全 文 ：吴茱萸水提物给药大鼠尿液代谢组学研究
张启云１，徐国良１，马晓雪１，曾治君１，黄丽萍２，余日跃２，刘红宁１
（１．江西中医学院 现代中药制剂教育部重点实验室，江西 南昌 ３３０００６；
２．江西中医学院，江西 南昌 ３３０００６）
［摘要］　目的：研究吴茱萸水提液给药对大鼠内源性代谢产物的影响。方法：吴茱萸水提物按０３８５７ｇ·ｋｇ－１给 ＳＤ大
鼠连续灌胃３３ｄ，收集尿液，通过Ａｇｉｌｅｎｔ１２００６４１０三重四极杆质谱对尿液中内源性代谢物进行全扫描分析，ＳＩＭＣＡＰ软件经
过ＰＣＡ，ＰＬＳＤＡ分析。结果：给药组与对照组相比，大鼠尿液代谢物白细胞三烯，棕榈酰乙醇胺，二十二碳六烯酸，８（Ｒ）氢过
氧亚油酸／花生酸等有明显变化。结论：吴茱萸水提物灌胃对正常大鼠机体代谢产生影响，为进一步阐释吴茱萸的药性研究
工作提供依据。
［关键词］　液质联用；代谢组学；吴茱萸；生物标记物
［收稿日期］　２００９００００
［基金项目］　国家重点基础研究发展计划（９７３计划）基金项目
（２００６ＣＢ５０４７０２）
［通信作者］　刘红宁，Ｔｅｌ：（０７９１）７１１８８５７，Ｅｍａｉｌ：ｌｈｏｎｇｎｉｎｇ＠ｙａ
ｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
［作者简介］　张启云，助教，从事中药代谢与药代动力学研究工作
　　吴茱萸为芸香科植物吴茱萸 Ｅｖｏｄｉａｒｕｔａｅｃａｒｐａ
（Ｊｕｓｓ．）Ｂｅｎｔｈ及其变种石虎 Ｅ．ｒｕｔａｅｃａｒｐａ（Ｊｕｓｓ．）
Ｂｅｎｔｈ．ｖａｒ．ｏｆｉｃｉｎａｌｉｓ（Ｄｏｄｅ）Ｈｕａｎｇ和疏毛吴茱萸
Ｅ．ｒｕｔａｅｃａｒｐａ（Ｊｕｓｓ．）Ｂｅｎｔｈ．ｖａｒ．ｂｏｄｉｎｉｅｒ（Ｄｏｄｅ）
Ｈｕａｎｇ的干燥近成熟果实，性味辛、苦、热，有小毒，
有散寒止痛、降逆止呕和助阳止泻之功效，常用于治
疗厥阴头痛、寒病腹痛、寒湿脚气、经行腹痛、脘腹胀
痛、呕吐吞酸、五更泄泻等，外治口疮，高血压［１］。
近代医药学研究也证明其有镇痛、降血压、抗血栓、
安神、抗菌等作用［２］。本研究工作尝试建立一种吴
茱萸水提物对正常大鼠代谢干预的代谢组学评价方
法，采用ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析方法测定给药组和对照组
大鼠的尿样，得到尿样中小分子代谢物的图谱，结合
主成分分析（ＰＣＡ）方法，考察小分子内源性代谢物
受吴茱萸水提物灌胃影响而产生的变化，探讨热性
药物吴茱萸水提物长期给药后，正常大鼠尿液代谢
物的变化。
１　材料
１．１　动物　ＳＤ大鼠，雌雄各半，体重（２００±２０）ｇ，
江西中医学院动物中心提供，许可证号 ＳＣＸＫ（赣）
２００６０００１，动物自由摄食饮水。
１．２　药物及吴茱萸水提液制备　吴茱萸药材购自
北京鹤元堂医药科技有限公司，由本实验室制备。
取吴茱萸药材６６ｋｇ，加入６～８倍自来水，浸泡３０
ｍｉｎ，加热至沸腾，煎煮６０ｍｉｎ，倒出药液；残渣再加
入４～６倍自来水，加热至沸腾，煎煮６０ｍｉｎ。合并
２次药液，滤过、浓缩成５０００ｍＬ吴茱萸水提液（相
当于生药１３２ｇ·ｍＬ－１，ＨＰＬＣ测得吴茱萸碱和吴
茱萸次碱分别为２０２４，７１５μｇ·ｇ－１），－２０℃放
置备用。
１．３　试剂和仪器　乙腈（ＨＰＬＣ级，ＰｒｏｄｕｃｔｏｆＴｅ
ｄｉａ，ＵＳＡ），甲酸（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ），水为去离子
水，ＳＩＧＭＡ３１８Ｋ低温高速离心机（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｇｅｒｍａ
ｎｙ），Ａｇｉｌｅｎｔ１２００６４１０ＴｒｉｐｌｅＱｕａｄｒｕｐｏｌｅ质谱仪（Ａｇ
ｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ），固相萃取小柱（Ｄｉｋｍａ，１
ｍＬ·ｍｇ－１）。
２　方法
