全 文 ：川芎提取物对线虫寿命的影响及分子机制研究
汪晓燕，王香明，王丹巧，李连达，牛晓红
（中国中医科学院 医学实验中心，北京 １００７００）
［摘要］　目的：观察川芎提取物（ＣＸＥ）对秀丽隐杆线虫寿命的影响并探讨其分子机制。方法：寿命实验设对照组和ＣＸＥ
４个用药组（１２５，２５，５０，１００ｍｇ·Ｌ－１），观察ＣＸＥ对线虫平均寿命、最大寿命的影响；选用延寿效果最佳浓度的 ＣＸＥ（２５ｍｇ
·Ｌ－１）培养线虫１０ｄ后，采用实时荧光定量ＰＣＲ（ｑＲＴＰＣＲ）方法检测分析对照组和用药组衰老相关基因的表达变化。结果：
与对照组相比，２５，５０，１００ｍｇ·Ｌ－１ＣＸＥ均能显著延长线虫的平均寿命（分别为１５７％，９１％，６２％，Ｐ＜００１）和最大寿命
（分别为１５０％，６８％，６６％，Ｐ＜００１）。用药组ｈｓｐ７０，ｓｋｎ１基因表达明显上调（Ｐ＜００１），而ａｋｔ２，ｔｕｂ１基因表达显著下
调（Ｐ＜００１）。结论：川芎提取物能明显延长线虫寿命，其机制与调控Ｉｎｓｕｌｉｎ／ＩＧＦ１信号通路、限食通路部分基因表达有关。
［关键词］　川芎提取物；秀丽隐杆线虫；寿命；基因
［收稿日期］　２００９０９１５
［基金项目］　国家自然科学基金青年项目（３０９０１９９１）；中国中医科
学院基本科研业务费资助项目（ＺＺ２００６０３７）
［通信作者］　 王丹巧，Ｔｅｌ：（０１０）６４０１４４１１３３３５，Ｅｍａｉｌ：ｄｑ＿
ｗａｎｇ９６＠ｓｏｈｕｃｏｍ
　　川芎ＬｉｇｕｓｔｉｃｕｍｃｈｕａｎｘｉｏｎｇＨｏｒｔ为常用传统中
药，性温味辛，历代医家多用于活血行气、祛风止痛。
２００５年版《中国药典》收载的５６４种成方制剂和单
味制剂中，使用川芎的有８５种，约占药典收载中成
药的１５％，川芎在临床的广泛应用促进了对其新的
药效功能的开发及相关机制研究。尽管川芎在老年
性疾病的治疗中被广泛应用并取得较好的疗效，但
对其延缓衰老作用的研究报道甚少。本研究选用秀
丽隐杆线虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓｅｌｅｇａｎｓ，简称线虫）这一
在延缓衰老研究中具有优势的模式生物，研究川芎
提取物（ｃｈｕａｎｘｉｏｎｇｅｘｔｒａｃｔ，ＣＸＥ）对其寿命的影响，
并采用实时荧光定量 ＰＣＲ（ｑＲＴＰＣＲ）方法研究其
分子机制。
１　材料
１１　菌株、线虫　菌株 ＥｃｏｌｉＯＰ５０、野生型秀丽隐
杆线虫Ｂｒｉｓｔｏｌ（Ｎ２）均由北京大学生命科学学院遗传
发育实验室惠赠。
１２　药物和试剂　川芎提取物（川芎产地为四川
省都江堰市，水提，含生药量 ２０ｇ·ｇ－１提取物，
ＨＰＬＣ检测含阿魏酸０００３％）购自惠州市仙草植物
保健科技有限公司。琼脂粉（日本协和株式会社）；
５氟尿嘧啶（５ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ，５Ｆｕ）（Ｓｉｇｍａ）；ｐｅｐｔｏｎｅ，
ｔｒｙｐｔｏｎｅ（ＯＸＯＩＤ）；ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲＭａｓｔｅｒ
Ｍｉｘ（Ｔｏｙｏｂｏ）；ＴＲＩｚｏｌ试剂（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；反转录试剂
盒（Ｐｒｏｍｅｇａ）。
１３　仪器　ＭＩＲ５５３恒温培养箱（日本 Ｓａｎｙｏ公
司），Ｓ６Ｅ体视显微镜（德国 Ｌｅｉｃａ公司），ＸＴＳ３０Ｄ
体视显微镜（北京泰克仪器有限公司），Ｒｏｔｅｒｇｅｎｅ
３０００荧光定量ＰＣＲ仪（澳大利亚 Ｃｏｒｂｅｔ公司），梯
度ＰＣＲ仪（德国 Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司），台式高速冷冻离
