants ( A) and seeding
plants (B) of Lingchuan B
chinense
4
结论
北柴胡移栽试管植株根的产量高, 根中各种皂
苷的量均高于质量标准, 亦高于同类型种子植株中
的量;茎叶中的皂苷的量与种子植株相当。此外, 试
管苗的年繁殖系数高、生长周期短 [ 1-2] , 移栽至田间
后表现出优良的植物学性状 [ 3]。因此, 离体快速繁
殖方法是选育优良北柴胡种质、提高药材产量和品
质的有效途径。


北柴胡移栽试管植株柴胡皂苷的动态变化规律
为试管苗期的量最低, 一年生植株的量高于两年生
的,营养生长期、花期、果期、枯萎期的量依次降低。
综合根和种子产量等因素,确定果期二级花序种子
成熟时期为根的适宜采收期。
北柴胡移栽试管植株具有良好的遗传稳定性。
选择综合性状优良、有效成分量高的种质作为起始
材料,能够从源头上保证后代具有优良的性状和药
材品质。
在北柴胡移栽试管植株的茎、叶中也含有柴胡
皂苷,其量与种子植株相当,故亦可全草入药。
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马比木的显微荧光组织学定位及其中喜树碱的变化研究
吕江明1 ,刘世彪2* ,蔡其辉2 ,田向荣2*
( 1
吉首大学医学院,湖南 吉首
416000; 2
吉首大学 植物资源保护与利用湖南省高校重点实验室, 湖南 吉首
416000)
摘
要:目的
对马比木 Nothap oty es p ittosp or oides 中的喜树碱进行组织学定位 ,并测定不同产地、不同生长季节
和不同部位的马比木中喜树碱的量。方法
采用荧光显微技术进行喜树碱的定位, 高效液相色谱法进行测定。
Hyper sil ODS2 色谱柱( 250 mm
4. 6 mm, 5
m) , 以乙腈-水( 6
4)为流动相梯度洗脱, 体积流量 1. 0 mL/ min, 柱
温20
, 检测波长 254 nm。结果
马比木中喜树碱主要积累于根部和茎部的韧皮部的分泌细胞内; 喜树碱的量具
有季节性变化规律, 夏季低, 春秋高; 细根中喜树碱的量最高, 主根次之, 主茎、幼茎及叶的量依次递减。结论
马比木喜树碱主要贮藏于根部树皮内,不同产地、不同季节、不同部位的马比木植物中的喜树碱量差异较大。
关键词:马比木; 喜树碱;组织定位
中图分类号: R282
6


文献标识码: A


文章编号: 0253-2670( 2010) 09-1530-05

1530
中草药
Chinese Traditional and Herbal Drugs
第 41 卷第 9 期 2010 年 9 月
* 收稿日期: 2009- 11-21





















基金项目:湖南省自然科学基金资助项目( 09JJ3051) ;湖南省生态学重点建设学科开放基金项目( J SS2009Z03)作者简介:吕江明( 1955
) ,男,湖南凤凰人,高级实验师,主要从事药物学研究。
T el: ( 0743) 8759168
E- mail : ljm5928@ 163. com
* 通讯作者
刘世彪
T el: ( 0743) 8564416
E- mail: liushibiao_1@ 163. com
Microscopic fluorescence histological localization and variation
of camptothecin in Nothapody tes p ittosporoides
LU



Jiang- ming 1 , LIU Sh-i biao2 , CAI Q-i hui2 , T IAN Xiang-r ong 2
( 1
Medical Colleg e o f Jishou U niversit y, Jishou 416000, China; 2
Key Laborato ry of P lant Resources
Conser vation and U tilization o f Hunan P rov ince, Jishou University, Jishou 416000, China)
Abstract: Objective
To conduct histolog ical lo calizat ion of camptothecin in Nothapody tes p it-
tosp oroides and determ ine the contents o f camptothecin in different parts o f the plant fr om dif ferent r eg ions
in different seasons
Methods
Histo logical localizat ion of camptothecin w as carried out by f luo rescence
micro scopy
H PLC method w as used to determine the contents
A Hypersil ODS2 co lumn ( 250 mm
4. 6
mm, 5
m) w as used as analyt ical co lumn
The mobile phase consisted of acetonit rile-w ater ( 6
4)
The
flow rate w as 1. 0 mL/ min and the column temperatur e w as 20

Detect ion w aveleng th w as at 254 nm

Results
T he camptothecin w as mainly accumulated in secretory cells in the phloem of roots and stems

