全 文 ：复方五味子素 M对人结肠癌耐奥沙利铂细胞株
NJ<5()$%=OP4的逆转作用及其机制的研究
徐秋玲! 金秀东!! 郑学芝! 张绪东! 刘桂莲! 孙卫
牡丹江医学院 生理教研室!黑龙江 牡丹江 %$#
$摘要%!目的&研究复方五味子素 M对结肠癌耐药细胞株 NJ<5()$%=OP4的逆转作用及其作用机制( 方法#采用 9NN
比色法检测奥沙利铂!OP4和复方五味子素 M!
;
8<的细胞毒性) 碱性磷酸酶免疫组织化学法和 ZQS@QC2 ]V/@检测
;
8<对
NJ<5()$%=OP4细胞9>G 蛋白水平的影响( 结果#
;
8d
对人结肠癌细胞!NJ<5()$%和耐奥沙利铂
人结肠癌细胞!NJ<5()$%=OP4无显著毒性作用$ OP4对 NJ<5()$% 的 :<
$
为 $f$# 0D-Fd$对 NJ<5()$%=OP4的 :<
$
为
+f)+ 0D-F
d
$ NJ<5()$%=OP4较NJ<5()$% 对OP4耐药 )* 倍$
;
8d
能使 OP4对 NJ<5()$%=OP4
细胞的:<
$
从 +f)+ 0D-Fd依次下降至 $f)%$$$f+($$f$% 0D-Fd$逆转倍数分别为 #f+$(f$&$f% 倍( 碱性磷酸酶免疫
组织化学法和ZQS@QC2 ]V/@检测
;
8d
处理 &( ?后$NJ<5()$%=OP4细胞9>G 表达明显降低( 结论#
;
8<具有
逆转耐奥沙利铂人结肠癌细胞的9I>作用$其作用机制与下调9>G 表达有关(
$关键词%!复方五味子素M)奥沙利铂)NJ<5()$%=OP4细胞)多药耐药)多药耐药相关蛋白
$稿件编号%!+$$*$*$&$$
$基金项目%!黑龙江省自然科学基金项目!I+$$()
$通信作者%!!金秀东$NQV#!$&)#(+#5)(&($H50BRV#0U17`V3
SR2Bf./0
$作者简介%!徐秋玲$讲师$牡丹江医学院生理教研室工作$佳木斯
大学在读硕士研究生
!!结肠癌是常见的恶性肿瘤之一$肿瘤的多药耐
药性!0WV@RUCWDCQSRS@B2.Q$9I>是当前结肠癌治疗
的主要障碍*+ ( 现有的多药耐药性逆转药物由于
作用机制单一%选择性差%副作用大等缺点$临床治
疗效果不佳( 因此$寻找低毒%有效%作用靶点广泛
的治疗肿瘤多药耐药性的方法意义重大( 本实验以
中药五味子%芦荟和黄芪中的有效成分五味子乙素%
芦荟大黄素以及黄芪多糖为研究对象$观察 ) 种成
分组成的复方五味子素M!
;
8<对结肠癌耐药细胞
株NJ<5()$%=OP4的逆转作用及其可能机制$为寻
找高效%低毒 9I>逆转剂以防治结肠癌奠定实验
基础(
!材料和方法
]!细胞!人结肠癌细胞!NJ<5()$%%耐奥沙利
铂结肠癌细胞!NJ<5()$%=OP4购于天津赛尔生物
技术有限公司( NJ<5()$%$NJ<5()$%=OP4用含
$g热灭活新生牛血清的 >G9:#&$ 培养基于 )%
h$g+
条件下培养$ NJ<5()$%=OP4细胞的培
养液中含有 +f 0D-FdOP4以稳定其耐药表型(
]!试剂和药品!新生胎牛血清!杭州四季青公
司)>G9:#&$ 培养基!:2cR@C/DQ2公司)胰蛋白酶%
四甲基偶氮唑蓝 9NN! 8RD0B公司)奥沙利铂
!OP4$江苏恒瑞医药股份有限公司)五味子乙素
!成都思科华生物技术有限公司)芦荟大黄素!UQV5
@B天然有机化合物信息中心)黄芪多糖!惠州市东
方植物保健有限公司)I4M显色试剂盒!北京中杉
金桥)鼠抗人9>G 单克隆抗体!8RD0B公司(
]&!9NN比色法测定
;
8<对肿瘤细胞增殖的影响
!取对数生长期细胞NJ<5()$% 和NJ<5()$%=OP4$
以 )f$ i$个=F接种于 *# 孔培养板$每孔 $$

F$
在 )% h$g+
条件下培养 +& ? 后更换培养液(
分 & 组$
;
8<组#给予不同浓度
;
8为标准$终浓度分别为 #$+f$+ 0D-Fd)OP4
组#给予不同浓度OP4!终浓度分别为 $$+$$&$ 0D
-F
d
)阴性对照组!;<#细胞培养体系中不加药
物) 空白对照组#加含相应浓度药物的培养液$每组
设 # 个复孔( 培养 &( ?后$每孔分别加入 D-Fd
的9NN+$

