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Staining and slide-preparing technique of mitotic chromosomes and application in karyotype determination of Ephedra

麻黄属植物染色体制片技术及核型分析研究



全 文 :’ 麻黄属植物染色体制片技术及核型分析研究
武季玲1,李胜1,姜寒玉1,高育红2,牛俊义2
(1.甘肃农业大学 生命科学技术学院,甘肃 兰州 730070;
2.甘肃农业大学 农学院,甘肃 兰州 730070)
[摘要] 目的:对4种麻黄属植物的核型进行分析研究,为麻黄种质资源的鉴定和遗传多样性研究提供细胞学依据。方
法:以萌发种子根尖为材料,采用染色体制片技术,分析4种麻黄属植物的核型。结果:上午10:20-10:40为最佳取样时间,
且采用0002mol·L-18羟基喹啉预处理时间草麻黄为4h,中麻黄5h,木贼麻黄45h,膜果麻35h。膜果麻黄、木贼麻黄
为二倍体,染色体数目为2n=2x=14,核型公式分别为2n=2x=14=2M+8m+4sm,2n=2x=14=10m+4st;草麻黄和中麻黄
的染色体数目为2n=4x=28,属四倍体,核型公式分别为2n=4x=28=20m(2SAT)+8st,2n=4x=28=20m(SAT)+6st+
2sm;结论:4种麻黄的核型均为“2A”型,属较对称核型。
[关键词] 麻黄;有丝分裂;染色体;核型
[收稿日期] 20090226
[基金项目] 甘肃省科技厅自然基金项目(3ZS051A25063)
[通信作者] 牛俊义,博士,教授,博士生导师,主要从事作物栽培
及生态生理方面研究
[作者简介] 武季玲,博士,副教授,主要从事植物生理学及组织培
养方面的研究,Tel:13993110554,Email:wujl@gsau.edu.cn
  麻黄麻黄科 Ephedraceae麻黄属 Ephedra植物,
为多年生草本状小灌木植物,我国现存15种2变种
和1变型。麻黄是治疗风寒感冒、全身疼痛、咳嗽和
气喘的良药,也是提取麻黄素的唯一原料,《中国药
典》收载作为药用的麻黄植物有草麻黄 E.sinica
Stapf、中麻黄E.intermediaSchrenkexMey和木贼麻
黄E.equisetinaBge。麻黄中所含麻黄碱、挥发油、黄
酮类和鞣质及麻黄多糖等化学成分,具有平喘、升压、
收缩血管、利尿、降温的作用;除药用价值外,麻黄还
具有重要的生态价值,麻黄多生长在沙丘、黄土丘陵,
对防治水土流失,保护草场、改善沙地生态环境等发
挥着巨大作用[1]。目前,麻黄主要分布于我国的新
疆、内蒙古、青海、甘肃、宁夏等地,其中以新疆和内蒙
古的蕴藏量最大,主要以药典品种为主,还有膜果麻
黄E.przewalskiStapf,蓝麻黄E.glaucaRgl等,是兼
具经济效益和生态效益的重要种质资源。
麻黄属植物种类虽然不多,但其种质资源广泛
分布于北温带及南美的干旱和荒漠地区,取材非常
困难,并且可利用的真正有价值的分类性状不多,因
此系统地对该属植物进行研究的资料很少,探讨麻
黄不同基因型间的细胞学异同,了解它们之间的亲
缘关系,为育种和引种提供科学的染色体证据是有
实际意义的。有关麻黄细胞学方面的研究国内外报
道较少,麻黄属染色体数目前人已有过一些报
道[25],孔红等[68]研究报道了3种麻黄属植物核型。
本研究对草麻黄、中麻黄、膜果麻黄和木贼麻黄4种
主要麻黄属植物的核型进行比较研究,其中中麻黄
和木贼麻黄核型分析结果为首次报道,以期为麻黄
种质资源的鉴定、起源、演化、良种培育等提供必要
的细胞学资料。
1 材料
草麻黄E.sinica、中麻黄 E.intermedia、膜果麻
黄E.przewalski和木贼麻黄E.equisetina种子由中
国科学院新疆吐鲁番沙漠植物园提供。
2 方法
2.1 不同取材时间有丝分裂前中期分裂相数比较
从上午9:30-11:00,每隔10~20min取麻黄
种子根尖按下述方法制片、镜检,对单位视野面积内
处于分裂中期的细胞进行计数,以此参数为依据,确
定麻黄根尖中期分裂相的高峰期[9]及适宜的取材
时间。
2.2 制片
2.2.1 材料培养 选取饱满的麻黄种子,清水清
洗、02% KMnO4浸泡20~30min,置于25℃恒温培
养箱中,待幼根长到10~15cm时,于上午9:30-
11:00取幼根离体根尖。
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2.2.2 预处理与固定 离体根尖用0002mol·L-1
