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Vol． 33 No． 10
1160 ～ 1164
分 析 试 验 室
Chinese Journal of Analysis Laboratory
2014 年 10 月
第 33 卷 第 10 期
收稿日期:2014-03-05
基金项目:四川省教育厅自然科学基金重点项目(12ZA079)和绵阳市科技局重点项目(13G002 － 2)资助
E-mail:luolaowu@ 126． com
DOI:10． 13595 / j． cnki． issn1000-0720． 2014． 0273
高速逆流色谱分离制备马比木中的
三个喜树碱类成分
罗娅君* 1，边清泉1，李绣菊2，杨葵华1，陈欣梦1，崔文化1
(1． 绵阳师范学院化学与化学工程学院，绵阳 621000;2． 重庆大学化学化工学院，重庆 400030)
摘 要:采用高速逆流色谱技术从马比木粗提物中快速分离制备喜树碱类化学
成分。通过高效液相色谱测定各溶剂系统的分配系数，获得较好的分离条件。
溶剂体系为:V(氯仿) :V(正己烷) :V(甲醇) :V(水)= 6:6:5:4，上相(水相)为
固定相，下相(有机相)为流动相，正相洗脱;进样质量浓度:2. 25 mg /mL;进样
体积:20 mL;流速:2. 0 mL /min;转速:800 r /min，从马比木粗提物中一次分离制
备出 3 种单体成分。其结构经 HPLC，UV，IＲ，ESI-MS 和 NMＲ 确认和分析，分
别为 10 －羟基脱氧喜树碱(1)、10 －甲氧基喜树碱(2)和喜树碱(3) ，纯度分别
为 98. 3%，99. 3%，99. 0%。
关键词:高效液相色谱;高速逆流色谱;马比木;喜树碱;分离;鉴定
中图分类号:O657. 7;O652. 6 文献标识码:A 文章编号:1000-0720(2014)10-1160-05
喜树碱(CPT)及其衍生物具有抗肿瘤，免疫抑
制，抗病毒等多种功效。由喜树碱和 10 －羟基喜
树碱为原料合成的伊立替康和拓扑替康已成为临
床治疗癌症的一线药物，用于治疗结肠癌、小细胞
肺癌、非小细胞肺癌和白血病等多种癌症［1］。喜
树碱类物质主要来源于中国特有树种，国家二级保
护植物喜树。而马比木是喜树碱药源的最佳替代
品。现代研究证明，马比木中含有多种喜树碱类物
质，且比喜树含量更高。
高速逆流色谱(HSCCC )是 Ito 发明的一种连
续高效的液 －液分配色谱分离技术［2，3］，是一种能
够在数小时内即可实现毫克级样品分离制备的方
法，具有无不可逆吸附，回收率高，进样量大等特
点［4，5］，目前在天然和人工合成产物的分离和纯化
方面得到了广泛的应用［6 ～ 11］。目前对马比木的研
究多限于喜树碱含量的测定，本文采用高效液相色
谱法快速、准确的测定了喜树碱及其衍生物在两相
溶剂体系中的分配系数，用 HSCCC 法对其进行进
一步分离，从中制备出 3 种高纯度的喜树碱类化
合物。
1 实验部分
1. 1 仪器与试剂
ＲE － 5203 旋转蒸发器 (上海亚荣生化仪器
厂) ，TBE －300A 高速逆流色谱仪(上海同田生物
技术公司) ，HX －1050 恒温循环器(北京博医康实
验仪器公司) ，8823B 紫外检测器(北京市宾达英
创科技公司) ，TBP －50A型恒压恒流泵(上海同田
生物技术公司) ，LC-6AD型高效液相色谱仪(日本
岛津公司) ，FTIＲ － 8400 傅里叶变换红外光谱仪
(日本岛津公司) ，Varian unity inova － 400 NMＲ
(美国 Varian 公司) ;ESQUIＲE － 3000 MS 质谱仪
(瑞士 Brucker 公司)。
CPT(实验室自制，经 HPLC 测定含量为
99. 6%) ，甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。
马比木根(采自贵州)。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 色谱条件［12］ 色谱柱为 PLAT ISILTMODS
(4. 6 mm × 250 mm，5 μm) ;流动相:V(甲醇) :
V(水)= 55:45;检测波长 254 nm;柱温 30 ℃;流速
0． 9 mL /min。紫外 200 ～ 400 nm 全波长检测。
