全 文 ：四物汤对血虚证患者血清蛋白质的影响
杨明会１，马增春２，窦永起１，呼 健１，王宇光２，谭洪玲２，
肖成荣２，高 月２
（１．解放军总医院 中医研究所，北京 １００８５３；２．军事医学科学院 放射医学研究所，北京 １００８５０）
［摘要］ 目的：用蛋白质组学技术考察四物汤对血虚证患者血清蛋白的影响，在分子水平上探讨四物汤治疗
血虚证的作用机制。方法：收集正常、血虚证患者和四物汤用药患者的血清，用二向电泳、图像分析、质谱鉴定等蛋
白质组学技术测定四物汤对血虚证患者血清中有影响的蛋白质。结果：蛋白质组学研究发现，血虚证患者血清与
正常相比有１５个蛋白质的水平发生改变，其中有１１个上调和４个下调，四物汤可使这些改变的蛋白质水平有所恢
复。胶内酶切提取蛋白进行质谱鉴定，其中血虚证患者血清与正常相比升高的蛋白质有结合珠蛋白，聚集素，补体
Ｃ４Ｂ，ＧＴＰ结合蛋白２，与正常相比降低的蛋白质有转甲状腺素蛋白，血红蛋白β。血虚证患者服用四物汤后可降低
结合珠蛋白，聚集素，补体Ｃ４Ｂ，ＧＴＰ结合蛋白２，升高转甲状腺素蛋白，血红蛋白 β。结论：四物汤可以通过增强免
疫，减轻基因损伤，增加血红蛋白等途径治疗血虚证。
［关键词］ 四物汤；蛋白质组；血虚证
［中图分类号］Ｒ２８５．５ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００１５３０２（２００８）０４０４２００４
［收稿日期］ ２００７０３１５
［基金项目］ 国家自然科学基金项目（３０７３０１１２）
［通讯作者］ 高月，Ｔｅｌ：（０１０）６６９３１３１２，Ｅｍａｉｌ：ｇａｏｙｕｅ＠ｎｉｃ．
ｂｍｉ．ａｃ．ｃｎ
四物汤是临床常用的经典补血名方［１］，药理研究
表明四物汤通过调节外周血各血液成分、骨髓造血
干／祖细胞、骨髓和脾细胞凋亡、细胞周期等途径促进
造血［２６］。采用射线照射、环磷酰胺腹腔注射或综合
放血法建立血虚证小鼠模型，在组织、细胞和血清等
水平分析确定血虚证的证相关蛋白质群包括造血细
胞增殖、分化和迁移相关蛋白，细胞周期和凋亡相关
蛋白，ＤＮＡ损伤修复蛋白和氧化损伤相关蛋白，四物
汤治疗给药可以多靶点作用使紊乱的证相关蛋白质
网络群恢复平衡［７１０］。四物汤在整体动物实验水平
上已进行了详细研究，但四物汤对血虚证患者血清蛋
白的影响尚未见文献报道，本研究旨在用蛋白质组技
术考察四物汤对血虚证患者血清蛋白的影响，在分子
水平上探讨四物汤治疗血虚证的作用机制。
１ 材料
１．１ 药物 四物汤由熟地黄 ＲａｄｉｘＲｅｈｍａｎｎｉａｅ，当
归ＲａｄｉｘＡｎｇｅｌｉｃａｅＳｉｎｅｎｓｉｓ，白芍 ＲａｄｉｘＰａｅｏｎｉａｅＡｌ
ｂａ，川芎ＲｈｉｚｏｍａＣｈｕａｎｘｉｏｎｇ组成，全部药物购自北
京同仁堂中药厂，经本所马百平教授鉴定。按《太
平惠民和剂局方》规定的剂量称取组成，熟地黄１５
ｇ，当归１０ｇ，白芍１０ｇ，川芎６ｇ，每天１剂，由本院
中药制剂室按标准制作规程制备。
１．２ 主要试剂与仪器 ＣＨＡＰＳ，ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ３１０，
ＩＰＧ缓冲液、丙烯酰胺（ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ），甲叉双丙烯酰
胺（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｂｉｓａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）等双向电泳试剂均购自
Ａｍｅｒｓｈａｍｐｈａｒｍａｃｉａ公司。标准牛血清白蛋白购自
Ｐｉｅｒｃｅ公司。考马斯亮蓝 Ｒ２５０、考马斯亮蓝 Ｇ２５０
购自ＡＭＲＥＳＣＯ公司。Ａｍｅｒｓｈａｍｐｈａｒｍａｃｉａ公司蛋
白质学研究配套仪器：ＩＰＧｐｈｏｒ等电聚焦仪，Ｅｔａｎ
ＤＡＬＴｓｉｘ二向垂直电泳仪，ＭｕｌｔｉＴｅｍｐⅢ 温控循环
水浴，ＩｍａｇｅＳｃａｎｎｅｒ扫描仪，Ｉｍａｇｅｍａｓｔｅｒ２ＤＥｌｉｔｅ图
像分析软件。分光光度计 ＤＵ６４０来自美国 Ｂｅｃｋ
ｍｅｎｃｏｕｌｔｅｒ。
２ 方法