F$)% h 孵育 & ?$弃上清$加入 $

F
的I98O$在平板摇床微振荡 $ 0R2后$用酶标仪在
波长 &*$ 20处测每孔吸光度 #$取 # 孔均值$细胞
抑制率 :>e* d!#给药组 d#空白对照组=!#阴性对照组 d
#空白对照组+ i$$g$并求出半数抑制浓度!:<$$以
-%*-
第 ) 卷第 * 期
+$$ 年 月
!!!!!! ! ! ! ! !!!!!! ! ! ! !
\/Vf)$ :SSWQ!*
9B6$ +$$
上实验重复 ) 次( 耐药倍数 e耐药株 :<
$
=敏感株
:<
$
)逆转倍数 e耐药株 :<
$
!OP4=耐药株 :<
$
!OP4m
;
8<(
]Y!碱性磷酸酶免疫组织化学法检测
;
8<对NJ<5
()$%=OP4细胞9>G 蛋白水平的影响!选择对数
生长期NJ<5()$%=OP4细胞$调整细胞数为 ) i$
个=0F接种于含盖玻片的 # 孔培养板中$每孔 +
0F$+& ?后更换培养液( 分 & 组$OP4组!OP4+$
0D-F
d
)OP4mM组!OP4+$ 0D-Fd$
;
8<+f
0D-F
d
)空白对照组#含相应浓度药物的培养液)
阴性对照组#细胞培养体系中不加药物$每组 个复
孔$&( ?后$按试剂盒说明做免疫组化( 图像分析#
在显微镜下摄取图像$每组 张片$每张片随机选 &
个视野$在 &$$ 倍下用 9:85+$$$ 8G图像分析系统
的R0BDQAC/f$ 程序分析测量平均吸光度$即代表
9>G 的表达水平(
]$!ZQS@QC2 ]V/@检测
;
8<对NJ<5()$%=OP4细胞
9>G 蛋白水平的影响!取对数生长期的 NJ<5
()$%=OP4细胞$调整细胞数为 ) i$个=0F!分组
同 ]Y继续培养 &( ?$提取总蛋白$做 ZQS@QC2 ]V/@
观察耐药细胞9>G 蛋白水平变化( 应用图象分析
仪对条带进行扫描$以 L4GIJ为参照$对目的基因
的表达水平进行半定量分析(
][!统计学处理!计量资料用
$
8k$表示$两样本
均数比较用检验$不同处理组率的比较采用
)
+检
验$采用 8G88$f$ 统计软件进行统计学处理(
!结果
]!
;
8<对 NJ<5()$% 和 NJ<5()$%=OP4细胞生
!!
长的影响!
;
8<对 NJ<5()$% 细胞和 NJ<5()$%=
OP4细胞无显著毒性作用$其:>均小于 #f$g(
]!OP4对 NJ<5()$% 和 NJ<5()$%=OP4细胞生
长的影响!OP4对NJ<5()$% 细胞生长抑制的影响
与对照组比有统计学意义!9l$f$$随着药物剂
量的增加$OP4对细胞生长的抑制作用显著增强(
OP4对 NJ<5()$%=OP4细胞生长抑制的影响与对
照组比无统计学意义!表 (
表 !OP4对NJ<5()$% 和NJ<5()$%=OP4细胞生长
的抑制作用!
$
8k$$-e# g
OP4
=0D-F
d
抑制率
NJ<5()$% NJ<5()$%=OP4
;< &f&$ k$f$ +f$ k$f$
$
f$ k$f$

+f# k$f$*
+$
#f#* k$f$+

+f++ k$f)
&$
(f$& k$f$)

+f+) k$f#
!!注#与;<组相比9l$f$(
]&!
;
8<对OP4对NJ<5()$%=OP4的 :<
$
影响!
OP4对NJ<5()$%=OP4的:<
$
为 +f)+ 0D-Fd$而
NJ<5()$% 为 $f$# 0D-Fd$ NJ<5()$%=OP4较亲
本NJ<5()$% 对OP4耐药 )* 倍(
;
8<在 # j+ 0D
-F
d对 NJ<5()$%=OP4和 NJ<5()$% 细胞无明显
细胞毒作用$但当与OP4联合用药时$可使OP4的
:<
$
明显下降(
;
8d
能使
OP4对 NJ<5()$%=OP4的 :<
$
从 +f)+ 0D-Fd依
次下降至 $f)%$$$f+($$f$% 0D-Fd$逆转倍数
分别为 #f+$(f$&$f%$且对敏感细胞 NJ<5()$% 有
增敏作用!表 +(
表 +!
;
8<降低OP4对NJ<5()$% 及NJ<5()$%=OP4的:<
$
!
$
8k$$-e
;
8<
=0D-F
d
:<
$
=0D-F
d 逆转倍数
NJ<5()$% NJ<5()$%=OP4 NJ<5()$% NJ<5()$%=OP4
;< $f$* k$f$$+ +f)+$ k$f$$ f$ f$
#f$ $f$)# k$f$$ $f)%$ k$f$$ f#
#f+

