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Difference in effect between asthma-based mouse model and Stemona tuberosa extracts

基于哮喘小鼠模型研究生、制百部醇提物作用差异



全 文 :基于哮喘小鼠模型研究生、制百部醇提物作用差异
陈晓霞1,3,张晓丹1,李红艳1,贾天柱1,2,杨静娴1
(1辽宁中医药大学,辽宁 大连 116600;2国家中医药管理局中药炮制重点研究室,
辽宁 大连 116600;3辽宁省中药炮制工程技术研究中心,辽宁 大连 116600)
  [摘要] 该文以OVA激发小鼠哮喘为模型,分别口服灌胃给予不同浓度生、制百部醇提取物,测定其脾细胞中 Th1及
Th2释放的细胞因子,采用RTPCR技术测定实验小鼠肺组织中GATA3及Tbet基因表达,比较生、制百部醇提取物治疗小鼠
哮喘作用的差异性。结果发现与生品比较,制品给药后更能上调哮喘小鼠脾细胞中炎症因子IFNγ(P<005)及下调IL5(P
<005);RTPCR结果发现制品给药后更能上调Tbet/GATA3(P<005)表达。该实验表明生、制百部醇提取物均通过调节
Th1/Th2比例治疗哮喘,但制品作用更为显著,说明百部炮制前后其药效学上存在显著差异,因此临床治疗哮喘及慢性咳嗽时
以制品入药更合理,为进一步揭示百部炮制原理奠定基础。
[关键词] 生、制百部;哮喘;细胞因子;GATA3;TBet
[收稿日期] 20130418
[基金项目] 2010,2011年中医药行业科研专项(201107007)
[通信作者] 贾天柱,教授,博士生导师,主要从事中药炮制学研
究,Tel:(0411)87586011,Fax:(0411)87586078,Email:jiatz@
lnutcmeducn
  百部为止咳杀虫类药物,《千金方》记载“谓一
味取汁浓煎,可愈三十年嗽,有自来矣”。
这些记载提示百部尤其擅长治疗久咳不愈。现
代医学对于慢性咳嗽机制进行了深入研究,认为慢
性咳嗽很大一部分归咎于变异性哮喘(CVA)[12]。
中医传统著述中没有与 CVA完全相对应的病名记
载,众医家大多将其分属于“咳嗽”、“风咳”、“肺
痹”、“肺痉”、“百日咳”、“咽源性咳嗽”等不同疾病
范畴[3]。现代医学研究认为,百日咳属于咳嗽变异
性哮喘,百部古代及现代一直是治疗小儿百日咳的
要药,查阅古典文献百部治疗咳嗽中主要以制百部
入药,现代研究中发现蜜制百部水煎液止咳作用强
于生百部[4],但是目前作者对全国多家医院、药店
进行调查,发现很多医生、药师在使用百部或以百部
付方时存在生、制不分的现象。本课题组前期实验
研究也表明蜜制百部水提液及总生物碱部位止咳作
用显著强于生百部,其中总生物碱止咳活性最
强[5],而醇提物中总生物碱溶出率强于其在水煎液
中的溶出率,因此本实验选择以生、制百部醇提物作
为研究对象,首次采用小鼠哮喘模型来考察其止咳
作用差异性及其可能的作用机制,以期为传统中医
理论提供现代医学证明,为百部临床使用发挥最佳
功效提供一定的指导,为进一步规范百部生熟应用
提供支持,为今后进一步深入研究百部总生物碱止
咳作用奠定基础。
1 材料
FW100型粉碎机;AS31100A超声波清洗仪(上海
亚荣);RE52旋转蒸发仪(上海亚荣);超声喷雾加湿
器(上海美的);RaytoRT6000酶标仪(深圳雷杜);细
胞XZI显微镜(日本Olympus);BX50生物系统显微镜
(日本Olympus);凝胶电泳仪(美国FisherBiotech)。
刀豆球蛋白 A(ConA)、鸡卵白蛋白 (OVA)、
RPMI1640培养液、小牛血清(FBS)、青链霉素、琼
脂、溴化乙啶均购于 Sigma公司;IL2,IL4,IL5,IL
13,IFNγ酶联免疫试剂购于 R&D公司;Trizol购于
Invitrogen公司;RT及 PCR试剂盒购于 Thermo公
司;所有引物均由北京赛百盛科技公司合成;其他化
学试剂(天津科密欧)为分析纯。湖北产百部购于
安徽药材市场,经辽宁中医药大学翟延君教授鉴定
为对叶百部。
BALB/c小鼠购于大连医科大学动物室,合格
证号SCXK(辽)20080002。
2 方法与结果
21 实验药品制备 百部制品制备:按照本实验室
前期优化选择的百部蜜制工艺进行炮制。取生百部
片100g加入225g蜜水(125g蜜,10g水)闷润
3h,置预热的锅内,以140℃翻炒6min,放凉备用。
分别取百部生品及制品粉碎过20目筛,以95%乙
醇浸泡3d,过滤继续浸泡3d,合并滤液,45℃旋蒸
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至浸膏,存储于4℃冰箱中,用时以水溶解配置成含
生药20,10,05g·mL-1的混悬液口服给药。致
敏液配制:称取OVA20mg,加入生理盐水1mL中,
充分溶解后,取出04mL加入生理盐水96mL中,
混匀,取该液与等体积的佐剂液态铝混合,40℃放
置30min后使用。
22 动物分组 80只BABL/c小鼠共分为8组,每
组10只,分别为 PBS空白对照组,OVA空白对照
组,生百部醇提物高、中、低剂量组,蜜制百部醇提物
高、中、低剂量组。
23 哮喘模型建立及给药 采用系统致敏加局部
激发的方法制作哮喘模型[6],见图1。
图1 哮喘小鼠模型建立及给药示意图