心机（德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司）、Ｇ：ＢＯＸ全自动凝胶成
像仪（英国 Ｓｙｎｇｅｎｅ公司）、ＭＬＳ３７８０高压灭菌锅
（日本Ｓａｎｙｏ公司）。
２　方法
２１　实验分组　寿命试验设对照组和４个用药组
（１２５，２５，５０，１００ｍｇ·Ｌ－１）；ｑＲＴＰＣＲ试验设对照
组和用药组（寿命试验中延寿作用最强组）。
２２　线虫常规培养　雌雄同体线虫 Ｎ２，接种于涂
布 ＥｃｏｌｉＯＰ５０的标准线虫培养基［１］（ｎｅｍａｔｏｄｅ
ｇｒｏｗｔｈｍｅｄｉｕｍ，ＮＧＭ）于２０℃恒温培养。
２３　寿命试验　用 Ｍ９缓冲溶液将年轻成虫洗至
无菌ＥＰ管中，加适量裂解液（０５％次氯酸钠，０５
ｍｏｌ·Ｌ－１氢氧化钠）裂解线虫，置低速离心机上
３０００ｒ·ｍｉｎ－１离心１ｍｉｎ，弃上清，再用 Ｍ９冲洗线
虫２次，离心弃上清后用移液枪吸取 ＥＰ管底部线
虫滴于ＮＧＭ的无菌区，约４８ｈ后裂解的线虫体内
的受精卵基本发育成Ｌ４期幼虫，完成同步化用于寿
命试验。
对照组培养基中含１２５ｍｇ·Ｌ－１的５Ｆｕ，药物
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组培养基中含 １２５ｍｇ·Ｌ－１５Ｆｕ和不同浓度的
ＣＸＥ。据文献报道，１２５ｍｇ·Ｌ－１５Ｆｕ不影响线虫
寿命［２］。挑取同步化的 Ｌ４线虫到各组培养基中，
每组平均８０～１１０条，每个板中约有１５条。从转移
时刻起开始计算线虫存活天数，转移当天记为寿命
实验第０天。每天检查线虫，记录死亡线虫数，剔除
意外死亡、逃逸和囊样线虫。线虫死亡判断标准：用
铂丝轻触虫体，无任何反应，即判断为死亡。以上试
验均重复２次。
２４　延寿的分子机制研究　对照组和用药组各挑
取约１０００条Ｌ４期线虫到培养基中，饲养１０ｄ后，
分别收集各组线虫，用 ＴＲＩＺＯＬ法抽提总 ＲＮＡ，
ＲＮａｓｅｆｒｅｅＤＮａｓｅ酶切，ＴＲＩＺＯＬ法纯化后琼脂糖凝
胶电泳鉴定 ＲＮＡ没有明显降解，于 －８０℃冻存。
取２μｇ总ＲＮＡ，用ＭＭＬＶ逆转录酶按说明书进行
反转录。
引物合成：对已知线虫中与衰老相关的基因，根
据ｗｏｒｍｂａｓｅ公布的序列设计合成 ＰＣＲ引物（北京
奥科生物技术有限责任公司），序列为 ａｋｔ２上游引
物：５′ＡＴＴＣＡＧＣＧＡＡＧＣＡＣＧＡＡＣ３′，下游引物：５′
ＣＡＣＡＡＣＣＣＡＡＡＧＴＣＡＧＴＧ３′；ｈｓｐ７０上游引物：５′
ＧＧＧＴＡＣＴＡＣＧＴＡＣＴＣＡＴＧ３′，下游引物：５′ＡＴＣＡＣ
ＣＡＡＣＧＡＧＴＣＴＣＴＣ３′；ｓｋｎ１上 游 引 物：５′ＡＧＴ
ＧＡＣＴＧＣＡＡＣＡＧＣＴＡＣ３′， 下 游 引 物： ５′
ＡＧＡＡＡＣＧＡＧＡＣＴＣＧＴＧＡＧ３′；ｔｕｂ１上游引物：５′
ＴＣＣＡＡＴＴＧＣＴＣＡＡＣＣＡＣＧ３′，下游引物：５′ＡＧＧ
ＧＡＧＴＡＣＴＴＣＡＣＴＴＧＧ３′，并以 ａｃｔ１作为内部参照
物，其上游引物：５′ＡＡＧＡＣＣＡＣＧＴＣＡＴＣＡＡＧＧ３′，
下游引物：５′ＴＴＣＴＣＣＡＴＡＴＣＡＴＣＣＣＡＧＴＴ３′。
采用嵌合荧光法检测目的基因表达差异。采用
２０μＬ反应体系，ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＭａｓｔｅｒＭｉｘ１０μＬ，上
游引物、下游引物（１０ｍｍｏｌ·Ｌ－１）各１μＬ，模板ｃＤ
ＮＡ２μｇ，以去离子水补足２０μＬ体系。ＰＣＲ反应条
件：９４℃预变性５ｍｉｎ，９４℃变性３０ｓ，５８℃退火３０
ｓ，７２℃延伸３０ｓ，共４０个循环。每个样品均做３次
生物学重复。采用２ΔΔＣＴ方法［３］对扩增曲线进行分
析。
２５　统计学分析　采用 ＡＮＯＶＡ方差检验分析寿
命试验结果，定量资料以珋ｘ±ｓ表示；采用两样本ｔ检