8羟基喹啉在避光条件下处理3~5h,再以蒸馏水漂
洗2~3次,卡诺氏固定液(无水乙醇冰醋酸3∶1)固
定12~24h,4℃下保存备用。
2.2.3 解离 取固定后的根尖材料,蒸馏水漂洗
2~3次,于60℃恒温水浴中用1mol·L-1盐酸解离
10~15min,取出,用蒸馏水漂洗2~3次,经95%,
85%乙醇处理,各10~15min,最后转入70%乙醇
中,4℃保存备用。
2.2.4 染色与压片 用改良卡宝品红溶液染色过
夜,吸去染液,用45%醋酸脱色、软化材料,染色体
制片采用常规压片法。
2.2.5 镜检 选取30个染色体清晰且分散良好的
分裂中期细胞,统计染色体数目,85%以上的细胞具
有恒定一致的染色体数,即为该麻黄种的染色体数
目。观察并选出染色体染色适度、清晰且分散良好、
着丝点清晰的片子制成永久制作,进行显微拍照,分
别测量和计算各对染色体的长度、臂长、臂比等核型
参数。根据染色体总长度的平均值,由长至短顺序
排列,并编出序号,进行同源染色体配对。染色体核
型分析依据Levan等[10]的方法进行,核型的对称性
按Stbbeinr的分类标准[11]。核型不对称系数(As.
K,% )根据Arano的计算方法,计算公式为 长臂总
长/全组染色体总长×100[12]。
3 结果与分析
3.1 不同取样时间对麻黄有丝分裂中期分裂相的
影响
草麻黄、中麻黄、膜果麻黄和木贼麻黄有丝分
裂中期分裂相的高峰期分别在上午10:30,10:40,
10:30,10:20,可观察到近14%的中期分裂相。其
他取样时间也可观察到中期分裂相的细胞,但所
占比例较小,很难从中筛选出分散较好的染色体
分裂相,因此,麻黄根尖细胞的分裂具有一定的周
期性,上午10:20-10:40为观察染色体的最佳取
样时间(图1)。
3.2 不同预处理时间对染色体收缩程度的影响
a草麻黄;b中麻黄;c膜果麻黄;d木贼麻黄。
图1 不同取样时间4种麻黄有丝分裂中期细胞的百分比
  采用0002mol·L-1的8羟基喹啉处理麻黄离
体根尖35~5h效果较好,染色体分散性良好,收
缩程度适中,着丝点清晰,适宜进行核型分析。草麻
黄、中麻黄、膜果麻黄和木贼麻黄离体根尖的预处理
时间分别为4,5,35,45h。
3.3 核型分析
3.3.1 草麻黄 核型公式为 2n=4x=28=20m
(2SAT)+8st;染色体相对长度组成为2n=18M2+
6M1+4S,相对长度变化范围为517%~876%,臂
比在105~400;核型类别为“2A”型;核型不对称
系数为6021%(表1,图2)。
3.3.2 中麻黄 核型公式为 2n=4x=28=20m
(SAT)+6st+2sm;染色体相对长度组成为 2n=
16M2+10M1+2S,相对长度变化范围为 515% ~
895%;臂比在 118~328;核型类别属于“2A”
型;核型不对称系数为5937%(表1,图2)。
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表1 4种麻黄属植物染色体相对长度、臂比和类型
序号
相对长度/%
(长臂+短臂=全长)
相对长度
系数
类型
臂比
(长/短)
类型
A1 449+427=876 123 M2 105 m
A2 438+360=798 112 M2 122 m
A3 438+360=798 112 M2 122 m
A4 427+360=787 110 M2 119 m1)
A5 449+337=786 110 M2 133 m
A6 449+337=786 110 M2 133 m
A7 438+337=775 108 M2 130 m
A8 427+337=764 107 M2 127 m
A9 393+337=730 102 M2 117 m
A10 427+281=708 099 M1 152 m
A11 449+124=573 080 M1 364 st
A12 449+112=561 079 M1 400 st
A13 426+112=538 075 S 380 st
A14 393+124=517 072 S 318 st
B1 485+410=895 125 M2 118 m
B2 488+361=849 119 M2 135 m
B3 477+314=791 112 M2 152 m
B4 392+389=781 109 M2 101 m
B5 391+389=780 109 M2 101 m
B6 415+363=778 109 M2 118 m
B7 392+381=773 108 M2 103 m
