全 文 :·1838· 中草蒋 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第12期2008年12月
肿瘤和抑制蛋白激酶活性,且在人的肿瘤细胞中能
选择性地抑制表皮生长因子受体(EGFR)[3]。蒲葵
果实水提取物和乙醇提取物体外有抑制细胞增殖,
抗氧化作用,在非特异性酯酶实验中,乙醇提取物还
能诱导HL一60细胞的单核细胞或巨噬细胞分化且
有剂量依赖性n引。
本实验通过对蒲葵籽的4个提取物进行初筛,
表明蒲葵籽的醋酸乙酯提取部分(P3)具有体外抗
HIV一1活性。P3能阻断HIV一1慢性感染细胞与正
常细胞的融合,提示其作用靶点或靶点之一可能为
阻断病毒进入细胞。通过基因工程重组HIV—l蛋白
酶和逆转酶的体外活性抑制实验,发现提取物P3
能有效的抑制蛋白酶活性,也有微弱的抑制逆转录
酶活性。由此可见,蒲葵籽的醋酸乙酯提取物具有较
强的体外抗HIV一1活性,其作用机制可能主要为阻
断病毒进入和抑制HIV一1蛋白酶活性。目前本课题
组正在对蒲葵籽的醋酸乙酯提取物P3进行进一步
的分离纯化,希望从中筛选出具有抗HIV活性的化
合物,明确其作用机制。
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20(S)一原人参二醇对肺癌A549细胞增殖和荷瘤裸小鼠
肿瘤生长的抑制作用
张锐,徐华丽,曲绍春,于小风,陈明侠,睢大贫+
(吉林大学药学院药理教研室,吉林长春130021)
摘 要:目的 研究20(S)一原人参二醇对小细胞肺癌A549细胞增殖和荷瘤裸小鼠肿瘤生长抑制作用。方法采
用噻唑蓝(MTT)法观察20(S)一原人参二醇对小细胞肺癌A549细胞增殖的抑制作用,流式细胞术测定20(S)一原
人参二醇对小细胞肺癌A549细胞凋亡及周期的影响,并在裸小鼠人肺癌模型E观察20(5)一原人参二醇对荷瘤裸
小鼠肿瘤生长的抑制作用。结果20(S)一原人参二醇对A549细胞具有明显的抑制作用并有剂量时间依赖关系,并
且流式细胞仪检测时均出现典型凋亡峰,24小时凋亡率分别为32.47%、32.75%、33.51%。荷瘤裸小鼠动物实验
表明,20(S)一原人参二醇对裸小鼠的肿瘤生长也具有明显的抑制作用,抑瘤率分别为18.78%、34.37%、50.02%。
结论20(S)一原人参二醇对A549细胞的增殖和荷瘤裸小鼠肿瘤的生长具有明显的抑制作用。
关键词:20(S)一原人参二醇;A549细胞;肺癌;裸小鼠
中图分类号:R286.91 文献标识码:A 文章编号:0253—2670(2008)12—1838—04
收稿日期:2008—03—29
基金项目:国家“九五”重点科技攻关课题(96—901—01—83)
作者简介:张锐(1978一),女,博士研究生,研究方向为抗肿瘤药物研究。Tel:(0431)85619705E—mail:zgrl219@163.com
*通讯作者睢大贫Tel:(0431)85619705E—mail:suidy@jlu.edu.cn
万方数据
中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第12期2008年12月·1839·
Inhibitionof20(S)一protopanaxadiolonproliferationoflungcancer
A549cellsandtumorg owthofnudemice
ZHANGRui,XUHua—li,QUShao—chun,YUXiao—feng,CHENMing—xia,SUIDa—yuan
(DepartmentofPharmacology。SchoolofPharmacy。JilinUn versity,Changchun130021。China)
Abstract:ObjectiveTostudytheffectsof20(5)一protopanaxadiol(PPD)ontheproliferationof
humanlungcarcinomaA549cellineandthetumorg owthofnudemice.MethodsHumanlung
carcinomaA549cellinewastreatedwithPPD.CellgrowthratewasdeterminedwithMTTassay.The
effectsofPPDonapoptosisrateandeellcyclew reobservedbytheflowcytometer.Thesubcutaneous
transDlantabletumormodelofhumanlungcancerinnudemicewasestablished.Thetumorinhibitoryrate
wascalculatedtoevaluatetheanti—tumoreffect.ResultsPPDcouldinhibittheproliferationofhuman
lungcarcinomaA549cellinatime—anddose—dependentmanner.Theapoptoticpeakwasobservedinthe
PPDgroupswiththeapoptosisrateof32.47%,32.75%,and33.51%in24h,respectively.AndPPD
inhibitedthgrowthof umanlungcarcinomaA549cellsinnudemicewiththetumorinhibitoryrateof
18.78%,34.37%,and50.02%.Conclusion20(S)一Protopanaxadiolcouldinhibittheproliferationof
lungcancerA549cellandthetumorg owthofnudemice.