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第 10 期 罗娅君等:高速逆流色谱分离制备马比木中的三个喜树碱类成分
1. 2. 2 样品制备 马比木根洗净、切块，粉碎，过
230μm 筛，备用。称取粉粹好的马比木粉末
33. 053 g于烧杯中，加入 200 mL甲醇，超声 1 h，重
复 3 次，合并滤液，减压浓缩，浸膏加少量水分散，
加氯仿萃取 3 次，合并氯仿层，浓缩，得到棕黄色粗
提物样品。
1. 2. 3 溶剂体系的选择 分别对氯仿 －甲醇 －
水、正己烷 －甲醇 －水、正己烷 －乙酸乙酯 －甲醇
－水、氯仿 －正己烷 －甲醇 －水不同体积比溶剂体
系进行计算，通过其上下相体积比差来选择
HSCCC溶剂体系。
1. 2. 4 分配系数的测定 配制 3 种不同比例的
经过初选的溶剂体系，静置平衡后取上下相，待用。
称取适量(约 10 mg)马比木粗提物于两只 20 mL
试管中，分别加入已达平衡的上、下相溶剂各
5 mL，超声振荡使样品充分溶解，静置平衡，上下
相各取 3 mL，离心，浓缩至干，用甲醇溶解后，经
HPLC 检测上相中化合物的峰面积为 A1，下相中化
合物的峰面积为 A2，分配系数 K = A1 /A2。
1. 2. 5 马比木粗提物的 HSCCC 分离 配制 1800
mL V(氯仿) :V(正己烷) :V(甲醇) :V(水)=
6∶ 6∶ 5∶ 4，1000 mL 分液漏斗充分振摇，静置分液，
取上下两相超声脱气 60 min，置于容量瓶中静置过
夜待用，上相为固定相，下相为流动相。
45 mg喜树碱粗提物，用 20 mL溶剂体系的流
动相(下相)超声溶解样品，溶解液作为样品溶液
备用。开机打开工作站，预热 45 min 后，以
15 mL /min的流速向 HSCCC 分离管中注入固定相
(上相) ，待固定相充满整个管路(约 20 min) ，调整
主机转速为 800 r /min(正转) ，以 2. 0 mL /min流速
注入流动相，待下相从柱出口流出，两相在分离管
中达到动态平衡后，由进样阀注入样品溶液，在
254 nm 波长下检测，记录 HSCCC 色谱图，根据色
谱图手动接收分离成分。
1. 2. 6 纯度分析及结构鉴定 采用 HPLC，根据
峰面积归一化法对制得的样品进行纯度分析。
HSCCC 分离得到的样品经 UV，IＲ，1H-NMＲ，
13C-NMＲ和 MS 等方法确定其结构。
2 结果与讨论
2. 1 喜树碱标样的色谱图
在上述色谱条件下，喜树碱的标准液相色谱图
和紫外光谱图如图 1。
图 1 喜树碱的 HPLC和 UV图
Fig． 1 HPLC chromatogram and UV spectrum of
camptothecin standard
以甲醇为溶剂，用二极管阵列检测器分析了对
照品的紫外光谱图，结果表明喜树碱最大吸收波长
分别为 368，254 和 218 nm，在 218 nm 波长处虽然
吸收最强，但是其他物质在此也有较大的吸收，将
干扰实验的测定，比较 254，368 nm 两处波长，在
254 nm处喜树碱的吸收更强。所以检测波长选择
为 254 nm。
2. 2 HSCCC溶剂体系的选择
4 种溶剂体系的筛选结果见表 1。由表 1 中可
看出正己烷 －甲醇 －水体系、正己烷 －乙酸乙酯 －
甲醇 －水(3:5:4:3)体系、氯仿 －正己烷 －甲醇 －
水上相与下相的体积差都较小，满足 HSCCC 溶剂
体系要求，不会造成溶剂浪费。其中氯仿 －甲醇 －
水体系的体积差相对较大;正己烷 －乙酸乙酯 －甲
醇 －水(3:5:4:3)体系具有乳化现象，不适应于
HSCCC溶剂体系要求。所以初步选择氯仿 －正己
烷 －甲醇 －水体系为 HSCCC 溶剂体系，通过分配
系数测定来进一步筛选。
2. 3 分配系数的测定
不同比例的氯仿 －正己烷 －甲醇 －水对分配
系数 K的影响见表 2。表 2 可看出喜树碱粗提物
在 V(氯仿) :V(正己烷) :V(甲醇) :V(水)=
6∶ 6∶ 5∶ 4和 3∶ 5 ∶ 5 ∶ 5 中，溶剂体系的分配系数在
0. 5 ～ 2. 0 之间。且其分配系数越接近于 1 越有良
好的分配性，因此目标样品在 V(氯仿) :V(正己
烷) :V(甲醇) :V(水)= 6∶ 6 ∶ 5 ∶ 4 体系中具有良好
的分配性，容易进行 HSCCC分离，且该比例上下相
体积差也较小。因此选择 V(氯仿) :V(正己烷) :