２．１ 临床辨证和血清样品收集 按《中医虚证参
考标准》中关于血虚证的诊断确诊血虚证：①面色
苍白，②起立时眼前昏暗，③唇舌色淡，④脉细，以上
４项具备３项者为血虚证［１１］。放化疗病人辨证属
于血虚证患者服用四物汤，每天１剂，连续１４ｄ，收
集正常人、血虚证患者和服用四物汤患者的血液，每
组收集８人份。每份取０３ｍＬ血液，４℃放置３０
ｍｉｎ后，离心（３０００×ｇ，１５ｍｉｎ），取上清液转移至
Ｅｐ管，离心（７５００×ｇ，３０ｍｉｎ），取上清，从８份血
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清样品中各吸取１００μＬ血清合并，得到正常、患者
和用药组血清样品。
２．２ 蛋白质含量测定 将蛋白质定量标准梯度稀释
后用考马斯亮蓝Ｇ２５０染色，波长５９５ｎｍ测定吸收
度，做标准曲线，样品稀释１００倍测定蛋白质浓度。
２．３ 二向电泳 二向电泳步骤参考文献［１２］，第
一向等电聚焦采用４５０μＬ体系，当聚焦到８万 Ｖｈｒ
时停止，经两步平衡后，进行ＳＤＳＰＡＧＥ电泳。
２．４ 考马斯亮蓝染色 考马斯亮蓝染色液（０１％
考马斯亮蓝、５０％甲醇、１０％冰醋酸）染色６ｈ，考
马斯亮蓝脱色液（２５％乙醇、８％冰醋酸）脱色１２ｈ。
２．５ 差异蛋白质从凝胶的酶切与提取 选取 ２Ｄ
胶上存在明显差异的蛋白质点，用刀片沿斑点染色
边缘切下蛋白点置于１５ｍＬＥｐ管中，用含５０％乙
腈和２５ｍｍｏｌ·Ｌ－１碳酸氢铵溶液脱色，胶片真空离
心干燥。加４μＬ胰酶，３７℃保温１８ｈ，加入５％三
氟乙酸１２０μＬ于 ４０℃保温 １ｈ，吸出上清，加入
２５％三氟乙酸和５０％乙腈溶液１２０μＬ于３０℃保
温１ｈ，合并上清液冷冻干燥［１３］。
２．６ 制备肽质量指纹谱 用５μＬ三氟乙酸溶解样
品，取１μＬ点靶，另取１μＬα腈基４羟基肉桂酸溶
于０１％三氟乙酸／５０％乙腈的饱和溶液作基质，室
温干燥。质谱仪采用激光波长３３７ｎｍ，反射检测。
质谱峰用 Ｂｒｕｋｅｒ的肽段标准或胰酶的自切峰
（ＭＨ＋：９０６５０５Ｄａ，１０２０５０４Ｄａ，１１５３５７４Ｄａ，
２１６３０５７Ｄａ，２２７３１６０Ｄａ）进行标定［１３］。
２．７ 数据库检索初步鉴定蛋白质 数据库检索程
序根据输入的蛋白质等电点、分子质量范围及肽质
量指纹谱数据和其他一些参数在数据库中寻找与这
些参数相匹配的蛋白质［１４］。检索参数为：①种属选
择人；②胰酶酶切；③可变修饰选择氨基甲酰化和氧
化；④漏切点选择１；⑤ 肽质量标准差选择０３；⑥
单同位素质量，检索数据库为：ｈｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｔｒｉｘ
ｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ。
３ 结果
３．１ 四物汤对血虚证患者血清中蛋白质影响的二
向电泳结果 分别将正常、血虚证患者和四物汤作
用后的血清蛋白质，进行双向电泳，第一向用 ｐＨ为
３～１０，长度为２４ｃｍ的预制胶条，第一向结束后进
行ＳＤＳＰＡＧＥ电泳，图像分析时将血虚证患者的凝
胶选做参考胶，其他胶与参考胶相匹配，蛋白质点经
标准化后输出数据到 Ｅｘｃｅｌ进行统计分析。正常、
血虚证患者和四物汤作用后的血清蛋白质的双向电
泳凝胶上的蛋白质点分别为（３１２±２５），（３４２±
２６），（３２６±３４）个。图像分析统计后发现血虚证患
者血清与正常相比有１５个蛋白质的水平发生改变，
其中有１１个上调和４个下调，四物汤可使这些改变
的蛋白质水平有所恢复，结果见表１。
表１ 四物汤对血虚证患者血清中蛋白质影响的二向电泳分析结果
蛋白质点 正常组 血虚证组 四物汤组
１ ００６７±８０００８２） ０１７８±００２０ ００８７±００１１２）
２ － ００１９９±０００１ －
３ － ００３０７±０００４ ００１８６±０００１２）
４ ００２５０±０００２０１） ００３１７±０００３０ ００２８４±０００３０１）
５ ００２８８±０００３０２） ００４１８±００１１０ ００２８２±０００３０２）
６ ００３１１±０００４０２） ００１９６±０００１２ ００４１７±００１１０２）