２．１　分组及给药　１２只大鼠分成给药组６只，对
照组６只。分别放置于代谢笼中，自由摄食饮水，适
应３ｄ后开始给药，每天１６：００按生药０３８５７ｇ·
ｋｇ－１灌服１次，对照组按１ｍＬ·ｋｇ－１给蒸馏水，连续
３３ｄ。
２．２　尿液收集和处理　采用代谢笼，从给药前１ｄ
开始，每天收集４ｈ内尿液，收集５个时间点（分别
为给药前第１天，给药第８，１７，２６，３３天），置于－２０
℃冰箱保存，备用。
尿液解冻后，４℃，１３０００ｒ·ｍｉｎ－１离心 １０
ｍｉｎ，取０５ｍＬ上清液置于分别用２ｍＬ甲醇，２ｍＬ
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纯水活化的固相萃取小柱中，先用２ｍＬ纯水洗涤，
再用１ｍＬ甲醇洗脱，收集洗脱液，经０２２μｍ尼龙
膜过滤，备用。
２．３　色谱条件　ＡｇｉｌｅｎｔＺｏｒｂａｘＥｃｌｉｐｓｅＳＢＣ１８色
谱柱（４６ｍｍ×１５０ｍｍ，５μｍ），流动相，乙腈（Ａ）
０１％甲酸（Ｂ），流速 ０４ｍＬ·ｍｉｎ－１，进样量 １５
μＬ，柱温３５℃，运行２０ｍｉｎ。梯度洗脱条件如表１。
表１　色谱梯度条件
时间／ｍｉｎ Ａ／％ Ｂ／％
１７５ ２５ ７５
６ ６０ ４０
８ ７０ ３０
１２ ９０ １０
１４ ９０ １０
１４１ ２５ ７５
２．４　质谱条件　离子源模式ＥＳＩ正离子模式；毛细
管电压４０００Ｖ；雾化器压力２７５８κＰ；干燥气流速
１０Ｌ·ｍｉｎ－１，干燥气温度３５０℃，全扫描监测得尿
液总离子流图（ｔｏｔａｌｉｏｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ，ＴＩＣ），提取质
谱信息，得到尿液样品所含物质的质荷比。
２．５　数据分析　将得到的样品数据通过 ｍ／ｚ识
别、匹配和归一化等计算过程，得到矩阵，将其导入
ＳＩＭＣＡＰ１１０软件中进行主成分分析（ＰＣＡ），偏最
小二乘法判别分析（ＰＬＳＤＡ）分析。
３　结果
３．１　给药大鼠尿液总离子流图　全扫描监测得尿
液总离子流图（图 １）。反映尿液样品的化合物信
息，从中提取质谱信息，ｍ／ｚ值及相应的丰度（Ａ
ｂｏｕｎｄ）。
图１　给药大鼠尿液总离子流图
３．２　不同给药天数对大鼠尿样影响的比较　试验
进行过程中，对照组和给药组的内源性物质都发生
了变化，其中给药第３３天（第５时间点），两组大鼠
尿液的代谢组差异最大，说明给药第３３天，两组大
鼠尿液中内源性物质组间差异最大。因此，对给药
第３３天的对照组与给药组数据进一步考察，从中找
出生物标记物（图２）。
１～５．５个样品收集时间点；Ｃ．对照组，Ｗ．吴茱萸组。
图２　大鼠尿样数据均值随时间变化的ＰＣＡ分析
时间轨迹图
３．３　给药第３３天数据的 ＰＣＡ　采用 ＰＣＡ对给药
第３３天对照组与给药组尿液代谢物数据进行分
析，得出反映两组组间离散程度的各样本数据的
得分图（图３）。对图３进行分析可知，两组样本沿
ｔ１大致分开，因而 ｔ１轴方向表示组间差异，同组雌
雄在 ｔ２维明显分开，因而 ｔ２轴方向表示性别差
异。说明给药第３３天，两组大鼠尿液的内源性物
质有明显差异，性别差异是影响大鼠尿液代谢组
的因素之一。
△雌性空白组；◇雄性空白组；▲雌性吴茱萸组；
◆雄性吴茱萸组。
图３　给药第３３天２组尿液样品质谱数据的得分图
　　对给药第３３天２组尿液样品质谱数据在 ＳＩＣ
ＭＡＰ１１０软件上得到主成分载荷图（图４），每个
点对应的是 ｍ／ｚ值，以 ｍ／ｚ值标记出在得分图中把
给药组和对照组分开的生物标记物。
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图４　给药第３３天２组尿液样品质谱数据的
主成分载荷图
３．４　可能的生物标记物　显示对照组和给药组成
分明显区别的是小分子物质的质荷比，它们可能是
本研究工作中的生物标记物，由图 ４得出，如下
１２３８，２０３９，２２７１，２１３８，２６６９，２８０９，２８４９，
