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Absorption and metabolism of flavonoids in Herba Epimedii via rat intestinal perfusion model

大鼠在体肠灌流模型研究淫羊藿不同黄酮苷的吸收代谢



全 文 :大鼠在体肠灌流模型研究淫羊藿不同黄酮苷的
吸收代谢
陈彦1,贾晓斌1,谭晓斌1,范晨怡1,HuMing2
(1.江苏省中医药研究院 江苏省现代中药制剂工程技术研究中心,江苏 南京 210028;
2.UniversityofHouston,Houston77030,USA)
[摘要] 目的:研究淫羊藿5个黄酮苷淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、宝藿苷Ⅰ在大鼠肠道的在体吸收情况。
方法:应用大鼠在体肠灌流模型,用高效液相法测定肠灌流液中淫羊藿各黄酮苷的含量,计算各黄酮苷的肠渗透系数。结果:5
个黄酮苷在大鼠各肠段的表观渗透系数按十二指肠、空肠、回肠、结肠顺序依次分别为淫羊藿苷:6365,5349,1004,0601;
朝藿定A分别为4120,3397,0401,0257;朝藿定 B分别为:3645,3135,0990,0434;朝藿定 C分别为:3114,2882,
0688,0470;宝藿苷Ⅰ分别为2324,2398,1529,1045。淫羊藿苷在大鼠肠道会被水解产生2个代谢产物,朝藿定 A,B,C
各自会被水解产生1个代谢产物,宝藿苷Ⅰ无代谢产物。结论:5个黄酮成分在大鼠肠段不同部位吸收存在差异,各化合物的
回肠和结肠肠段表观渗透系数均显著低于十二指肠和空肠肠段,淫羊藿苷,朝藿定A,B,C的肠道代谢产物与其结构与肠黏膜
上的酶相关,并且在十二指肠、空肠代谢较多;在回肠、结肠代谢较少。
[关键词] 淫羊藿黄酮苷;大鼠在体肠灌流模型;吸收;代谢;渗透系数
[收稿日期] 20090410
[基金项目] 国家自然科学基金项目(30572372,30973944)
[通信作者] 贾晓斌,Tel:(025)85608672,Email:jxiaobin2005@
hotmail.com
[作者简介] 陈彦,副研究员,硕士生导师,博士,主要从事中药制
剂学研究,Tel:(025)85608672,Email:ychen202@yahoo.com.cn
  中药淫羊藿含有一类结构较特殊的黄酮苷,它
们在母核的8位上都有异戊烯基取代,主要代表性
成分有淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定 B、朝藿定 C、宝
藿苷Ⅰ等(图1)。文献报道[12]淫羊藿黄酮苷对心
脑血管系统、骨代谢、免疫系统及性机能等方面具有
广泛的药理功效,但药物动力学研究表明,此类成分
的生物利用度较低[3],口服吸收情况较差。作者曾
应用Caco2细胞模型从体外对淫羊藿黄酮苷的吸
收转运机制进行了探讨[45],结果表明淫羊藿苷、朝
藿定A、朝藿定 B、朝藿定 C的吸收渗透系数(PAB
值)都较小,说明这类成分的肠道吸收较差,原因可
能是存在肠道转运蛋白的外排机制,并且单糖苷
(宝藿苷Ⅰ)的吸收大于二糖苷(淫羊藿苷),二糖苷
的吸收大于三糖苷(朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C)
的吸收。本研究将应用大鼠在体肠灌流模型对淫羊
藿黄酮苷的在体吸收代谢的方式进一步深入探讨,
以全面阐释淫羊藿黄酮苷的吸收代谢情况。
图1 淫羊藿5个黄酮苷的化学结构图
1 材料
1.1 动物
雄性SD大鼠150~170d,体重250~300g,由
中国科学院上海实验动物中心提供,动物许可证号
SCXK(沪)20020010。
1.2 药物、试剂
淫羊藿苷(批号110737200312,供含量测定用)
购自中国药品生物制品检定所,朝藿定A、朝藿定B、
朝藿定C、宝藿苷Ⅰ由江苏省中医药研究院中药制剂
