全 文 ：ＲＰＨＰＬＣ法测定２０（Ｓ）原人参二醇
药质体含量及包封率
韩美华１，陈　婧２，陈士林１，王向涛１
（１．中国医学科学院 药用植物研究所，北京 １００１９３；
２．哈尔滨商业大学 生命科学与环境科学研究中心 药物研究所 抗肿瘤天然药物教育部工程研究中心，
黑龙江 哈尔滨 １５００７６）
［摘要］　目的：建立２０（Ｓ）原人参二醇药质体含量及包封率的测定方法。方法：采用 ＲＰＨＰＬＣ法。色谱条件：ＣＯＳＭＯ
ＳＩＬ５Ｃ１８ＭＳⅡ色谱柱（４６ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ）；流动相 甲醇水（９５∶５）；流速１０ｍＬ·ｍｉｎ－１；检测波长２０３ｎｍ；柱温２５℃；
进样量５０μＬ；采用低温超速离心法分离ＰＰＤ药质体中的游离药物。结果：在上述色谱条件下豆磷脂和试剂对药物的测定无
干扰，２０（Ｓ）原人参二醇在０１～０５ｇ·Ｌ－１与峰面积的线性关系良好（ｒ＝０９９９９），回收率在１０１４４％ ～１０３１１％，日内及
日间ＲＳＤ均小于２％（ｎ＝３）。结论：ＲＰＨＰＬＣ法可用于２０（Ｓ）原人参二醇药质体含量及包封率的测定。
［关键词］　２０（Ｓ）原人参二醇；药质体；包封率；反相高效液相色谱法
［收稿日期］　２００８１１０５
［基金项目］　国家自然科学基金项目（３０６００７８７）；中央级公益性科
研院所基本科研业务专项药植所重点项目（ＹＺ１２３）
［通信作者］　王向涛，副研究员，主要从 事树枝状聚合物和新型
脂质体纳米粒的研究。Ｔｅｌ：１３６８３３７１７０３，Ｅｍａｉｌ：ｘｔａｏｗａｎｇ＠１６３．ｃｏｍ
［作者简介］　韩美华，在站博士后，主要从事改善难溶性药物生物
利用度的研究。Ｔｅｌ：１３３６６３８９１９７，Ｅｍａｉｌ：ｈａｎｍｅｉｈｕａ７２７＠１６３．ｃｏｍ
　　２０（Ｓ）原人参二醇 （ｐｒｏｔｏｐａｎａｘｄｉｏｌ，ＰＰＤ）为从
西洋参 ＰａｎａｘｑｕｉｎｑｕｅｆｏｌｉｕｍＬ．茎叶中提取、分离、
转化而得到的人参皂苷元［１］。人参皂苷为人参属
植物中的主要生物活性成分，属于四环三萜类化
合物。按化学结构的不同可将人参皂苷分为原人
参二醇型、原人参三醇型和齐墩果酸型 ３大类。
国外学者报道了原人参二醇型次级皂苷，如 ２０
（Ｓ）人参皂苷 Ｒｇ３，Ｒｈ２及其 ＰＰＤ的体外抗癌活
性，表明这３种化合物均具有较强的抑制肿瘤细
胞生长作用，其中 ＰＰＤ的体外抑瘤作用最强［２４］。
有关 ＰＰＤ的制备方法很多［５６］，但对其制剂的报道
较少，文献中相关药理实验多采用 ＰＰＤ的羧甲基
纤维素钠混悬液［７８］。由于 ＰＰＤ水溶性差（大约３
μｇＰＰＤ需水１ｍＬ），作者所在的课题组及合作伙
伴在前期研究中发现 ＰＰＤ的生物利用度较低，这
在一定程度上限制了其临床疗效的发挥。鉴于
ＰＰＤ具有和胆固醇类似的结构，故尝试以 ＰＰＤ取
代胆固醇制备脂质体（药质体），借助于脂质体能
使药物以较高的浓度分散在肠液，并被肠黏膜吸
收。有关 ＰＰＤ药质体的设想和研究在国内外尚未
见相关报道［９］。为了控制所制药质体的质量，采
用 ＲＰＨＰＬＣ法，测定药质体的含量及包封率。实
验结果表明，该法灵敏度高、专属性好、方便快捷，
为制剂的质量评价、质量控制提供了依据。
１　材料
ＫＱ３２００ＤＢ型数控超声波清洗器（昆山市超声
仪器有限公司）；旋转蒸发仪 ＲＥ５２ＣＳ（上海振捷实
验设备有限公司）；ＳＨＢⅢ循环水式多用真空泵（郑
州长城科工贸有限公司）；数控升降浴锅 Ｗ２２０（上
海振捷实验设备有限公司）；Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００Ｓｅｒｉｅｓ高
效液相色谱仪（Ｄｉｏｎｅｘ）；ＣＯＳＭＯＳＩＬ５Ｃ１８ＭＳⅡ色
谱柱（Ｗａｔｅｒｓ，ＮａｃａｌａｉＴｅｓｑｕｅＩｎｃ．Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）；ＡＴ
９５０Ｈｅａｔｅｒａｎｄｃｏｏｌｅｒ柱温箱（天津奥特赛恩斯仪器
有限公司）；ＢｅＣＫＭＡＮＣＯＵＬＴＥＲＯｐｔｉｍａＴＭ Ｌ８０ＸＰ
Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ。
２０（Ｓ）原人参二醇（上海中药创新研究中心提
供，纯度＞９９％，批号０８０７０８）；豆磷脂 （郑州四维
磷脂技术有限公司）；药质体（自制，批号 ２００８１０２５，
２００８１０２６，２００８１０２７）；其他试剂均为分析纯。
２　方法与结果
２．１　药质体的制备　首先对药质体的制备方法、磷
脂与ＰＰＤ的比例、超声温度进行了考察，结果表明
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采用薄膜超声法制备的药质体呈蓝色乳光溶液，而
反相蒸发法制备的药质体呈白色乳状溶液；磷脂与
ＰＰＤ制备药质体的最高摩尔比为５∶３；在６０℃超声
得到的药质体呈蓝色乳光溶液，而在 ３０℃超声得
到的药质体呈白色乳状溶液。
精密称取豆磷脂和 ＰＰＤ（豆磷脂ＰＰＤ摩尔比
５∶３），置茄形瓶中，以适量氯仿溶解。３０℃减压旋
转蒸发除去有机溶剂，使在瓶壁上形成均匀干燥的
薄膜；加入一定体积的水相，使药质体的质量浓度
为１０ｇ·Ｌ－１（药质体浓度按磷脂的浓度来计算），
常温水化３０ｍｉｎ，６０℃超声３０ｍｉｎ，即得。
２．２　色谱条件　ＣＯＳＭＯＳＩＬ５Ｃ１８ＭＳⅡ色谱柱
（４６ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ）；流动相甲醇水（９５∶５）；
柱温２５℃；流速１０ｍＬ·ｍｉｎ－１；检测波长２０３ｎｍ；
进样量５０μＬ。取豆磷脂和 ＰＰＤ对照品溶液，进样
分析，见图１，由图１可见在此色谱条件下，豆磷脂
和试剂对药物测定无干扰，ＰＰＤ峰的相对保留时间
约为 ９４ｍｉｎ。
图１　ＰＰＤ（１）和豆磷脂分离ＨＰＬＣ图
２．３　标准曲线的制备　精密称取２００ｍｇＰＰＤ，置
于１０ｍＬ量瓶中，用甲醇溶解，并定容至刻度，得
ＰＰＤ对照品储备液。精密吸取储备液 ０５，１０，
１５，２０，２５ｍＬ分别置于１０ｍＬ量瓶中，甲醇定
容，得０１，０２，０３，０４，０５ｇ·Ｌ－１的 ＰＰＤ溶液，
吸取各浓度溶液５０μＬ各测定３次，在以上的色谱
条件下取平均峰面积 Ａ对质量浓度 Ｃ进行线性回
归，得线性方程 Ａ＝３５４９３Ｃ－０３９４７（ｒ＝
０９９９９），线性范围０１～０５ｇ·Ｌ－１。
２．４　精密度和重复性试验　按２．３项下方法配制
ＰＰＤ对照品溶液０１５，０２５，０４０ｇ·Ｌ－１低、中、
高３种浓度，于２，４，６，８，１０ｈ测定，计算日
内精密度，结果日内ＲＳＤ分别为０１１％，００９％，
０１６％（ｎ＝３）；于１，２，３，４，５ｄ测定，计算日
间精密度，结果日间ＲＳＤ分别为０２９％，０２１％，
０１２％（ｎ＝３）。
２．５　回收率试验　取已知含量的药质体约０５ｍＬ
（约含ＰＰＤ１５ｍｇ），按低、中、高３种浓度，分别加
入０７５，１５，３０ｍｇＰＰＤ冻干，然后将粉末用甲醇
溶解置于１０ｍＬ量瓶中，并定容至刻度，分别进样
５０μＬ，测定峰面积，通过标准曲线计算 ＰＰＤ的总
量，计算回收率，见表１。
２．６　检测限和定量限　将 ＰＰＤ对照品溶液稀释成
　　 表１　ＰＰＤ加样回收率（ｎ＝３）
加入量／ｍｇ 测定量／ｍｇ 回收率／％ 平均值／％ ＲＳＤ／％
０７５ ２２７ １０２６７ １０３１１ ０１９
０７５ ２２７ １０２６７ 　 　
０７５ ２２８ １０４００ 　 　
１５０ ３００ １００００ １０１７８ ０８３
１５０ ３０３ １０２０１ 　 　
１５０ ３０５ １０３３３ 　 　
３００ ４５５ １０１６７ １０１４４ ０１０
３００ ４５４ １０１３３ 　 　
３００ ４５４ １０１３３ 　 　
　　注：样品中含ＰＰＤ１５ｍｇ。
不同浓度进行ＨＰＬＣ分析，测得其检测限（Ｓ／Ｎ＝３）
为２５０ｎｇ，定量限（Ｓ／Ｎ＝１０）为６２５ｎｇ。
２．７　样品测定　精密量取 ＰＰＤ药质体０５ｍＬ于
１００ｍＬ量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀、滤过，
取续滤液作为供试品溶液，进样 ５０μＬ，测定峰面
积；另取 ＰＰＤ对照品配成 ０１５ｇ·Ｌ－１的溶液，按