验方法比较分析目的基因差异表达。
３　结果
３１　川芎提取物对线虫寿命的影响　与对照组比
较，２５，５０，１００ｍｇ·Ｌ－１ＣＸＥ均能显著延长线虫的
平均寿命（分别为１５７％，９１％，６２％，Ｐ＜００１）
和最大寿命（分别为 １５０％，６８％，６６％，Ｐ＜
００１）。对线虫全程存活情况做生存曲线（图１），３
种剂量ＣＸＥ均能使线虫的生存曲线右移，以２５ｍｇ
·Ｌ－１尤为显著。
图１　线虫生存曲线
３２　川芎提取物对衰老相关基因表达的影响　２５
ｍｇ·Ｌ－１ＣＸＥ干预１０ｄ后，线虫体内衰老相关基因
表达发生变化，见表１、图２。与看家基因ａｃｔ１相比，
用药后ｈｓｐ７０，ｓｋｎ１基因表达明显上调（Ｐ＜００１），
而ａｋｔ２，ｔｕｂ１基因表达显著下调（Ｐ＜００１）。
表１　对照组和用药组各目的基因ＣＴ和－ΔΔＣＴ值
基因 组别 ＣＴ －ΔΔＣＴ
ａｃｔ１ 对照 １７５２ ０
ａｋｔ２ 用药 １６３９
对照 ２５３７ －１５６
用药 ２５８０
ｈｓｐ７０ 对照 ２６５２ ２６６
用药 ２２７３
ｓｋｎ１ 对照 ２１２７ １４６
用药 １８６８
ｔｕｂ１ 对照 ２５４９ －２７２
用药 ２７０８
　　注：ＣＴ指每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的
循环数。表中数值为３次重复中的其中１次结果。
与ａｃｔ１比较１）Ｐ＜００５，２）Ｐ＜００１。
图２　川芎提取物对线虫衰老相关基因表达的影响
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４　讨论
中医延缓衰老研究源远流长，在现有的众多中
医学衰老理论中，“气虚血瘀衰老学说”［４］得到了一
致公认并成为临床延缓衰老和治疗老年性疾病的诊
疗原则。研究表明，活血化瘀药能增强机体免疫功
能［５］，抑制氧自由基［６］，改善血液流变性和微循
环［７］，降低血脂，提高记忆力［８］等，对延缓衰老有积
极作用。川芎为经典的行气活血化瘀中药，现代药
理学研究认为，川芎的有效成分川芎嗪和阿魏酸等
具有清除氧自由基［９］、抑制细胞凋亡［１０］、扩张血管、
改善微循环［１１］、调节免疫、提高记忆力等作用，在复
方研究中发现其参与延缓内皮细胞衰老［１２］。本研
究采用线虫这一模式生物，以整体动物寿命实验作
为检测手段［１３］，观察ＣＸＥ对线虫寿命的影响，发现
多个浓度ＣＸＥ对线虫均有延寿作用或延寿趋势，其
中２５ｍｇ·Ｌ－１的延寿效果最佳，平均寿命和最大寿
命均延长约１５％，迄今为止还未见到有关川芎这一
药理作用的报道。
在衰老的机制研究中，胰岛素和胰岛素样生长
因子１（Ｉｎｓｕｌｉｎ／ＩＧＦ１）信号通路［１４］是一个高度保守
（包括线虫、果蝇、小鼠乃至灵长类动物）、研究最为
详尽的寿命调控环节。正常条件下线虫体内释放多
种Ｉｎｓｕｌｉｎ／ＩＧＦ样肽，这些肽与细胞表面的受体结合
而在细胞内产生一系列的信号级联反应，最终通过
磷酸化 ＤＡＦ１６而抑制其进入细胞核；在外界环境
发生变化时（如饥饿，虫口过密）Ｉｎｓｕｌｉｎ／ＩＧＦ１信号
通路被抑制，导致 ＤＡＦ１６未被磷酸化而入核，在细
胞核内 ＤＡＦ１６发挥转录因子的作用，促进许多抗
逆性基因的表达而发挥延长寿命的作用［１５１６］，因此
与该信号通路相关基因的表达改变能直接或间接地
影响衰老进程，调控寿命长短。ａｋｔ２编码的蛋白是
丝氨酸／苏氨酸激酶 Ａｋｔ／ＰＫＢ的同源物，它位于
ＤＡＦ１６上游，能磷酸化 ＤＡＦ１６，抑制其进入细胞
核［１７］，因此，ａｋｔ２基因表达下调可延长线虫寿命。
ｈｓｐ７０编码的热休克蛋白是一种分子伴侣，帮助蛋
白正确折叠为天然构象，对寿命发挥正调节作
用［１８］。在线虫体内，ｔｕｂ１位于 ｄａｆ１６上游，其低表
达具有延寿作用且该作用依赖于 ＤＡＦ１６［１９］。ｓｋｎ１