２９６９，３１３０，３１４０，３０００，３２９等，经网站（ｈｔｐ：／／
ｗｗｗ．ｈｍｄｂ．ｃａ／）查找，对应的化合物见表２，它们很
有可能是核酸、糖类和脂类代谢内源性化合物，它们
准确的结构确认需进一步研究。
４　讨论
　　随着给药天数的增加，２组大鼠尿液的代谢组
表２　生物标记物
ｍ／ｚ 可能的化合物　　　　 化合物的生物功能 代谢物含量变化
１２３８ 甲基吡啶酸 色氨酸分解代谢产物 升高
　 烟酸，尼克酸 重要的维生素 升高
２０３９ 乙酰肉（毒）碱 丙氨酸和天冬氨酸代谢成分 升高
　 ３吲哚丁酸 吲哚衍生物 升高
２２７１ 肌肽 β丙氨酸和组氨酸代谢物 降低
２１３８ 硫酸吲哚酚 色氨酸代谢产物 升高
２６６９ ２，３二磷酸甘油酸 糖分解中间产物 升高
　 １，３二磷酸甘油酸 糖分解中间产物 升高
２８０９ １０Ｅ，１２Ｚ碳二烯酸 脂肪酸 升高
　 ９Ｅ，１１Ｅ碳二烯酸 脂肪酸 升高
２８４９ 别嘌呤核苷 核苷 升高
　 黄嘌呤核苷 核苷 升高
２９６９ Ａｌｐｈａｄｉｍｏｒｐｈｅｃｏｌｉｃ 白细胞三烯 升高
３１３０ ８（Ｒ）氢过氧亚油酸 脂肪酸 升高
　 花生酸 脂肪酸 升高
３１４０ ５′磷酸核糖ａＮ甲酰甘氨脒 参与嘌呤代谢 升高
３０００ （神经）鞘氨醇 （神经）鞘脂类的主要成分 升高
　 棕榈酰乙醇胺 具有抗炎活性 升高
３２９０ 二十二碳六烯酸 重要的脂肪酸 升高
　 ４氧视黄酸 视黄酸的生物活性几何异构体 升高
差异逐渐变大，给药３３天后，数据处理结果显示吴
茱萸水提液给药组大鼠与蒸馏水灌胃组大鼠的内源
性代谢物组差异最大，性别对代谢物组学研究也有
比较明显影响。
近代医药学研究证明，吴茱萸有镇痛、降血压、
抗血栓、安神、抗菌等作用［２］，本实验得到的可能生
物标记物也与其药理作用相关，生物学功能明确的
几种小分子化合物白细胞三烯（ｍ／ｚ２９７１），棕榈酰
乙醇胺（ｍ／ｚ３００５），二十二碳六烯酸（ｍ／ｚ３２９０），
８（Ｒ）氢过氧亚油酸／花生酸（ｍ／ｚ３１３０），２，３二磷
酸甘油酸／１，３二磷酸甘油酸（ｍ／ｚ２６６９）。例如白
细胞三烯［３］具有抗炎活性，在尿液中的含量升高，表
明吴茱萸具有抗炎作用；花生酸［４］预防心血管疾病的
发生，在尿液中的含量升高，表明吴茱萸具有降血压、
抗血栓的作用；从能量代谢的角度分析，热性中药具
有加快机体能量代谢的作用，生物标记物２，３二磷酸
甘油酸／１，３二磷酸甘油酸［５］在尿液中的含量升高，
表明吴茱萸具有加速机体能量代谢的作用。
本研究工作证明，热性中药吴茱萸水提物灌胃
对正常大鼠机体代谢产生影响，为进一步确定表征
热药药性的生物标记物结构提供了研究依据。
［参考文献］
［１］　中国药典．一部［Ｓ］．２００５：１１８．
［２］　逯振宇，蔺兴遥，崔佳．吴茱萸对心血管药理作用的研究［Ｊ］．
中医药研究，２００２，１８（２）：４４．
［３］　刘焕，谢玉．白三烯与婴幼儿喘息性疾病［Ｊ］．当代医学，２００８，
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［４］　姚昕，秦文，齐春梅，等．花生四烯酸的生理活性及其应用［Ｊ］．
食品科技，２００４，５：５７．
［５］　刘庆莹，陈文为．２，３二磷酸甘油酸代谢和生理功能［Ｊ］．生理
科学进展，１９８３，１：７８．
Ｍｅｔａｂｏｎｏｍｉｃｓｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙｓｔｕｄｙｏｎａｑｕｅｏｕｓｅｘｔｒａｃｔｏｆ
ｅｖｏｄｉａｅａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｅｄｓｐｒａｇｕｅｄａｗｌｅｙｒａｔｓ
ＺＨＡＮＧＱｉｙｕｎ１，ＸＵＧｕｏｌｉａｎｇ１，ＭＡＸｉａｏｘｕｅ１，ＺＥＮＧＺｈｉｊｕｎ１，ＨＵＡＮＧＬｉｐｉｎｇ２，ＹＵＲｉｙｕｅ２，ＬＩＵＨｏｎｇｎｉｎｇ１