７ ００２５１±０００４０２） ０１５２０±００６２１ ０００１８±００００９２）
８ ００１５３±０００２３２） ００７６７±００２６１ ００６９３±００１１２
９ ００８９４±００２２３ ００７９９±００２７０ ０３３１０±００９１９２）
１０ ０５８８０±０１１２０２） ０３８２０±０１１３０ ０１６６２±００６３０２）
１１ － ００８３３±００２３１ －
１２ ０１４０７±００２４１２） ０４８６０±００８１２ －
１３ － ００４８７±００１６２ －
１４ － ０１５１０±００６６１ ０１２４０±００５１２
１５ ００８６２±００２７０ ００７２１±００２２３ ０４９６０±０１１９０２）
注：与血虚证组相比１）Ｐ＜００５，２）Ｐ＜００１
３．２ 差异蛋白质的质谱鉴定 选取图像分析统计
后患者血清与正常相比有改变且四物汤可使其有所
恢复的蛋白质点，胶内酶切提取蛋白进行质谱鉴定
这些蛋白质为结合珠蛋白（ｈａｐｔｏｇｌｏｂｉｎ，Ｈｐ），聚集
素 （ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ），补体 Ｃ４Ｂ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｃｏｍｐｏｎｅｎｔ
Ｃ４Ｂ），转甲状腺素蛋白 （ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ），ＧＴＰ结合
蛋白 ２（ＧＴＰｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ２），血红蛋白 β
（ｈｅａｍｏｇｌｏｂｉｎβ）等，其中血虚证患者血清与正常
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相比升高的蛋白质有结合珠蛋白，聚集素，补体
Ｃ４Ｂ，ＧＴＰ结合蛋白２，与正常相比降低的蛋白质
有转甲状腺素蛋白，血红蛋白β。血虚证患者服用
四物汤后可降低结合珠蛋白，聚集素，补体 Ｃ４Ｂ，
ＧＴＰ结合蛋白２，升高转甲状腺素蛋白，血红蛋白
β，结果见表２。
表２ 四物汤对血虚证患者作用的差异蛋白质的质谱鉴定
蛋白质点 匹配号 分数 等电点／分子质量 序列覆盖率／％ 蛋白质名称
１ ＩＰＩ００７４２８２５ ６５ ４８２／３１６７９ ３０ 原肌球蛋白
３ ＩＰＩ００７４９０３９ ６６ ５１３／９２７２３ １２ 结合珠蛋白
４ ＩＰＩ００２９１２６２ ６４ ５８９／５２４６１ １４ 聚集素
７ ＩＰＩ００５１４８２４ ７１ ８５０／３２３７８ ２０ 补体Ｃ４Ｂ
１０ ＩＰＩ０００２２４３２ ２７９ ５５２／１５８７７ ６０ 转甲状腺素蛋白
１１ ＩＰＩ００７４９０３９ ７３ ５１３／９２７２３ １４ 未知蛋白
１３ ＩＰＩ０００３２５３４ ７３ ９１７／２１１２２ ２５ ＧＴＰ结合蛋白２
１４ ＩＰＩ００２１６７７３ ７５ ５７７／４５１３０ １７ ＡＬＢ蛋白
１５ ＩＰＩ００６５４７５５ ３４５ ６８１／１５８５７ ８２ 血红蛋白β
４ 讨论
从外周血各血液成分改变、骨髓造血干／祖细胞
的动态变化、骨髓和脾细胞凋亡、ＣＤ３４＋细胞的改
变、细胞周期和造血相关基因的表达等方面，研究观
察四物汤及其１６种不同配伍组方对小鼠血虚证发
生发展的影响，研究发现四物汤主要通过调节细胞
因子，提升正向造血调控因子和免疫因子表达，抑制
负向调控因子表达，促进造血调控相关的信号转导
因子分泌，影响整个造血调控网络，通过多靶点、多
途径综合发挥补血作用［１１０］。迄今尚未开展四物汤
对血虚证患者血清蛋白影响的研究，现代研究表明，
证候是由一个调控中心及其所属众多分子组成的网
络发生紊乱的综合功能状态［１５］，中药复方是通过多
组分整合作用使紊乱的分子网络恢复平衡，从而达
到治疗中医的证和相关疾病的作用和效果［８］。用
蛋白质组学技术考察四物汤对血虚证患者血清蛋白
的影响，结果表明血虚证患者服用四物汤后可降低
结合珠蛋白，聚集素，补体 Ｃ４Ｂ，ＧＴＰ结合蛋白２，升
高转甲状腺素蛋白，血红蛋白β。
结合珠蛋白又称触珠蛋白，是血清 α２球蛋白