２３项下方法测定，用外标法计算供试品中 ＰＰＤ的
含量，见表２。
表２　ＰＰＤ在３批样品中的质量分数（ｎ＝５）
样品批次 质量分数／％ ＲＳＤ／％
２００８１０２５ ９６６９ １５６
２００８１０２６ ９６４１ ０４１
２００８１０２７ ９９１２ ０３４
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２．８　包封率的测定　取 ＰＰＤ药质体 １０ｍＬ于
ＢｅＣＫＭＡＮ离心管中，以纯水稀释至 １０４ｍＬ，在
１０℃条件下以６万 ｒ·ｍｉｎ－１离心１０ｈ，沉淀用甲
醇溶解并定容至１００ｍＬ，ＨＰＬＣ测 ＰＰＤ含量，即为
被药质体包封的ＰＰＤ量Ｗｄｒｕｇ；另取对应ＰＰＤ药质体
１０ｍＬ，不经离心直接冻干后，用甲醇溶解并定容
至１００ｍＬ，ＨＰＬＣ测定 ＰＰＤ含量，得对应药质体混
悬液中的总药量 Ｗｔｏｔ。按公式：包封率 ＝Ｗｄｒｕｇ／
Ｗｔｏｔ×１００％计算包封率。结果药质体的包封率为
（８０８４±０５３）％。
３　讨论
本研究尝试用超速离心法测定 ＰＰＤ的包封率。
先对离心条件进行了考察，结果显示在１０℃条件下
以６万 ｒ·ｍｉｎ－１离心１０ｈ可以把脂质体和药质体
完全离心下来。离心后的上清液以氯仿反复萃取，
萃取液浓缩后进行ＴＬＣ检识，未发现上清液中有磷
脂分子残留，即上清液中没有残留的脂质体和药质
体。将脂质体和 ＰＰＤ的游离药物溶液混匀后在选
定的条件下超速离心，并对离心后的上清液和离心
前的混合液中的 ＰＰＤ通过 ＨＰＬＣ标准曲线方程进
行含量测定。结果离心后上清液中 ＰＰＤ的含量为
离心前混合液中ＰＰＤ含量的（９８６７±０９０）％（ｎ＝
３），说明离心对 ＰＰＤ游离药物没有影响，游离的
ＰＰＤ也不会吸附在脂质体表面而在离心时被随之沉
淀下去。以上说明用超速离心法测量 ＰＰＤ的包封
率是可靠的。
作者建立了 ＰＰＤ药质体含量和包封率测定的
ＲＰＨＰＬＣ方法。ＰＰＤ为脂溶性药物，在水中不溶，
而易溶于甲醇、乙醇和氯仿等有机溶剂。以９５％的
甲醇溶液为流动相，相对保留时间适宜，豆磷脂和试
剂对ＰＰＤ的测定无干扰。ＰＰＤ在０１～０５ｇ·Ｌ－１
线性关系良好、回收率高、重复性好，能准确快速地
进行含量测定。包封率是脂质体制剂的一个重要指
标。常用于分离脂质体制剂中游离药物的方法有凝
胶柱色谱法、离心法和透析法等。凝胶柱色谱法常
用的葡聚糖凝胶价格昂贵，而且操作时间也长。渗
析法也较复杂，且样品易损失。
本研究尝试用低温超速离心法测定 ＰＰＤ的包
封率。利用药物与药质体在分散介质中的密度差，
选择合适的转速和离心时间，可有效分离游离药物，
获得较为准确的包封率数据，有利于药质体的处方
筛选和质量评价。
［参考文献］
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Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｃｏｎｔｅｎｔａｎｄｅｎｔｒａｐｍｅｎｔｅｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆ
２０（Ｓ）ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｄｉｏｌｉｎｐｈａｒｍａｃｏｓｏｍｅｓｂｙＲＰＨＰＬＣｍｅｔｈｏｄ
ＨＡＮＭｅｉｈｕａ１，ＣＨＥＮＪｉｎｇ２，ＣＨＥＮＳｈｉｌｉｎ１，ＷＡＮＧＸｉａｎｇｔａｏ１
（１．ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ＆ＰｅｋｉｎｇＵｎｉｏｎＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｅｇｅＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＭｅｄｉｃｉｎａｌＰｌａｎｔＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，
Ｂｅｉｊｉｎｇ１００１９３，Ｃｈｉｎａ；