（１．ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＭｏｄｅｒｎＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，ＪｉａｎｇｘｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，
Ｎａｎｃｈａｎｇ３３０００６，Ｃｈｉｎａ；
２．ＪｉａｎｇｘｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｎｃｈａｎｇ３３０００６，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＨＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳｂａｓｅｄｓｔｕｄｙｏｎｔｈｅｃｈａｎｇｅｏｆｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓｏｆＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙｒａｔｓａｄｍｉｎｉｓｔｒａ
ｔｅｄｏｆａｑｕｅｏｕｓｅｘｔｒａｃｔｏｆＥｖｏｄｉａｅ．Ｍｅｔｈｏｄ：６ＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙｒａｔｓｈａｄｂｅｅｎｓｕｃｃｅｓｓｉｖｅｌｙａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｅｄａｑｕｅｏｕｓｅｘｔｒａｃｔｏｆｅｖｏｄｉａｅ
（０３８５７ｇ·ｋｇ－１）ｆｏｒ３３ｄａｙｓ，ａｎａｇｉｌｅｎｔ１２００６４１０ｔｒｉｐｌｅｑｕａｄｒｕｐｏｌｅｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒｗａｓｕｓｅｄｆｏｒｔｈｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｍｅ
ｔａｂｏｌｉｔｅｓｉｎｒａｔｕｒｉｎｅｓａｍｐｌｅｓ．Ｔｈｅｓｅｄａｔｕｍｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｂｙｔｈｅｐｒｉｎｃｉｐａｌｃｏｍｐｏｎｅｎｔａｎａｌｙｓｉｓ（ＰＣＡ）ａｎｄＰＬＳＤＡｕｓｉｎｇｔｈｅＳＩＭＣＡ
Ｐ１００ｓｏｆｔｗａｒｅ．Ｒｅｓｕｌｔ：ＴｈｅｄｉｆｅｒｅｎｃｅｉｎｍｅｔａｂｏｌｉｃｐｒｏｆｉｌｅｓｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐａｎｄｔｈｅｄｏｓｅｄｇｒｏｕｐｗａｓｗｅｌｏｂｓｅｒｖｅｄｂｙＰＣＡ
ｏｆｔｈｅＭＳｄａｔａ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＴｈｅＥｖｏｄｉａｅｈａｄｃｈａｎｇｅｄｔｈｅｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓｏｆＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙＲａｔｓ．Ｔｈｉｓｗｏｒｋｃａｎｐｒｏｖｉｄｅ
ｂａｓｅｆｏｒｔｈｅｆｕｒｔｈｅｒｒｅｓｅａｒｃｈｏｎｔｈｅｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎｏｆｄｒｕｇｐｒｏｐｅｒｔｙｏｆｅｖｏｄｉａｅ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］　ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ；ｍｅｔａｂｏｎｏｍｉｃｓ；Ｅｖｏｄｉａｒｕｔａｅｃａｒｐａ；ｂｉｏｍａｒｋｅｒ
［责任编辑　古云侠］
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