Keywords:20(S)一protopanaxadiol(PPD);A549cell;lungcancer;nudemice
20(S)一原人参二醇(protopanaxadiol,PPD)
是从西洋参PanaxquinquefoliumL.的茎叶中提
取并开发利用的天然抗癌新药,具有广谱的抗肿瘤
作用n]。20(S)一原人参二醇对动物移植性肿瘤B16、
Lewis、H:。肿瘤、HepG2和HeI。a等癌细胞有较强
抑制生长作用,对HeLa细胞集落形成的抑制强度
超过原人参二醇Rg。[2。3;还能使乳腺癌、白血病、淋
巴癌等癌细胞发生程序性死亡,且癌细胞株凋亡率
随20(S)一原人参二醇浓度升高而增加【4’5]。近年来
研究表明20(S)一原人参二醇对非小细胞型肺癌有
显著疗效,且对多药耐药性及晚期癌症有明显抑制
作用L63;本实验采用20(S)一原人参二醇直接作用于
人肺癌A549细胞和荷瘤裸小鼠,观察20(S)一原人
参二醇对肺癌细胞和荷瘤裸小鼠肿瘤组织的生长抑
制作用。
1材料
1.1试剂与仪器:20(S)一原人参二醇(质量分数
98.5%)由浙江亚克药业有限公司提供,批号
020115。羧甲基纤维素钠(CMC,上海化学试剂公司
提供);注射用环磷酰胺(CTX,上海华联制药有限
公司提供,批号20040205,规格为200mg/支);人
肺癌A549细胞(中国科学院上海细胞生物研究所
提供),RPMI1640培养基(GibcolBRI。公司),胎
牛血清、二甲基亚砜(DMSO)、噻唑蓝(MTT)、胰
蛋白酶(上海生物工程有限公司);碘化丙啶(PI)
购于北京鼎国生物有限公司;RnaseA为Sigma产
品;超净工作台,C0:孵育箱,酶标仪(El×800
Bi02TEKInstruments)。
1.2 动物和细胞株:BALB/C裸小鼠,6~8周龄,
体质量18~22g,雌雄兼用,每批实验采用同一性
别,由中国医学科学院实验动物繁育场提供,合格证
号:SCXKll—00—0006,饲养于SPF级动物实验室。
人小细胞肺癌细胞株A549,购自中国科学院上海
细胞生物研究所。
2方法
2.1对A549细胞生长的抑制作用:取对数生长期
的A549细胞,调整细胞浓度为4×105/mI。,接种于
96孔培养板,细胞对照组(1%DMSO)和药物处
理组加入100肛I。细胞悬液,每组设3个复孑L,空白
对照组加入RPMI1640全培养基,每孑L100肛L。细
胞贴壁24h后,药物处理组分别加入终浓度为
12.5、25、50、100、200/J£mol/L20(S)一原人参二醇,
100ttL/孔,细胞对照组加入含l%DMSO的
RPMI1640培养液i00tLL/孑L,空白对照组只加入
RPMI1640培养液100tLL/孑L。将96孔培养板置于
37‘C、5%CO:培养箱分别培养12、24、36、48、72h
后,加入5mg/mLMTT10弘L,继续培养4h,弃上
清液,加入DMSO100ttL/孑L,溶解紫色结晶体,振
摇10min,待结晶溶解后置于酶标仪,测定570nm
的吸光度(A)值,计算抑制率[抑制率一(I一实验
组A值/对照组A值)×100%]。实验重复3次,将
作用时间和抑制率经一定变换后用非线性回归拟合
计算,求得作用24h的半数抑制浓度-In。)。
2.2对A549细胞凋亡及周期的影响:取对数生长
期的A549细胞,调整细胞数为5×105个,接种于6
孔培养板内,贴壁24h,分别加入终浓度为100、50、
万方数据
·1840· 中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第12期2008年12月
25/-mol/L的20(S)一原人参二醇,终质量浓度为
1肛g/mL的CTX。作用24h后,用胰酶消化细胞,
收集1×105个细胞于70%冰乙醇固定过夜,离心
弃掉乙醇,用PBS洗涤1次,将细胞重悬于300弘L
PBS中,加入RnaseA和PI室温避光染色30min,
流式细胞仪激发波长488nm检测凋亡率及各周期
细胞比例。每批实验重复3次。
2.3 裸小鼠人肺癌模型的建立:A549细胞在
37℃、5%C02,含10%胎牛血清的RPMI1640培
养基中培养,将处于对数生长期的细胞用0.25%胰
蛋白酶消化,用无菌PBS液重悬制成5×107/mL的
单细胞悬液,每只裸小鼠于右侧腹股沟区皮下接种