研究室提供,纯度经归一化法测定均大于98%。睾
丸酮(浙江仙居县化工药剂厂,批号060711513,纯
度>98%)。氯化钙(上海市奉贤奉城试剂厂,批号
060427);硫酸镁,氯化钾(无锡市民丰试剂厂,批号
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051107,060318);磷酸二氢钾,磷酸氢二钠(南京化学
试剂一厂,批号06081587,06055015);葡萄糖(河北葡
萄糖厂,批号060603);碳酸氢钠(南京化学试剂有限
公司,批号060310177);HEPES(北京拜尔迪生物公
司,批号060811571);乙腈,冰醋酸(色谱纯,Merck),
其他试剂均为分析纯。
1.3 仪器
Agilent1100高效液相色谱仪,四元泵,DAD检测
器(Agilent科技公司,美国);METTLERTOLEDO分
析天平,(METTLERTOLEDO分析仪器有限公司);
Anke离心机 TGL16G,(上海安亭科学仪器厂);数显
恒温搅拌循环水箱 HH60(常州国华仪器厂);恒流
泵 PHD2000Infuse/withdrawpump(HarvardAppara
tusInc.美国)。
2 方法与结果
2.1 药物配制
HBSS溶液的配制:精密称取 NaHCO3037g,
HEPES596g,Dglucose45g,CaCl2·2H2O0185
g,MgSO401g,KCl04g,NaCl18g,KH2PO4006
g,Na2HPO4005g,加水稀释至1L,用5mol·L
-1
NaOH调节pH74。
淫羊藿各黄酮苷储备液的配制:分别精密称取
淫羊藿苷 676mg,朝藿定 A838mg,朝藿定 B
808mg,朝藿定C822mg,宝藿苷Ⅰ514mg,分别
先加入2mL二甲亚砜使其溶解,再分别加入8mL
无水乙醇混匀,配制成1mmol·L-1的淫羊藿各黄
酮苷储备液,备用。
10μmol·L-1各淫羊藿黄酮苷小肠灌流液的配
制:分别精密吸取各淫羊藿黄酮苷储备液25mL置
250mL量瓶中,用37℃的 HBSS溶液稀释定容,配
制成浓度为10μmol·L-1的各淫羊藿黄酮苷小肠
灌流液。
内标溶液的配制:精密称取睾丸酮144mg,加
乙腈溶解定容至5mL,即配制成10mmol·L-1的储
备液。精密吸取睾丸酮储备液01mL,加入94mL
乙腈与06mL冰醋酸,混合均匀,即为100μmol·
L-1内标液,备用。
2.2 动物实验[67]
肌肉注射50%乌拉坦溶液(23mL·kg-1)对大
鼠麻醉,待麻醉后打开腹腔,在十二指肠、空肠、回肠
和结肠两端插管,用线缝合好,每段肠段长约10cm。
插管后将小肠部分小心放回腹腔,尽可能避免卷曲和
扭结。切口用生理盐水浸润的纱布覆盖。用灌流泵
将含有药物的溶液同时灌入四段肠段,泵的流速为
02mL·min-1,30min达到吸收平衡后,每隔30min
收集4份出口管中样品,供HPLC检测。
2.3 样品处理
取肠灌流收集样品400μL,加入100μL内标
溶液与之混合,离心,取上清液,即得。
2.4 样品分析
2.4.1 色谱条件 ZORBAXSBC18(46mm×250
mm,5μm),流速1mL·min-1,检测波长268,245
nm,流动相乙腈(A)水(B)梯度洗脱,0~11min:
29%A,13min:70%A,19min:80%A,22min:100%
A,柱温30℃。HPLC图见图2。
A.1为淫羊藿苷,2,3为代谢产物;B.1为朝藿定A,
2为代谢产物;C.1为朝藿B,2为代谢产物;
D.1为朝藿定C,2为代谢产物;E.1为宝藿苷Ⅰ;IS均为内标。
图2 淫羊藿黄酮苷肠灌流收集液HPLC图
2.5 数据处理
测定灌流液中药物的消失速率来测定灌流液中
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药物的摄取,用消失速率来计算肠壁的渗透系数
Pef。
Pef=(1-Cm/Co)/4Gz
Co和Cm代表进口浓度和出口浓度,Gz与流速,