组分中的一种酸性糖蛋白，其主要功能是通过与游
离血红蛋白（ｈｅａｍｏｇｌｏｂｉｎ，Ｈｂ）结合形成 ＨｐＨｂ复
合物，将Ｈｂ运至肝中代谢，从而避免 Ｈｂ和铁从肾
脏丢失以及对肾脏的损伤［１６］。此外，结合珠蛋白作
为一种急性期蛋白，在参与宿主抗感染、损伤组织的
修复以及内环境稳定的过程中起着重要作用［１７］。
Ｈｐ具有免疫抑制作用，能抑制不同类型的凝集素引
起的淋巴细胞转化，抑制Ｔｈ２细胞因子的释放，也可
能是免疫系统的受体配体激活过程中的天然拮抗
剂［１８］。聚集素能促进细胞与细胞、细胞与基质之间
相互作用［１９］，参与补体调节和抗凋亡的作用［２０］，聚
集素与螺旋酶ｋｕ７０／８６复合物结合，破坏其ＤＮＡ修
复能力，增加 ＤＮＡ突变，促进肿瘤的发生与发
展［２１］。转甲状腺素蛋白是一种主要由肝脏和脉络
丛产生的四聚体血浆蛋白，参与体内的甲状腺素的
运输和维生素Ａ的代谢，转甲状腺素蛋白基因还可
能是与人肝癌相关的抑癌基因［２２］。补体主要产生
于肝脏和巨噬细胞，生理情况下其合成、活化和灭活
过程处于一种动态平衡，故血清含量稳定，在炎症和
免疫反应中，补体固有成分的合成上调［２３］。血红蛋
白α和 β组成血红蛋白，血红蛋白在血虚证血清中
的含量降低［２５］。蛋白质组学的研究结果表明，血虚
证患者血清中造血和免疫功能相关蛋白的平衡破
坏，而四物汤可以逆转这些蛋白的改变而恢复平衡。
血虚证患者血清中水平改变蛋白质的功能包括
免疫、凋亡、维持基因组稳定性、血细胞组成成分等，
参与造血和免疫的分子网络发生紊乱而表现为血虚
证，四物汤可以逆转这些蛋白的改变而恢复平衡使
机体恢复正常。
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ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｔｅｃｈｎｉｑｕｅ
ＹＡＮＧＭｉｎｇｈｕｉ１，ＭＡＺｅｎｇｃｈｕｎ２，ＤＯＵＹｏｎｇｑｉ１，ＨＵＪｉａｎ１，ＷＡＮＧＹｕｇｕａｎｇ２，ＴＡＮＨｏｎｇｌｉｎｇ２，
ＸＩＡＯＣｈｅｎｇｒｏｎｇ２，ＧＡＯＹｕｅ２
（１．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＧｅｎｅｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＰＬＡ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００８５３，Ｃｈｉｎａ；
２．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＲａｄｉａｔｉｏｎＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＡｃａｄｅｍｙｏｆＭｉｌｉｔａｒｙＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００８５０，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｒｅｓｅａｒｃｈｔｈｅｅｆｅｃｔｓｏｆＳｉｗｕｔａｎｇｏｎｓｅｒｕｍｐｒｏｔｅｉｎｏｆｂｌｏｏｄｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙｕｓｉｎｇｐｒｏｔｅｏｍｉｃｔｅｃｈｎｉｑｕｅａｎｄ
ｆｕｒｔｈｅｒｅｘｐｌｏｒｅｉｔｓｐｏｔｅｎｔｉａｌｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｔｏｃｕｒｅｂｌｏｏｄｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｍｅｔｈｏｄ：Ｔｈｅｓｅｒａｏｆｎｏｒｍａｌ，ｂｌｏｏｄｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙａｎｄｃｕｒｅｄ
ｇｒｏｕｐｗｅｒｅｃｏｌｅｃｔｅｄ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｐｒｏｔｏｃｏｌｉｎｖｏｌｖｉｎｇｔｈｅｈｉｇｈｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｔｗｏｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｐｏｌｙａｃｒｙａｍｉｄｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ｔｈｅｃｏｍｐｕｔｅｒ
ａｓｓｉｓｔｅｄｉｍａｇｅａｎａｌｙｓｉｓ，ａｎｄｔｈｅｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙｗａｓｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｒｅｇｕｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｂｙＳｉｗｕｔａｎｇ．Ｒｅｓｕｌｔ：Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｎｏｒｍａｌ
ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅｒｅｗｅｒｅ１５ｐｒｏｔｅｉｎｓｃｈａｎｇｅｄ，ｉｎｗｈｉｃｈ１１ｉｎｃｒｅａｓｅｄａｎｄ４ｄｅｃｒｅａｓｅｄｅｘｐｒｅｓｓｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｓｅｒａｃｏｕｌｄｂｅｒｅｃｏｖｅｒｅｄｂｙＳｉｗｕ
ｔａｎｇ．Ｔｈｅｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｖｏｌｖｅｄｈａｐｔｏｇｌｏｂｉｎ，ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ，ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｃｏｍｐｏｎｅｎｔＣ４ＢａｎｄＧＴＰｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ２，ｗｈｉｌｅｔｈｅ
ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｖｏｌｖｅｄｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎａｎｄｈｅａｍｏｇｌｏｂｉｎβ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｓｉｗｕｔａｎｇｃｏｕｌｄｒｅｇｕｌａｔｅｓｅｒｕｍｐｒｏｔｅｉｎ，ｗｈｉｃｈｉｎｃｌｕｄｅ
ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ＤＮＡｉｎｊｕｒｙｒｅｐａｉｒ，ａｎｄｂｌｏｏｄｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ．ＴｈｉｓｍｉｇｈｔｂｅｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＳｉｗｕｔａｎｇｔｏｃｕｒｅｂｌｏｏｄｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ Ｓｉｗｕｔａｎｇ；ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ；ｂｌｏｏｄｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ
［责任编辑 古云侠］
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第３３卷第４期
２００８年２月
中 国 中 药 杂 志
ＣｈｉｎａＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ
Ｖｏｌ．３３，Ｉｓｓｕｅ ４
Ｆｅｂｒｕａｒｙ，２００８