V(甲醇) :V(水)= 6∶ 6∶ 5∶ 4 溶剂体系为 HSCCC 的
分离溶剂体系。
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分 析 试 验 室 第 33 卷
表 1 各溶剂体系的体积差
Tab． 1 The volume difference of solvent system
溶剂体系
体积比
(V /V)
上相体积
(流动相)
下相体积
流动相
上、下相
体积比差
氯仿 －甲醇 －水
4:5:6
4:5:4
5:4:6
11． 2004
9． 2897
9． 8211
3． 7996
3． 7103
5． 1788
7． 4008
5． 5794
4． 6423
正己烷 －甲醇 －水
4:3:4
4:3:5
3． 9971
4． 0003
7． 0029
7． 9997
3． 0058
－ 3． 9994
正己烷 －乙酸乙酯 －甲醇 －水
3:3:5:3
3:5:4:3
3． 8728
6． 1797
10． 1272
8． 8201
－ 6． 2544
－ 2． 640
氯仿 －正己烷 －甲醇 －水
3:5:5:5
5:6:5:4
6:6:5:4
10． 312
9． 2087
9． 0763
7． 688
10． 7913
11． 9237
2． 624
－ 1． 5826
－ 2． 8474
表 2 分配系数测定结果
Tab． 2 Partition coefficients(K)values for the three com-
pounds in chloroform-n-hexane-methanol-water
体积比
分配系数
Ⅰ Ⅱ Ⅲ
3:5:5:5 1． 82 1． 21 1． 68
5:6:5:4 1． 05 2． 30 2． 66
6:6:5:4 1． 56 0． 96 1． 12
样品在 V(氯仿) :V(正己烷) :V(甲醇) :
V(水)=6:6:5:4的体系上下相中的 HPLC色谱分离
图如图 2，表明当样品采用 V(甲醇) :V(水)= 55:45
进行洗脱，流速为 0. 9 mL /min，检测波长为 254 nm，
柱温 30 ℃时，马比木粗提物可以得到良好的分离。
2. 4 马比木粗提物的 HSCCC分离结果
在 V(氯仿) :V(正己烷) :V(甲醇) :V(水)=
6:6:5:4 的体系中，经过甲醇处理的马比木粗提物
有好的分离效果，HSCCC 图见图 3。45 mg 粗提物
经一次分离得到化合物 1(6. 2 mg) ，化合物 2(7. 3
mg) ，化合物 3(10 mg)。
2. 5 纯度检验
经 HSCCC 分离所得 3 个峰通过 HPLC 检验
(图 4) ，面积归一化法确定化合物的 1 的纯度为
98. 3%，化合物 2 的纯度为 99. 3%，化合物 3 的纯
度为 99. 0%。其中峰 3 的保留时间和喜树碱标准
品一致，UV 图谱吸收峰一致，且有喜树碱特有的
蓝紫色荧光，初步鉴定为喜树碱。
〗2. 6 结构鉴定
化合物 1:黄色针晶(氯仿 －甲醇) ，mp:297 ～
299℃。HＲ-MS(+ C) :m/z 349. 2335(M + 1) ，
calcd:348. 3520。 IＲ(cm －1) :3480，2868，1740，
1654，1610，1590，1160，1042，830。UV － λ
(CH3OH) :220，254，348，368，384 nm。
1H NMＲ
图 2 HPLC色谱分离图
Fig． 2 HPLC chromatograms of Nothapodytes Pittosporoide extract in lower phase and upper phase
V(氯仿) :V(正己烷) :V(甲醇) :V(水)= 6:6:5:4;A:下相，B:上相
1 － 10 －羟基脱氧喜树碱;2 － 10 －甲氧基喜树碱;3 －喜树碱
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第 10 期 罗娅君等:高速逆流色谱分离制备马比木中的三个喜树碱类成分
图 3 马比木粗提物的分离后化合物的 HSCCS图
Fig． 3 HSCCC chromatograms of Nothapodytes Pittosporoide extract
1 － 10 －羟基脱氧喜树碱;2 － 10 －甲氧基喜树碱;3 －喜树碱