肠子的长度,扩散系数有关,把实验数据代入公式,
用设计的Eexcel表计算。经SPSS100统计软件进
行统计。
3 结果
10μmol·L-1淫羊藿苷、朝藿定 A、朝藿定 B、
朝藿定C、宝藿苷Ⅰ在大鼠不同肠段的吸收存在差
异,表观渗透系数均显著低于十二指肠和空肠肠段
结果(表1)。
表1 5个黄酮苷(10μmol·L-1)在不同肠段的渗透系数Pef(珋x±s,n=4)
成分 十二指肠 空肠 回肠 结肠
淫羊藿苷 6365±0757 5349±0817 1004±0249 0601±0164
朝藿定A 4120±0629 3397±0567 0401±0115 0257±0078
朝藿定B 3645±0422 3135±0310 0990±0207 0434±0107
朝藿定C 3114±0772 2882±0435 0688±0229 0470±0140
宝藿苷I 2324±0410 2398±0143 1529±0339 1045±0146
  结果表明淫羊藿苷在十二指肠的渗透系数与空
肠比较有显著性差异(P<005),十二指肠、空肠的
渗透系数与回肠、结肠比较有显著性差异(P<
005),而回肠与结肠比较无显著性差异。从各肠
段的HPLC图可以看出,淫羊藿苷在各肠段有2个
代谢产物,而且在十二指肠、空肠较多,回肠较少,结
肠最少,有时观察不到。对于朝藿定A和朝藿定C,
十二指肠、空肠之间、回肠、结肠之间的渗透系数均
无显著性差异,但十二指肠、空肠的渗透系数与回
肠、结肠的渗透系数均有显著性差异(P<005)。
对于朝藿定B,十二指肠、空肠之间的渗透系数、回
肠、结肠之间的渗透系数均有显著性差异(P<
005),并且十二指肠、空肠的渗透系数分别与回
肠、结肠的渗透系数比较均有显著性差异(P<
005)。和淫羊藿苷相似,朝藿定 A,B,C在大鼠肠
道各自有1个代谢产物。宝藿苷 在大鼠肠道的吸
收代谢与淫羊藿苷不同,HPLC图显示它在肠道没
有代谢产物,直接被吸收,且在4个肠段都有一定量
的吸收。
4 讨论
从实验数据与 HPLC图分析,淫羊藿黄酮苷的
肠道吸收代谢与其化学结构与肠黏膜上皮上的酶密
切相关。
由HPLC图可知,药液灌流后,淫羊藿苷,朝藿
定A,B,C在十二指肠、空肠部位原型化合物色谱峰
明显减小,而在原型化合物色谱峰之后出现1~2个
较明显的色谱峰,经紫外光谱比对,其紫外光谱与淫
羊藿苷相同,确认为淫羊藿苷,朝藿定 A,B,C的代
谢产物,又由于代谢产物峰的保留时间比原型大,即
代谢产物的极性应比原型小,因此排除代谢产物是
二相代谢产物的可能。文献报道,在人和大鼠的肠
道存在着水解酶,如 LPH酶、β糖苷酶能水解黄酮
苷等成分[78],因此淫羊藿苷等成分也可能会在肠黏
膜表面被水解,而产生代谢产物。
朝藿定A,B,C均为三糖苷,淫羊藿苷为二糖
苷,宝藿苷 为单糖苷。三糖苷朝藿定 A、朝藿定 B、
朝藿定C由于它们的结构相似,母核相同,都为异
戊烯基黄酮,7位连接1个葡萄糖,只是3位连接的
双糖有区别,分别为鼠李糖葡萄糖,鼠李糖木糖,
鼠李糖鼠李糖,因此它们吸收代谢的途径也非常相
似,在肠道各有1个代谢产物,文献报道 LPH酶可
以水解葡萄糖,因此朝藿定A,B,C的代谢产物可能
是 7位上的葡萄糖被水解后产生的次苷。单糖苷
宝藿苷Ⅰ3位连接1个鼠李糖,在肠道没有代谢产
物,说明3位的鼠李糖不易被水解形成苷元,二糖苷
淫羊藿苷7位连接1个葡萄糖,3位连接1个鼠李
糖,在肠道有2个代谢产物,其中7位的葡萄糖易被
水解而产生次苷,而3位的鼠李糖是否被水解,有待
进一步证明,这也说明大鼠肠黏膜表面水解酶对化
合物的水解是有结构选择性的。
总之,淫羊藿黄酮在大鼠肠道吸收的过程十分
复杂,淫羊藿苷,朝藿定 A,B,C的渗透系数应该是
1个表观渗透系数,它是2个过程即成分的肠渗透
以及肠水解的加和,因此并不是其真正的肠渗透系
数,由Caco2细胞实验结果显示,淫羊藿苷等在肠
的渗透系数很小[5],因此在大鼠肠灌流模型中,其
表观渗透系数主要取决于水解速度,而水解速度又
取决于酶的分布,从淫羊藿苷在大鼠肠段的渗透系