Fig1 Scheduleofmousemodelofairwayinflammationand
treatmentwithextration
24 脾细胞制备 小鼠处死,无菌条件下取其脾
脏,细胞滤网滤过,于表面皿加入红细胞裂解液为细
胞滤液的3~5倍,装入 EP管中,室温震荡5min,
4℃离心机1200×g离心10min,弃去上清,以培养
液洗沉淀后1200×g离心10min。最后向沉淀加
入RPIM1640培养液。
25 ELISA试剂盒测定 将脾细胞浓度调整为
1×107个/mL,接种于24孔板,于37℃,5%CO2的
无菌条件下培养48h,加入 ConA(终浓度为5g·
L-1),同时设空白组,继续培养 48h,取上清液置
-80℃冰箱保存待用。IL2,IL4,IL5,IL13,IFNγ
ELISA试剂盒的测定按照试剂盒说明进行。实验结
果表明,OVA激发的哮喘组中Th1细胞因子IFNγ及
IL2较PBS组均降低,给药组上调这些细胞因子。与
生品比较,制品具有更强的上调IFNγ能力;哮喘组
中Th2细胞释放的 IL4,IL5,IL13均较 PBS组中
的有显著的增加,而生、制醇提物均能下调其释放量,
但对IL4的下调除了中剂量外其他均没有显著性差
异;生、制品对IL13有显著性的下调,其中制品的高剂
量下调能力较生品强;生、制品中、高剂量对IL5显著
的下调,且制品均较生品更为显著,见图2。
1PBS空白对照组;2哮喘模型组;3~5生品低、中、高对照组;6~
8制品低、中、高剂量组。生、制高、中、低为分别给予生品或制品醇
提物高、中、低剂量组。与空白组相比,1)P<005,2)P<001;与Co
nA组相比,3)P<005,4)P<001;与同浓度的生品和制品比较,
5)P<005,6)P<001(图4同)。
图2 不同浓度生、制品醇提物对哮喘小鼠脾细胞因子影响
Fig2 Efectofethanolextractfromcrudeandprocessedste
monatuberosawithdiferentconcentrationsoncytokinelevelsin
STtreatedmicesplenocytes
26 总 RNA提取 取实验小鼠肺组织样品按
50~100g·L-1加入 Trizol,按照说明书提取总
RNA。
27  一步法 RTPCR  引 物 βActin:Forword
5′TGCTGTCCCTGTATGCCTCT3′;Reverse5′TTTGAT
GTCACGCACGATTT3′;GATA3:Forword5′AGGGC
TACGGTGCAGAGGTA3′;Reverse 5′CGGAGGGTA
AACGGACAGAG3′;Tbet:Forword5′CCCATTCCTGTC
CTTCACCG3′;Reverse 5′CATGCTGCCTTCTGCCTT
TC3′。
上述引物及 RNA按照 RTPCR一步法试剂盒
进行操作,合成 DNA,取合成的 DNA2μL进行
15%琼脂凝胶电泳分析。
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GATA3,TbetDNA电泳图见图3,其中 βactin
为内参,对电泳图进行 IOD/面积统计,结果见图4。
哮喘组的GATA3表达显著高于正常组,给药组较哮
喘组均有显著的下调,制品较生品下调更显著,哮喘组
的Tbet表达显著低于正常组,给药组较哮喘组均有显
著的上调,制品较生品上调更显著。本实验对Tbet/
GATA3进行了数据统计,哮喘组较PBS正常组显著
低,给药组均能上调该比值,制品上调显著强于生品。
图3 βactin,GATA3,TbetPCR电泳图
Fig3 RTPCRanalysisofβactin,GATA3andTbet
3 讨论
研究发现在豚鼠的体外实验中直立百部的水提
液对豚鼠的支气管平滑肌有解痉作用,说明百部水
煎液具有平喘作用。哮喘产生的机制十分复杂,平
喘类中药治疗哮喘主要通过抗炎、抗变态反应,解除
支气管痉挛及免疫调节机制实现[7]。功能改变、紊
乱为基础,细胞因子在调节免疫功能,促发哮喘发病起
中心作用,免疫球蛋白IgE和IgG4既是免疫功能紊乱
的结果,也是促发哮喘异常反应的原因,近年来多项研
究显示哮喘病人Th1/Th2比值较正常人低下,因此纠
正Th1/Th2比值失衡有利于哮喘的治疗[8]。
Th1细胞释放的细胞因子主要有 IL2,IL12,
IFNγ,IL1,TNF等,介导细胞免疫和炎症反应,其
中IFNγ可促进Th1细胞分化,抑制Th2反应[9],可
通过诱导 NO的合成气道平滑肌对异丙肾上腺素
(ISO)敏感性对抗炎症细胞因子[10],在哮喘病中是
一种主要的 Th1细胞因子。Th2产生的 IL4,IL5
被认为是关键的细胞因子[11]在哮喘发病过程中其
表达是上调的[12]。Th1和 Th2的分化方向受其特
异的基因序列调控,有多种转录因子参与 Th1/Th2
的分化以及IL4,IFNγ的表达,其中 GATA结合蛋
白3(GATAbindingprotein3,GATA3)特异性表达
于Th2细胞,促进Th0细胞向 Th2细胞分化并正调
控Th2细胞因子的表达。Tbet蛋白特异性表达于
Th1细胞,促进 Th0细胞向 Th1细胞分化并正调控
Th1细胞因子的表达。
图4 哮喘组及给药组小鼠肺组织中 GATA3(A),Tbet
(B)及Tbet/GATA3(C)基因表达
Fig4 GATA3(A),Tbet(B)andTbet/GATA3(C)mR