0.2mL细胞悬液,每天观察各注射点有无红肿破溃。
2.4抑瘤实验:造模7d后,注射局部出现明显皮
丘,所有裸鼠均出现直径8~10mm的皮下结节,移
植瘤模型建立。将40只裸小鼠随机分为5组,每组
8只,分为模型组,给予1%羧甲基纤维素钠;阳性
药对照组,给予CTX30mg/kg;20(S)一原人参二醇
大、中、小剂量组,分别给予20(5)一原人参二醇
100、50、25mg/kg。分组当日开始给药,1%羧甲基
纤维素钠和20(S)一原人参二醇每日ig给药,连续
15d,CTX隔日ip给药,共7次。观察肿瘤体积和生
长速度,停药后第2天处死裸鼠,称体质量,剥离瘤
组织,称取瘤质量,计算抑瘤率[抑瘤率一(1一实验
组平均瘤质量/对照组平均瘤质量)×100%]。
2.5 统计学处理:数据以z±5表示,采用SPSS
12.0统计学软件进行分析。
3 结果
3.1对A549细胞增殖的抑制作用:由图1可见随
着20(S)一原人参二醇浓度的升高,对细胞增殖的抑
制率也逐渐升高,不同浓度的20(S)一原人参二醇对
细胞均有抑制作用。同时,在显微镜下观察细胞的形
态变化,结果发现,在给药组中细胞皱缩、破裂、聚集
成团,培养液中散在细胞碎片,其24h的IC。。值为
39.75/比mol/L,说明20(S)一原人参二醇对A549细
胞增殖具有明显的抑制作用,且随着时间的增加抑
制作用加强,存在时间剂量关系。
3.2对A549细胞凋亡及周期的影响:流式细胞仪
分析显示,20(S)一原人参二醇组及CTX组均出现典
型的亚G。期凋亡峰,CTX组及100、50、25tL£mol/L
20(S)一原人参二醇组凋亡率分别为10.51%、
32.47%、32.75%、33.51%,各剂量20(S)一原人参
二醇组凋亡率均高于对照组及CTX组(P<0.05)。
20(S)一原人参二醇组细胞处于G。/G。期的比率明显
120
芝80
需
磊
嚣40
0
t,h
1~6-0.12.5、25、50、100、200pmol-L-120(S)一原人参二醇
1—6—0,12.5,25,50。100,200pmol·L一120(S)一protopanxadiol
图1 20(S)一原人参二醇对A549细胞的生长抑制作用
(i土s,n一3)
Fig.1Inhibitionof20(S)一protopanxadiolonproli—
ferationofA549cellsG土s,n一3)
高于对照组(P
殖指数下降,细胞生长受阻于G。/G,期,细胞趋于成
熟,见表1。
表1 20(S)一原人参二醇对A549细胞凋亡和周期的影响
(;士s,开一3)
Table1 Effectof20(S)一protopanaxadiolonapoptosis
andcycleofA549cells(工±s,n一3)
与对照组比较:‘尸
只裸小鼠在实验过程中均成活,各个细胞悬液接种
点未见红肿破溃及出血表现。在细胞悬液接种的第
7天,各个接种点均可见肿瘤结节,直径8~10mm。
在实验中观察到裸小鼠在给予20(5)一原人参二醇
后无异常表现。肿瘤组织从裸小鼠上剥离下来进行
肉眼观察,呈结节状,灰白色,质地偏硬,表面有假包
膜,容易与周围组织剥离,用药组肿瘤横断面大部分
可见中央出现明显的坏死灶,模型组则少见坏死灶。
3.4抑瘤实验:由表2可见,除CTX组外,20(S)一
原人参二醇各组裸小鼠实验前后体质量没有明显的
差异,在15d给药后,可明显抑制人小细胞肺癌在
裸鼠体内的生长,其抑瘤率为18.78%~50.02%
(P
中草焉 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第12期2008年12月- 841·
表2 20(S)一原人参二醇对人肺癌A549裸小鼠肿瘤生长
的抑制作用(;土s)
Table2 Inhibitionof20(S)一protopanaxadioI
ongrowthof umanlu gtumor
A549cellsinnudemice(;±s)
与模型组比较:‘尸
人参作为高档滋补珍品已有几千年的历史,人
参的主要活性成分是人参皂苷,人参皂苷具有抗疲
劳、延缓衰老、抑制肿瘤细胞生长、调节中枢神经系
统、提高机体免疫力、改善心脑血管供血不足等作
用L7]。关于抗肿瘤作用方面研究最多的是二醇组人
参皂苷20(S)一人参皂苷Rg。和Rh:,它们在抑制肿