２．ＨａｒｂｉｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣｏｍｍｅｒｃｅ，ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔＳｃｉｅｎｃｅＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒ，ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒｏｆ
ＮａｔｕｒａｌＡｎｔｉｃａｎｃｅｒＤｒｕｇｓ，ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｈａｒｂｉｎ１５００７６，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａＲＰＨＰＬＣｍｅｔｈｏｄｆｏｒｃｏｎｔｅｎｔａｎｄｅｎｔｒａｐｍｅｎｔｅｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆ２０（Ｓ）ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｄｉｏｌｉｎ
ｐｈａｒｍａｃｏｓｏｍｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄ：ＴｈｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄｗｉｔｈａＣＯＳＭＯＳＩＬ５Ｃ１８ＭＳⅡ ｃｏｌｕｍｎ（４６ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ）ｕｓｉｎｇ
ｍｅｔｈａｎｏｌｗａｔｅｒ（９５∶５）ａｓｔｈｅｍｏｂｉｌｅｐｈａｓｅａｎｄｄｅｔｅｃｔｅｄａｔ２０３ｎｍ．Ｔｈｅｆｌｏｗｒａｔｅｗａｓ１０ｍＬ·ｍｉｎ－１ａｎｄ５０μＬｓａｍｐｌｅｓｏｌｕｔｉｏｎｗａｓ
ｉｎｊｅｃｔｅｄｆｏｒｅａｃｈｔｉｍｅ．Ｒｅｓｕｌｔ：Ｔｈｅｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎｃｕｒｖｅｗａｓｌｉｎｅａｒｗｉｔｈｉｎｔｈｅｒａｎｇｅ０１０５ｍｇ·ｍＬ－１（ｒ＝０９９９９），ｔｈｅｉｎｔｒａｄａｙＲＳＤ
ａｎｄｉｎｔｅｒｄａｙＲＳＤｗｅｒｅｌｅｓｓｔｈａｎ２％ ａｎｄｔｈｅａｖｅｒａｇｅｒｅｃｏｖｅｒｙｗａｓｂｅｔｗｅｅｎ１０１４４％１０３１１％ （ｎ＝３）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅｍｅｔｈｏｄ
ｉｓｓｉｍｐｌｅ，ａｃｃｕｒａｔｅ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｅａｎｄａｐｐｌｉｃａｂｌｅｆｏｒｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｃｏｎｔｅｎｔａｎｄｅｎｔｒａｐｍｅｎｔｅｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆ２０（Ｓ）ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｄｉｏｌｐｈａｒｍａ
ｃｏｓｏｍｅｓ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］　２０（Ｓ）ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｄｉｏｌ；ｐｈａｒｍａｃｏｓｏｍｅｓ；ｅｎｔｒａｐｍｅｎｔｅｆｉｃｉｅｎｃｙ；ＲＰＨＰＬＣ
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第３４卷第９期
２００９年５月
　　　　　　 　 　 　 　 　　　　　　 　 　 　 　
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