The contents of camptothecin w ere seasonally changed w ith a low content in summer and higher contents in
spring and autumn
There w as the highest content of campto thecin in the f ine ro ots, the secondary content
in the main ro ots, and the contents in stems, young tw ig s, and leaves w ere decreased g radual ly
Conclu-
sion
T he camptothecin accumulates mainly in the ro ot bark, and the contents of camptothecin among dif-
ferent parts of N
p i ttosp or oid es f rom dif ferent regions in dif ferent seasons ar e great ly different

Key words: N othap od y tes p i ttosp oroides ( Oliv
) Sleum
; camptothecin; histochemical localizat ion


马比木 N othap ody tes p i ttosp oroides ( Oliv
)
Sleum
为茶茱萸科假柴龙树属植物,又名海桐假柴
龙树、海桐马比木、南紫花树、公黄珠子、追风伞, 湘
西苗族药物名
都溜咚
。入药能祛风除湿、理气散
寒,主治风寒湿痹、浮肿疝气等。假柴龙树属植物共
7种,中国分布有 6 种[ 1]。已有报道该属的臭味假
柴龙树(臭马比木) N
f oatida ( Wight ) Sleum
、青
脆枝 N
nimmoniana ( J
Graham) M abb
含有喜
树碱 [ 2] , 国外对这种植物中的喜树碱的提取工艺及
其在器官中的分布、植物组织培养和产喜树碱内生
菌等方面进行了很多研究 [ 3-7]。事实上,马比木植株
也含有喜树碱及喜树碱的甲氧基衍生物 [ 8-9]。喜树
碱具有显著的抗肿瘤活性, 目前人们主要是从喜树
中提取喜树碱及进行相关研究[ 10-12] ,但对于从马比
木植物中提取喜树碱及喜树碱在植物中的量变化规
律尚未见报道。本研究采用解剖学方法进行了马比
木喜树碱在植物组织中的荧光定位, 并用 HPLC 测
定了产于湖南湘西自治州 4个县市的不同季节和不
同部位的马比木中喜树碱的量, 以期为马比木研究
和开发提供理论依据。
1
材料与仪器
1. 1
材料: 2008 年采集分布于湖南省湘西州的凤
凰、吉首、永顺和古丈 4 个县市的野生马比木植株,
树龄 10~ 30年,经吉首大学植物教研室张代贵教授
鉴定为茶茱萸科假柴龙树属植物马比木 N
p i t-
tosp or oid es ( Oliv
) Sleum
。植株不同部位的分类
标准为,细根指直径 5 mm 及其以下的根,主根指根
部的主干部分,主茎指地面以上 5~ 10 cm 的主干部
位,幼茎指当年生幼嫩枝条部分,叶指顶芽以下 5~
10片的成熟叶。所有样品采集后于 80
烘箱中烘
干至恒重,粉碎过 60目筛, 于干燥器中保存备用。
1. 2
仪器与试剂: Leica CM1850冰冻切片机(上海
徕卡仪器有限公司) , 奥林巴斯荧光显微镜 B
51
(广州市明美科技有限公司 )。Shimadzu LC

10AT 泵, SPD
10A 紫外检测器; Rheodyne 7125
六通进样阀;浙江大学智能研究所 N3000色谱工作
站; FA
2004电子分析天平(上海天平仪器厂) ;
KQ
250E 型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限
公司)。乙醇为分析纯,乙腈(色谱纯)和水为二次重
蒸馏水。喜树碱对照品由中国药品生物制品检定所
提供(批号 100532-200401)。
2
方法与结果
2. 1
马比木喜树碱的显微荧光组织学定位
2. 1. 1
方法: 取不同部位的新鲜根、茎和叶, 用
Leica CM1850冰冻切片机切片, 切片厚度 20~ 30

m, 用奥林巴斯荧光显微镜 B
51, 观察切片的组
织结构特点,然后将同一视野在 360 nm UV光激发
下(该波长为喜树碱的荧光激发波长) , 荧光显微观
察各组织中的自发荧光并照相。
2. 1. 2
马比木组织中喜树碱的分布与定位:马比木