图 4 HSCC分离所得 3 个峰的 HPLC图
Fig． 4 HPLC chromatograms of three fractions obtained by HSCCC method
1 － 10 －羟基脱氧喜树碱;2 － 10 －甲氧基喜树碱;3 －喜树碱
(CDCl3，400MHz) δ:1. 03 (3H， t， J = 7. 2Hz，
H －18) ，1. 89(2H，m，J = 7. 2Hz，H － 19) ，3. 82
(1H，t，J = 7. 2Hz，20-H) ，5. 25(2H，s，5-H) ，
5. 29(1H，d，J = 16. 0Hz，17-H) ，5. 73(1H，d，J =
16. 0Hz，17-H) ，7. 08(1H，d，J = 2. 8Hz，9-H) ，
7. 54(1H，dd，J邻 = 9. 2Hz，J间 = 2. 8Hz，11-H) ，
7. 62 (1H，s，14-H) ，8. 14(1H，d，J = 9. 2Hz，
12-H) ，8. 45(1H，s，7-H)。上述数据与文献［13］报
道的 10 －羟基脱氧喜树碱数据一致，鉴定为 10 －
羟基脱氧喜树碱。
化合物 2:淡黄色结晶(氯仿 －甲醇)mp:246
－ 247℃。HＲ-MS(+ C) :m/z 379. 1287(M + 1) ，
calcd:378. 1216。 IＲ: 3408，2975，1766，1661，
1626，1602，1556，1507，1372，1240，1158，1049，
831。UV － λ(CH3OH) :225，265，295，314，329，
366 nm。1H NMＲ (CDCl3，400MHz)δ:1. 04(3H，t，
J = 7. 2Hz，H －18) ，1. 89 (2H，m，J = 7. 2Hz，
H －19) ，3. 98(3H，s，10-OCH3) ，5. 24(2H，s，
5-H) ，5. 28(1H，d，J = 16. 0Hz，17-H) ，5. 74(1H，
d，J = 16. 0Hz，17-H) ，6. 46(1H，s，20-OH) ，7. 15
(1H，d，J = 2. 8Hz，9-H) ，7. 50(1H，dd，J =
9. 2Hz，11-H) ，7. 61 (1H，s，14-H) ，8. 12(1H，
d，J = 9. 2Hz，12-H) ，8. 25(1H，s，7-H)。与化合
物 1 相比，20 位 H 没有，10 位多了一个 OCH3，以
上数据与文献［14，15］报道的 10 － 甲氧基喜树碱一
致，鉴定为 10 －甲氧基喜树碱。
化合物 3:淡黄色针晶(甲醇)。mp. 264 －
265℃，HＲ-MS(+ C) :m/z 349. 1191(M + 1) ，
calcd:348. 1110。 IＲ:3439，3298，2938，2886，
1740，1653，1560，1500，1436，1197，1040，827，
789。UV － λ (CH3OH) :218， 254， 368 nm。
1H NMＲ (CDCl3，400MHz) δ:1. 04 (3， t，J =
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分 析 试 验 室 第 33 卷
7. 2Hz，H － 18) ，1. 87(2H，m，J = 7. 2Hz，H －
19) ，5. 28(2H，s，H －5) ，5. 44(2H，s，H －17) ，
6. 54(1H，s，20-OH) ，7. 35(1H，s，H －14) ，7. 71
(1H，t，J = 7. 2Hz，H － 10) ，7. 87(1H，t，J =
8. 4Hz，H －11) ，8. 13(1H，d，J = 8. 1Hz，H －9) ，
8. 17(1H，d，J = 8. 4Hz，H － 12) ，8. 69(1H，s，
H －7)。以上数据同文献［16，17］报道的喜树碱一致，
鉴定为喜树碱。
3 结论
本文首次利用高效液相色谱结合高速逆流色谱
法对马比木的化学成分进行了分离，一次性从马比
木中分离得到了 3 种喜树碱类化合物，其结构分别
利用高效液相色谱、紫外光谱、红外光谱和核磁共振
谱进行了确认和分析。与常规的柱层析方法相比，
本文建立的 HSCCC 分离喜树碱及其衍生物成分的
方法具有高效、快速、制备量大等优点，能在短时间
内得到高纯度、高得率的产品，适合于马比木以及中