NAexpressioninthelungofOVAinitiatedandtreatedmice
  百部为传统中药,常用来入药治疗咳嗽、支气管
炎、哮喘等病。传统中医中主治咳嗽入药时多以制
品入药,但是目前,市售百部常常存在生制不分的情
况,甚至很多药店不知道有生、制2种品种。本课题
组前期研究表明制品百部止咳作用要显著强于生
品,本实验则以 OVA诱导小鼠哮喘模型来研究生、
制百部醇提物对其中脾细胞释放的细胞因子的影
响,及对其中参与调控 Th1,Th2的 GATA3及 Tbet
基因表达的影响。生、制品治疗作用比较,制品更能
够显著上调IFNγ表达及显著下调 IL5表达;对肺
组织中Tbet/GATA3测定结果表明,制百部醇提物
更能上调Tbet表达,下调 GATA3表达,调节 Th1/
Th2比例,达到治疗哮喘的作用,制品治疗作用更显
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著。这就进一步证明百部进行治疗咳嗽及其相关病
症时当以制品入药。
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Diferenceinefectbetweenasthmabasedmouse
modelandStemonatuberosaextracts
CHENXiaoxia1,3,ZHANGXiaodan1,LIHongyan1,JIATianzhu1,2,YANGJingxian1
(1LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine,Dalian116600,China;
2KeyLaboratoryofTraditionalChineseMedicineProcesingTechnologyandPrincipleunderState
AdministrationofTraditionalChineseMedicine,Dalian116600,China;
3LiaoningResearchCenterforTraditionalChineseMedicineProcesingTechnology,Dalian116600,China)
[Abstract] Inthisstudy,OVAinducedasthmamicewastakenasthemodel,andoralyadministeredwithdiferentconcentra
tionofethanolextractsofcrudeandprocessedStemonatuberosa,inordertodeterminethecytokinelevelreleasedfromTh1andTh2in
splenocytesRTPCRwascariedouttodeterminethegeneticexpressionofTbet/GATA3inlung,andcomparethediferentiationbe
tweenethanolextractsofcrudeandprocessedStuberosaintherapeuticefectonasthmainmiceAccordingtotheresults,compared
withthecrudesamples,processedsamplessignificantlyincreasedthelevelsofinflammatoryfactorINFγ(P<005)anddecreasedIL
5(P<005)insplenocytesAccordingtotheRTPCRresults,theadministrationofprocessedsamplescouldincreasetheratioof
Tbet/GATA3(P<005)TheexperimentshowedthatethanolextractsofbothcrudeandprocessedStuberosacouldtreatasthmaby
regulatingTh1/Th2ratio,butprocessedsamplesshowedmorenotableefectThisindicatedthatcrudeandprocessedStuberosahad
significantpharmacologicaldiferenceTherefore,itwasmorerationaltoapplyprocessedStuberosainclinicaltreatmentofasthma
andchroniccough,whichlayedafoundationforfurtherrevealingtheprocessingmechanismofStuberosa
[Keywords] crudeandprocessedStemonatuberosa;asthma;cytokine;GATA3;TBet
doi:10.4268/cjcmm20132319
[责任编辑 曹阳阳]
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第38卷第23期
2013年12月
                             
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December,2013