1531
中草药
Chinese Traditional and Herbal Drugs
第 41 卷第 9 期 2010 年 9 月
各部位荧光显微图见图 1。马比木的细根具有次生
结构,由外到内分别由次生保护组织周皮、皮层、次生
韧皮部、维管形成层和次生木质部组成。在维管形成
层的外侧,即次生韧皮部内有许多分泌细胞, 其内积
累有黑色的物质。在形成层刚分化出的数层次生木
质部内,也有少量分泌细胞积累黑色物质。马比木次
生韧皮部和次生木质部中分泌细胞内的黑色物质能
够发出蓝色荧光,表明这些物质就是喜树碱。而喜树
碱在皮层和周皮内没有分布,在靠内层的次生木质部
内也没有分布。马比木主根中的喜树碱分布也具有
相同的规律,只是其分泌细胞的数量相对较少。
马比木主茎由周皮、皮层、次生韧皮部、维管形
成层和次生木质部构成, 在次生韧皮部靠近形成层
的部位有较多的分泌细胞, 其内积累有黑色分泌物。
图 1显示,木质部内的分泌细胞主要分布于木射线
内。在荧光显微镜下, 黑色物质能发出蓝绿色荧光,
表明为喜树碱的分布部位。主茎中的其他部位的细
胞不产生自发荧光。马比木幼茎的结构及其内的喜
树碱分布也具有相同的规律,但分泌细胞的数量显
著减少。
1-马比木细根横切面( 200X)
2-马比木细根横切面的荧光图( 200X)
3-马比木主根横切面( 100X)
4-马比木主根横切面的荧光
图( 100X)
5-马比木主茎横切面( 200X)
6-马比木主茎横切面的荧光图( 200X)
7-马比木主茎横切面( 400X)
8-马比木主茎横
切面的荧光图( 400X)
9-马比木幼茎横切面( 400X)
10-马比木幼茎横切面的荧光图( 400X)
11-马比木叶横切面( 400X)
12-马
比木叶横切面的荧光图( 400X)
Af-自发荧光, Ca-维管形成层, Co-皮层, Pa-栅栏组织, Pe-周皮, Ph-韧皮部, Sc-分泌细胞, Sp-海绵
组织, Xy-木质部
1- cross sect ion of fin e root of N
p i tt osp oroides (200X)
2-f lu or escence im age of cros s sect ion of f ine root ( 200X)
3-cros s sect ion
of main root ( 100X)
4-fluores cen ce image of cross sect ion of main root ( 100X)
5-cross sect ion of m ain stem ( 200X)
6-f luores-
cence image of cross sect ion of m ain stem ( 200X)
7- cross s ect ion of m ain stem ( 400X)
8-fluores cen ce image of cros s sect ion of
main stem ( 400X)
9-cros s sect ion of young stem ( 400X)
10-fluores cen ce image of cross sect ion of you ng stem ( 400X)
11-cross
sect ion of leaf ( 400X)
12-f luorescence image of cr os s section of leaf ( 400X )
Af-au to f luorescence, Ca- cam bium, Co- cotex,
Pa-pailisade t issu e, Pe- periderm, Ph-ph loem, Sc-secretory cell , S p-sp on gy t issue, Xy-xylem
图 1
马比木不同部位的荧光显微图
Fig. 1
Fluorescence micrographs of different parts in N
p ittosporoides


马比木的叶由上、下表皮和叶肉组织构成,叶肉
组织分化为栅栏组织和海绵组织。在叶脉中有分泌
细胞的存在,紫外光激发下能自发荧光。
2. 2
喜树碱定量测定
2. 2. 1
色谱条件:色谱柱为 Hypersil ODS2 柱( 250
mm
4. 6 mm , 5
m) ;流动相为乙腈-水( 6
4) ; 进
样量 20
L; 检测波长 254 nm ; 灵敏度 0. 005
AUFS; 体积流量 1. 0 mL/ min;柱温 20
。该色谱
条件下喜树碱对照品和样品的色谱图见图 2。
2. 2. 2
对照品溶液的制备:精密称取喜树碱标准品
5. 00 mg, 置于 100 mL 量瓶中,加入 95%乙醇,超声
波助溶并定容至刻度, 摇匀, 制成 0. 2 mg/ mL 对照
品溶液,避光保存,备用。
2. 2. 3
供试品溶液的制备: 取样品粉末 5 g , 加入
65%乙醇50 mL,超声提取2次,每次 20 min。提取
液定容至 100 mL,摇匀,滤过,滤液置 100 mL 量瓶
中用于分析。
2. 2. 4
标准曲线的制备:精密吸取喜树碱对照品溶
液 2. 0、4. 0、6. 0、8. 0、10. 0、12. 0 mL 分别置于 10
mL 量瓶中, 用 95%的乙醇溶液分别稀释定容至刻
度,摇匀。按照上述色谱条件,分别吸取上述对照品
溶液20
L 注入高效液相色谱仪进行分析。实验重
复测定 3 次, 取峰面积的平均值。以喜树碱浓度
( X )为横坐标,以峰面积( Y)为纵坐标, 线性回归方
程为Y= 210 838 X+ 70 109, r= 0. 999 3,表明喜树
碱在 0. 8~ 4. 4
g 线性良好。
2. 2. 5
精密度试验: 精密吸取对照品溶液 20
L,
重复进样 5次,分别测定峰面积值,计算出喜树碱的