瘤血管生成、降低肿瘤微血管密度、诱导肿瘤细胞凋
亡、抗肿瘤转移、对化疗药物减毒增效等方面具有较
广泛的抗肿瘤功效[8’9]。将人参皂苷Rg。的3位上的
末端葡萄糖水解掉可得到人参皂苷Rh:,再把人参
皂苷Rh:的3位上的最后一个葡萄糖水解掉就得到
20(S)一原人参二醇,20(S)一原人参二醇作为人参二‘
醇组皂苷化学水解及人肠道菌代谢的最终产物,有
可能比人参皂苷Rg。和人参皂苷Rh:具有更强的抗
癌活性、抗癌增效减毒作用以及增强机体免疫功能
的作用,而且生物利用度可能更高Ll⋯。利用高沸点
有机溶剂及碱催化降解方法制备了具有天然构型而
且产率较高的20(S)一原人参二醇,基本解决了常规
方法过程复杂、产率低、成本高的问题,并对其抗肿
瘤的作用进行了初步的研究。
本研究采用MTT法观察20(5)一原人参二醇
对人小细胞肺癌A549细胞增殖的影响,结果表明
20(S)一原人参二醇对A549细胞的增殖具有明显的
抑制作用,随着药物浓度的增加,这种抑制作用也逐
渐增强,并且呈现一定的剂量依赖关系;此外,流式
细胞仪结果显示,经20(S)一原人参二醇处理24h
后的A549细胞出现典型的亚G,期凋亡峰,且20
(S)一原人参二醇阻止肿瘤细胞生长于G。/G。期,初
步结果表明20(5)一原人参二醇对A549细胞的杀
伤作用可能由于其对A549细胞凋亡的诱导;在动
物实验中,可以看到20(S)一原人参二醇组肿瘤质量
和模型组的肿瘤质量相比具有显著性差异(P<
0.001),说明20(S)一原人参二醇对荷瘤裸鼠的肿瘤
生长具有明显的抑制作用。
肺癌的发生是多因素综合作用的结果,很难从
单一因素变化来确定其发病机制。本实验只说明了
20(S)一原人参二醇对A549细胞的增殖和荷瘤裸鼠
肿瘤生长具有抑制作用,其具体的作用机制仍有待
深入研究。但20(S)一原人参二醇作为具有抗肿瘤作
用的单体皂苷,其抗肿瘤生长的作用机制可能与其
诱导肿瘤细胞凋亡、抗肿瘤转移、清除肿瘤细胞和组
织内的自由基、提高抗氧化水平、通过调控基因表达
和信号传导通路来调控肿瘤细胞生长的作用有关。
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万方数据
20(S)-原人参二醇对肺癌A549细胞增殖和荷瘤裸小鼠肿瘤生
长的抑制作用
作者: 张锐, 徐华丽, 曲绍春, 于小风, 陈明侠, 睢大筼, ZHANG Rui, XU Hua-li, QU
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作者单位: 吉林大学药学院药理教研室,吉林,长春,130021
刊名: 中草药
英文刊名: CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年,卷(期): 2008,39(12)
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8. 崔倩卫.王继萍.冷吉燕 20(S)-原人参二醇对胃癌细胞增殖活性及细胞凋亡的影响[期刊论文]-中国老年学杂志
2011,31(5)
9. 曾小莉.涂植光 人参皂甙Rh2对人肝癌细胞SMMC-7721信号传导的影响[期刊论文]-中华肝脏病杂志2004,12(9)
10. 冷吉燕.王桂贤.崔倩卫.秦俊杰 20(S)-原人参二醇对胃癌血管形成的抑制作用[期刊论文]-中国老年学杂志
2010,30(20)
引证文献(5条)
1.赵光辉.樊学斌.李超.李玮峰.牛苗玲 20(S)-原人参二醇对鼻咽癌细胞凋亡的诱导作用[期刊论文]-按摩与康复医
学(下旬刊) 2011(4)
2.翟旭光.陈广通 20(S)-原人参二醇对人胚肾293细胞生长的抑制作用[期刊论文]-南通大学学报(医学版)
2010(5)
3.翟旭光.陈广通.熊旭东.应泽亮.沈琴 20(S)-原人参二醇对人前列腺癌细胞凋亡的诱导作用[期刊论文]-交通医学
2010(4)
4.顾恪波.王逊.何立丽.孙桂芝 孙桂芝教授治疗肺癌常用方剂浅析[期刊论文]-世界中西医结合杂志 2013(2)
5.王小峰.潘欣萍.徐建彬.陈伟.王玉芹 20(S)-原人参二醇药学与生物活性研究[期刊论文]-长春中医药大学学报
2012(5)
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