B8 413+342=755 106 M2 120 M1)
B9 384+319=703 098 M1 120 m
B10 412+268=680 095 M1 153 m
B11 454+140=594 083 M1 324 st
B12 413+143=556 078 M1 293 sm
B13 415+127=542 076 M1 327 st
B14 401+114=515 072 S 328 st
C1 906+732=1638 115 M2 124 m
C2 809+771=1580 111 M2 105 m
C3 867+694=1561 109 M2 125 m
C4 771+771=1542 108 M2 100 M
C5 771+578=1349 094 M1 133 m
C6 867+347=1214 085 M1 250 sm
C7 771+347=1118 078 M1 222 sm
D1 986+772=1758 123 M2 128 m
D2 874+670=1544 108 M2 130 m
D3 903+574=1477 104 M2 157 m
D4 868+582=1450 102 M2 149 m
D5 824+622=1446 101 M2 133 m
D6 978+227=1205 084 M1 431 st
D7 922+196=1118 078 M1 470 st
  注:1)随体长度不计算在内;A.草麻黄;B.中麻黄;C.膜果麻黄;
D.木贼麻黄。
3.3.3 膜果麻黄 核型公式为2n=2x=14=2M+
8m+4sm;染色体相对长度组成为2n=8M2+6M1,
相对长度变异范围 1118% ~1638%;臂比在
100~250变化;核型属于“2A”型;核型不对称系
数为5761%(表1,图2)。
3.3.4 木贼麻黄 核型公式为 2n=2x=14=
10m+4st;染色体相对长度组成为2n=5M2+2M1,
相对长度变异范围为 1118% ~1758%;臂比在
128~470变化;核型属于“2A”型;核型不对称系
数为6356%(表1,图2)。
4 小结与讨论
4.1 取材及预处理时间
不同植物的细胞周期及中期分裂高峰期各不相
同,尤以不同科属植物间的差异更为显著。细胞有
丝分裂中期分裂相的多少是随时间的变化而改变
的,一般中期持续时间约10~30min[13]。实际操作
中,只有少数细胞处于分裂中期,为获取更多中期分
裂相,在染色体研究中取材时间是关键。通过观察,
确定草麻黄、中麻黄、膜果麻黄和木贼麻黄的中期分
裂相所处高峰期分别在10:30,10:40,10:30,10:20
左右,此时间段内细胞中期分裂相较多。
在取材适宜的条件下,制片成功与否的最关键步
骤便是材料的预处理。研究中使用0002mol·L-1
8羟基喹啉对麻黄根尖进行预处理的时间分别为草
麻黄4h,中麻黄为5h,木贼为45h,膜果麻黄35
h。预处理后,细胞中期分裂相较多,染色体收缩适
当,分散性好,形态清晰,适用于核型分析研究。
4.2 麻黄细胞学分析
本研究的4种麻黄属植物中,膜果麻黄、木贼麻
黄为二倍体,染色体数目为2n=2x=14,草麻黄和
中麻黄的染色体数目为2n=4x=28,属四倍体。4
种麻黄核型类别均为2A型,属较对称核型。草麻
黄和膜果麻黄的染色体数目、基数及倍性与前人研
究结果一致,核型上有差异,这与物种的地理分布及
生境有关。染色体是基因的载体,基因决定生物的
性状,一定的性状则适应特定的环境。虽然在一定
的生境中,植物的染色体是恒定的,但是大尺度的生
境异质性往往导致染色体水平的变异,从而增加了
物种的遗传多样性[14]。
4种麻黄属植物,均未观察到衔接或连续随体。
仅发现草麻黄第4对染色体短臂端部具有端部核仁
组成区(NOR)[15],中麻黄第8对染色体中的一条具
端部NOR,但其同源染色体上没有发现,出现该现
象的原因可能是在有丝分裂或减数分裂时,同源染
色体上的NOR易于粘连在一起不分离,其结果便会
出现一个同源染色体的 NOR增大,另一个则丢失,
即发生NOR联合现象,这也是产生 NOR多态性的
机制之一。
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A.草麻黄;B.中麻黄;C.膜果麻黄;D.木贼麻黄。
图2 4种麻黄染色体核型及模式图
4.3 核型分析与物种亲缘关系探讨
在植物核型的进化过程中,一般认为亚端部和
端部着丝粒染色体是由中部或亚中部着丝粒染色体
演化来的,在这一演化过程中,很可能与染色体的臂
内倒位有关[16],植物核型的发展趋势是从对称性到