1532
中草药
Chinese Traditional and Herbal Drugs
第 41 卷第 9 期 2010 年 9 月
* 喜树碱
* camptothecin
图 2
对照品( A)和马比木样品( B)的 HPLC图谱
Fig. 2
HPLC Chromatograms of reference substance (A)
and N
pittosporoides sample (B)
RSD为 0. 02%。
2. 2. 6
重现性试验:取凤凰县万溶江 2月份采集的
样品共 5份,制备供试品溶液,在上述色谱条件下进
样测定,计算出喜树碱质量分数的 RSD为 0. 83%。
2. 2. 7
稳定性试验:取同一供试品溶液, 每 2 h 进
样一次,共测定 6次,每次 10
L,测定峰面积, 计算
得样品中喜树碱的 RSD为 1. 04% ( n= 6)。
2. 2. 8
加样回收率试验:精密称取于凤凰县万溶江
2月份采集的马比木样品粉末 5份,每份 4. 0 g, 分
别精密加入喜树碱对照品 0. 5 mg, 5份样品同时提
取,按上述供试品溶液制备,测定,计算得平均回收
率为 99. 96% , RSD为 1. 78%。
2. 2. 9
测定:精密称取不同产地、不同生长季节和
不同部位的样品粉末5 g ,制备供试品溶液,进样, 测
定色谱峰峰面积,根据标准曲线计算样品中的喜树
碱的量,结果见图 3、4。


图 3 显示, 在湘西的 4 个县 5 个产地中, 喜
树碱的量的变化具有季节性规律, 从早春至夏季,量逐
图 3
不同季节和不同产地马比木根中的喜树碱的量
Fig. 3
Contents of camptothecin in N
pittosporoides
in different seasons and regions
图 4
不同部位和不同产地马比木中喜树碱的量
Fig. 4
Contents of camptothecin in different parts
of N
pittosp oroides from different regions
渐降低, 到秋季以后又升高。凤凰县万溶江所产的
马比木中的喜树碱的量相对较高, 其 2 月份的量达
0. 53% , 4 月、6 月和 10 月的量分别为 0. 49%、
0. 21%和 0. 48%。古丈县所产马比木的喜树碱的
量在 2 月、4 月、6 月和 10 月分别为 0. 40%、
0. 39%、0. 26%和 0. 33%, 永顺县所产马比木的喜
树碱的量分别为 0. 31%、0. 25%、0. 10%和 0. 30%,
吉首的分别为 0. 35%、0. 20%、0. 24% 和 0. 29%。
在所测定的不同季节中, 均以 2 月 (冬春季)、4 月
(春季)和 10 月的量较高, 尤以 2月份最高( 4 地 5
个点平均为0. 392%) , 以 6 月份(夏季)的量最低( 4
地 5个点平均为 0. 184% )。


图 4表示,在马比木植株中,喜树碱的量最高的
为细根, 其次为主根, 主茎较低,幼茎和叶最低。在
凤凰万溶江、凤凰管刀溪、永顺杉木河、吉首德夯和
古丈三叉河地 5个产地中,马比木细根中的喜树碱
的量分别为 0. 50%、0. 47%、0. 26%、0. 37% 和
0. 40% , 主根中的喜树碱的量分别为 0. 49%、
0. 32%、0. 25%、0. 20%和0. 38% , 主茎中的量分别
为0. 07%、0. 14%、0. 08%、0. 02%和0. 13%。幼茎
和叶的量很低, 除吉首德夯分别为0. 04%和0. 03%
外, 其余各地的量只在 0. 007%~ 0. 019% , 平均
0. 010%。凤凰县所产的马比木中喜树碱的量较高
(平均 0. 203 4%) , 古丈县次之( 0. 185 8%) , 吉首为
0. 132% ,以永顺县最低( 0. 121 2% )。
3
讨论
喜树碱是重要的抗癌药物的药源物质, 刘文哲
等[ 1 3]曾报道过喜树碱在喜树幼枝中的积累及组织
定位,指出腺毛和分泌道是喜树幼枝积累喜树碱的
主要部位,分泌道主要分布于幼枝的髓部和靠近维
管束的皮层中, 喜树的根部没有分泌结构。本研究
表明,马比木中喜树碱的积累部位主要是在根部和
茎部中的韧皮部内的分泌细胞, 靠近形成层的木质