编码的蛋白是 Ｎｒｆ２的同源物，它位于 Ｉｎｓｕｌｉｎ／ＩＧＦ１
信号通路下游，该信号通路激酶 ＡＫＴ１，ＡＫＴ２等能
磷酸化ｓｋｎ１而直接抑制其表达；ｓｋｎ１能提高机体
抗应激能力，延长线虫寿命，且其延寿作用独立于
ＤＡＦ１６［２０］。限食在许多物种中可引起长寿，并且可
以降低和衰老相关的疾病发病率［２１］。限食可以促
进 ｓｋｎ１表达，提高线虫的呼吸作用而延长线虫
寿命［２２］。
本研究发现，ＣＸＥ可能通过上调 Ｉｎｓｕｌｉｎ／ＩＧＦ１
信号通路中对延寿具有正调控作用的基因，如 ｈｓｐ
７０；下调该通路中部分负调控寿命的基因，如 ａｋｔ２，
ｔｕｂ１而发挥延寿作用；此外，限食是一个公认的极
好的延寿方法，本实验结果表明ＣＸＥ可能通过上调
限食重要调控基因 ｓｋｎ１而引起长寿。同时，ＣＸＥ
对寿命的多种调控机制也反映了中药对衰老的影响
具有多靶点、多效应的特点，值得进一步探讨研究。
本研究利用模式生物线虫在衰老研究上的优势
（生命周期短、易于培养、遗传机制明确等），探讨活
血化瘀代表性中药———川芎提取物的延寿效果，并
利用已知的线虫衰老相关基因，采用 ｑＲＴＰＣＲ方法
进行延寿的分子机制研究，提出ＣＸＥ可能通过干预
Ｉｎｓｕｌｉｎ／ＩＧＦ１通路和限食通路而延长寿命，为该药
的分子机制研究提供了新的内容和方向，也为中药
延缓衰老研究提供了新的思路和手段；该研究内容
为川芎的延寿功效提供了实验依据，而其水提物浓
度与寿命间的关系、其延寿的有效成分及各成分间
的配比以及详细的分子机制值得进一步探讨研究。
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ＥｆｅｃｔｏｆＬｉｇｕｓｔｉｃａｍｃｈｕａｎｘｉｏｎｇｅｘｔｒａｃｔｏｎｌｉｆｅｓｐａｎｏｆＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓｅｌｅｇａｎｓ
ａｎｄｉｔｓｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ
ＷＡＮＧＸｉａｏｙａｎ，ＷＡＮＧＸｉａｎｇｍｉｎｇ，ＷＡＮＧＤａｎｑｉａｏ，ＬＩＬｉａｎｄａ，ＮＩＵＸｉａｏｈｏｎｇ
（ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒ，ＣｈｉｎａＡｃａｄｅｍｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００７００，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｅｆｅｃｔｏｆＬｉｇｕｓｔｉｃａｍｃｈｕａｎｘｉｏｎｇｅｘｔｒａｃｔ（ＣＸＥ）ｏｎｌｉｆｅｓｐａｎｏｆＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓｅｌｅｇａｎｓａｎｄ
ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｉｔｓｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｓＭｅｔｈｏｄ：Ｔｈｅｌｉｆｅｓｐａｎａｓｓａｙｗａｓｃａｒｉｅｄｏｕｔｏｎａｎｉｍａｌｓｇｒｏｕｐｅｄｉｎｔｏｂｌａｎｋｃｏｎｔｒｏｌ
ｇｒｏｕｐａｎｄＣＸＥｇｒｏｕｐｓｗｉｔｈｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｆｒｏｍｌｏｗｔｏｈｉｇｈ：１２５，２５，５０，１００ｍｇ·Ｌ－１ｂｙｅｘａｍｉｎｉｎｇｔｈｅｅｆｅｃｔｏｆＣＸＥｏｎｍｅａｎｌｉｆｅｓ