较大的非对称性,但是这种趋势有时候会发生逆转。
本研究结果表明,从染色体类型组成来看,膜果麻黄
染色体包括1对正中部着丝粒染色体(M),4对中
部着丝粒染色体(m),2对亚中部着丝粒染色体
(sm);木贼麻黄、草麻黄和中麻黄染色体类型中除
中部、亚中部着丝粒染色体外,还存在亚端部着丝粒
染色体(st)。从染色体大小来看,膜果麻黄和木贼
麻黄染色体相对长度变幅分别为 1118% ~
1638%,1118%~1758%,较为接近;草麻黄染色
体相对长度变幅在 517% ~876%、中麻黄为
516%~895%,变化极小。4种麻黄种内染色体
类型较多,其遗传多样性较为丰富。从进化上讲,植
物中的多倍体植物可以认为是由二倍体植物进化来
的,植物染色体倍性由低到高,即由二倍体向四倍
体,再向更高倍的多倍体发展是进化的趋势[17],许
多多倍植物比二倍体有更高的抗逆性,更有利于在
复杂的生活环境中存活、发展和进化[14]。膜果麻黄
和木贼麻黄为二倍体,草麻黄和中麻黄较属于四倍
体。因此,虽然4种麻黄属植物的核型均为2A型,
但综合分析,笔者认为膜果麻黄可能是较木贼麻黄、
草麻黄和中麻黄更为原始的类型。研究麻黄属植物
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种间亲缘关系及演化趋向,还应从各物种不同居群
采集样本进行细胞学分析,并结合其地理分布和生
境、形态特征及分子生物学等方面的研究结果综合
考虑,才能得出符合实际的正确结论。
[参考文献]
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Stainingandslidepreparingtechniqueofmitoticchromosomesand
applicationinkaryotypedeterminationofEphedra
WUJiling1,LISheng1,JIANGHanyu1,GAOYuhong2,NIUJunyi2
(1.ColegeofLifeSciences&Technology,Lanzhou730070,China;
2.ColegeofAgronomy,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China)
[Abstract] Objective:TostudythekaryotypeoffourEphedraplantsinordertoprovidethecytologicevidenceforthegenetic
diversityandidentificationgeneticresourcesofEphedra.Method:Therootsofgerminatingseedswereusedtostudythekaryotypeof
fourEphedraplantsbystainingandslidepreparingtechniqueofmitoticchromosomes.Result:theoptimalrootsamplingtimewas
about10∶20-10∶40am.Using0.002mol·L-18Hydroxyquinolinetopretreatingtheintravitalroottips,theoptimalpretreatment
timeforE.Sinica,E.intermedina,E.equisetinaandE.przewalskiwas4,5,4.5and3.5h,respectively.E.przewalskiandE.eq
uisetinawerediploid,E.SinicaandE.intermedinawerebelongedquadruple.Thekaryotypeformulaeofthefourspecieswere2n=
2x=14=2M+8m+4sm,2n=2x=14=10m+4st,2n=4x=28=20m(2SAT)+8st,and2n=4x=28=20m(SAT)+6st+2sm,
respectively.Conclusion:AlthekaryotypesoffourEphedraspecieswere2Atype,whichwasthesymmetrickaryotype.
[Keywords] Ephedra;mitosis;chromosome;karyotype
[责任编辑 吕冬梅]
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