1533
中草药
Chinese Traditional and Herbal Drugs
第 41 卷第 9 期 2010 年 9 月
部射线内也有少数分泌细胞, 叶内的分泌细胞极少,
其余组织中没有喜树碱的积累, 即马比木喜树碱主
要积累于根部的树皮内。Fulzele[ 4] 测定了喜树碱
在臭马比木不同部位中的量, 其干燥树皮中的量为
0. 27%, 根为0. 156% , 茎为0. 07%, 叶的量最低为
0. 06%,未成熟种子中的喜树碱的量可达0. 32%, 是
成熟种子的两倍,其中子叶的量高达0. 42%。本研
究的结果显示马比木细根中的喜树碱最高可达
0. 53%,主根量次之, 主茎、幼茎和叶内的喜树碱量
依次递减,这种量的动态变化与臭马比木中根的喜
树碱量大于茎、茎大于叶的结果是一致的,但马比木
根中的喜树碱的量远高于臭马比木。同时, 量的多
少与马比木解剖结构中喜树碱分泌细胞的多少是相
符的,表明喜树碱主要积累于马比木的根部, 越向植
株顶端积累越少。马比木中喜树碱的量具有季节性
的变化规律,春季和秋冬季的喜树碱量较高, 夏季的
量较低,这可能与植物在夏季主要进行营养生长而
在秋冬季进行次生代谢物的贮藏有关。就湘西的 4
个县市来看,凤凰县的马比木含喜树碱较高, 这可能
与不同产地的气候条件和土质等生态因素有关。本
试验结果对今后马比木的人工种植选址及适时采收
具有积极的意义。
目前的喜树碱主要从喜树果实及叶中提取, 但
量较低, 如四川产喜树果实中喜树碱量最高为
0. 118%
[ 10]
, 福建产喜树果实中喜树碱的量最高为
0. 190% [ 11]。本研究表明, 马比木树根含有较高的
喜树碱,除 6月外(平均为0. 184%) ,其余季节的量
(最高月平均为0. 392% )均远远高于喜树果,这为喜
树碱植物药源的开发提供了新的途径。
致谢: 上海龙翔生物医药开发有限公司技术总
监高河勇博士的大力帮助。
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吴茱萸道地药材的高效液相指纹图谱研究
袁清照1 ,张水寒1* ,李顺祥1, 2* ,黄
丹1, 2 , 蔡
萍1*
( 1
湖南省中医药研究院 中药新药研究与开发重点实验室,湖南 长沙
410013;
2
湖南中医药大学 中药现代化实验室, 湖南 长沙
410208)
摘
要:目的
建立吴茱萸道地药材化学特征指纹图谱。方法
采用 H PLC 梯度洗脱法,对吴茱萸药材进行测定,
流动相为 0. 04%辛烷磺酸钠与 0. 05%磷酸的水溶液-乙腈, 检测波长 230 nm, 记录 80 min 的色谱。结果
运用梯
度洗脱能很好分离吴茱萸的各类成分,经方法学考察, H PLC 指纹图谱具有良好的重现性; 11 批样品中 21 个特征
指纹峰有专属性。结论
本研究建立的指纹图谱分析方法可用于吴茱萸药材质量的综合评价 , 也可用于道地
性考察。
关键词:吴茱萸; HPLC; 道地性;指纹图谱
中图分类号: R282
7


文献标识码: A


文章编号: 0253-2670( 2010) 09-1534-05

1534
中草药
Chinese Traditional and Herbal Drugs
第 41 卷第 9 期 2010 年 9 月
* 收稿日期: 2010- 01-05





















基金项目:科学技术部国家
十一五
科技支撑计划课题( 2006BAI09B02-9) ; 国家自然科学基金资助项目 ( 30973877) ;湖南省科学技术厅科技资助项目( 2008SK3087)作者简介:袁清照( 1982
) ,女,山西大同人,硕士研究生,从事中药新制剂与新工艺研究。
T el : (0731) 88881651
E-mail: qzyuan601@ 126. com
* 通讯作者
张水寒
E- mai l: zhangsh uihan0220@ 126. com李顺祥
E- mai l: lish unxg@ yahoo. com. cn