ｐａｎａｎｄｍａｘｉｍｕｍｌｉｆｅｓｐａｎｏｆＣｅｌｅｇａｎｓ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｒｅｓｕｌｔｏｆｌｉｆｅｓｐａｎａｓｓａｙ，ｗｅｃｕｌｔｕｒｅｄｔｈｅａｎｉｍａｌｓｗｉｔｈｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｃｏｎｃｅｎｔｒａ
ｔｉｏｎｏｆＣＸＥｆｏｒ１０ｄａｙｓ，ａｎｄｔｅｓｔｅｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃｈａｎｇｅｏｆａｇｉｎｇｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅｓｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌａｎｄＣＸＥｇｒｏｕｐｂｙｒｅａｌｔｉｍｅＲＴ
ＰＣＲ（ｑＲＴＰＣＲ）Ｒｅｓｕｌｔ：Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌ，２５，５０，１００ｍｇ·Ｌ－１ＣＸＥａｌｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｅｘｔｅｎｄｅｄｔｈｅｍｅａｎｌｉｆｅｓｐａｎ
（１５７％，９１％，６２％ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）ａｎｄｔｈｅｍａｘｉｍｕｍｌｉｆｅｓｐａｎ（１５０％，６８％，６６％ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）ｏｆＣｅｌｅｇａｎｓ．Ａｆｔｅｒｔｒｅａｔ
ｍｅｎｔｗｉｔｈ２５ｍｇ·Ｌ－１ＣＸＥ，ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｈｓｐ７０，ｓｋｎ１ｗｅｒｅｏｂｖｉｏｕｓｌｙｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄｗｈｉｌｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｋｔ２，ｔｕｂ１ｗｅｒｅｓｉｇ
ｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＣＸＥｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｅｘｔｅｎｄｔｈｅｌｉｆｅｓｐａｎｏｆＣｅｌｅｇａｎｓ，ａｎｄｔｈｅｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｉｓ
ｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈｇｅｎｅｓｏｆＩｎｓｕｌｉｎ／ＩＧＦ１ｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙａｎｄｄｉｅｔａｒｙｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］　Ｌｉｇｕｓｔｉｃａｍｃｈｕａｎｘｉｏｎｇｅｘｔｒａｃｔ；Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓｅｌｅｇａｎｓ；ｌｉｆｅｓｐａｎ；ｇｅｎｅ
ｄｏｉ：１０．４２６８／ｃｊｃｍｍ２０１００８２３
［责任编辑　张宁宁］
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第３５卷第８期
２０１０年４月
　　　　　　 　 　 　 　 　　　　　　 　 　 　 　
Ｖｏｌ３５，Ｉｓｓｕｅ　８
Ａｐｒｉｌ，２０１０