+f $f$+( k$f$$) $f+( k$f$$& +f
(f

+ $f$) k$f$$+ $f$% k$f$$# &f
&$f%

!!注#与;<组相比9l$f$!表 ) 同(
]Y!碱性磷酸酶免疫组织化学法检测
;
8<对
NJ<5()$% =OP4耐药细胞 9>G 蛋白水平影响
!免疫组化染色显示 !图 $棕黄色颗粒为阳
性结果$9>G 特异地表达于细胞膜$也可表达
于细胞浆$软件分析平均吸光度结果显示$对照
组与 OP4组差别无统计学意义$OP4mM组与
OP4组和对照组相比能明显降低 9>G 的
表达(
]$!ZQS@QC2 ]V/@检测
;
8<对NJ<5()$%=OP4耐药
细胞9>G 蛋白水平影响!与对照组比$OP4组
9>G 表达无明显变化$OP4mM组9>G 表达明显
降低!表 )(
-(*-
第 ) 卷第 * 期
+$$ 年 月
!!!!!! ! ! ! ! !!!!!! ! ! ! !
\/Vf)$ :SSWQ!*
9B6$ +$$
4f对照组)MfOP4组)图 !
;
8<对NJ<5()$%=OP4耐药细胞9>G 蛋白水平影响! i&$$
表 )!9>G 蛋白相对表达水平
分组 9>G I4GIJ 9>G=I4GIJ
;< )f+ )f $f+# k$f$+
OP4 +*f%) )&f* $f++$ k$f$&+
OP4mM %f*# )&f)
$f)& k$f$+

!!注# 9>G=L4GIJ为 9>G 目的条带的吸光度值与条带面积
的乘积=L4GIJ目的条带的吸光度值与条带面积的乘积(
&!讨论
本研究发现
;
8<能增强 OP4对 NJ<5()$%=
OP4细胞的抑制增殖作用$显著降低 OP4对 NJ<5
()$%=OP4细胞的 :<
$
$提示
;
8<对 OP4抗 NJ<5
()$%=OP4具有较好的化疗增敏作用(
多药耐药相关蛋白!0WV@RUCWDCQSRS@B2.QAC/@QR2
$9>G定位于人染色体 #`)f$编码的 9>G是
相对分子质量为 *$ [U 的跨膜蛋白( 9>G主要定
位于细胞膜$也可分布于胞浆中$9>G 高表达可以
使细胞内药物浓度降低或分布改变*++ ( 文献报道
结肠癌组织9>G 的表达与结肠癌对化疗药物的敏
感性有关$9>G 阳性的结肠癌患者对 4I9$\G5
#$99<$OP4等化疗药物的敏感性下降$并且
9>G 的表达情况与结肠癌的分化%侵袭%转移等存
在一定关联$9>G 的表达是结肠癌产生内源性耐
药的重要因素*)+ ( 本实验以耐药细胞株NJ<5()$%=
OP4为研究对象$采用
;
8<和OP4联合应用$通过
免疫组织化学法和 ZQS@QC2 ]V/@检测$发现
;
8<可
以降低 9>G 在 NJ<5()$%=OP4中的表达$说明
;
8<能够提高 OP4药物敏感性(
;
8<不仅具有化
疗药物增敏作用$还可促进化疗药物的抗肿瘤活性$
;
8<治疗和逆转结肠癌 9I>的作用仍需要更多的
体内体外研究来阐明其潜在机制并为其临床应用提
供理论依据(
$参考文献%
*+!\RSQ2@R2 9$ 8R0WVB9G$ 8BC@/CE$ Q@BVfIQ2@RTR.B@R/2 /TAC/@QR2S
BSS/.RB@QU @/0WV@R5UCWDCQSRS@B2.QR2 F/\/?W0B2 ./V/2 .B2.QC
.QVS*X+f:2@XO2./V$ +$$*$ )& !#+(f
*++!8B2.?QY<$ 9Q2U/YBG$$Q@BVfH7ACQSSR/2 /T0WV5
@RUCWDCQSRS@B2.QAC/@QR2SR2 AC/S@B@Q.B2.QCRSCQVB@QU ,R@? .QVSQ25
SR@RcR@6@/.?Q0/@?QCBAQW@R.UCWDS*X+fGC/S@B@Q$ +$$*$ #*!)#
&&(f
*)+!M/@[QI$ b/6.?QcI$ MWSSQ4$Q@BVfECB.@R/2B@QU RCBURB@R/2 .B2
R2UW.QTW2.@R/2BV6CQVQcB2@0WV@RUCWDCQSRS@B2.QDQ2QB2U AC/@QR2
Q7ACQSSR/2 R2 ?W0B2 @W0/C.QVVR2QS*X+f>BURB@>QS$ +$$($%$
!#&f
$责任编辑!张宁宁%
-**-
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\/Vf)$ :SSWQ!*
9B6$ +$$