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数回肠和结肠肠段显著低于十二指肠和空肠肠段的
结果来看,水解酶的分布在十二指肠和空肠远远大
于回肠和结肠部位。
[参考文献]
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AbsorptionandmetabolismofflavonoidsinHerbaEpimediviarat
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CHENYan1,JIAXiaobin1,TANXiaobin1,FANChenyi1,HUMing2
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[Abstract] Objective:TostudytheabsorptionandmetabolismoffiveflavonoidsofHerbaEpimedi(icarin,epimedinA,epi
medinB,epimedinCandbaohuosideⅠ)inratintestine.Method:Usingtheratintestinalperfusionmodel,thecontentsofthefive
flavonoidsinperfusatesweremeasuredbyHPLCandthepermeabilitycoeficientsindiferentintestineswerecalculated.Result:The
permeabilitiesoffiveflavonoidsinduodenum,jejunum,ileum,colonaccordingtothesequencewereas:icarin:6365,5349,
1004,0601,epimedinA:4120,3397,0401,0257,epimedinB:3645,3135,09907,0434,epimedinC:3114,
2882,0688,0470,baohuosideⅠ:2324,2398,1529,1045,respectively.Theanalysisoftheperfusatesshowedthaticari
in,epimedinA,epimedinB,epimedinCcouldbehydrolyzedinintestine.Icarinhadtwohydrolyticmetabolites,whereasepimedin
A,B,Conlyhadonehydrolyticmetabolite,respectively.Conclusion:Theresultsindicatedthattheabsorptionofalthefivefla
vonoidswassignificantlydiferentindiferentintestinalsegments,andthepermeabilityinileumandcolonwassignificantlylowerthan
thatoftheduodenumandjejunum.Themetabolitesoficarin,epimedinA,epimedinB,epimedinCwererelatedwiththeirstructures
andenzymesinintestine,andthemetabolitesweremoreinduodenum,jejunum,whereaswerelessinileumandcolon.
[Keywords] flavonoidsinHerbaEpimedi;ratintestinalperfusionmodel;absorption;metabolism;permeabilitycoeficient
[责任编辑 古云侠]
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