药有效成分的分离提取、单体的制备及鉴定。本方
法具有较好的实际应用价值，可以为马比木喜树碱
及其衍生物对照品的制备提供方法借鉴，为马比木
的进一步药理药效研究及新药开发奠定了基础。
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Separation preparation of three camptothecins from Nothapodytes Pittosporoides by high-speed counter-
current chromatography
LUO Ya-jun* 1，BIAN Qing-quan1，LI Xiu-ju2， YANG Kui-hua1， CHEN Xin-meng1 and CUI Wen-hua1
(1． Chemistry ＆ Chemical Engineering College，Mianyang Normal University，Mianyang 621000;2． School of
Chemistry and Chemical Engineering，Chongqing University，Chongqing 400030) ，Fenxi Shiyanshi，2014，
33(10) :1160 ～ 1164
Abstract:The chemical compositions of Nothapodytes Pittosporoides(Oliv．) sleum crude extract were high
performance separated and prepared using high-speed counter-current chromatography (HSCCC)． The good
separation condition was gained by determining the partition coefficient of every solvent system． The two-phase
solvent system is composed of chloroform －(n-hexane)-methanol-water (6∶ 6∶ 5∶ 4，V /V) ，the upper phase is the
stationary phase，the lower phase is the mobile phase by normal phase elution． The sample concentration is 2. 25
mg /mL，sampling volume is 20 mL，flow rate is 2. 0 mL /min，and the apparatus rotated forwardly is 800 r /min．
Three compounds from Nothapodytes Pittosporoides(Oliv．)sleum crude extract were separated and prepared in a
simultaneous process，and their structures were analysed and identified as 10-hydroxy-deoxycamptothecin(1) ，
10-methoxy camptothecin(2) ，camptothecin(3)by HPLC，UV，IＲ，ESI-MS and NMＲ，respectively． The purities
of the three compounds are 98. 3%，99. 3% and 99. 0% by HPLC，respectively． HSCCC is a simple，rapid method
to prepare and purify the active constituents from the Nothapodytes Pittosporoides．
Keywords: High-speed counter-current chromatography; Nothapodytes Pittosporoides (Oliv．) sleum;
Camptothecin;Separation;Identification
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