全 文 ：药 物 研 究
The medicine study
基金项目:国家自然科学基金项目 (8360673)。
作者简介:佟玉风 (1987 －) ，女，蒙古族，硕士研究生。
通信作者:巴根那 (1960 －) ，男，蒙古族，教授，研究方向为蒙药配伍规律及新药研发。
液质联用分析 D － GlaN致急性肝损伤模型
大鼠尿液中肋柱花的化学成分
佟玉风 巴根那* 白梅荣 包明兰 叶日贵 拉喜那木吉拉
内蒙古民族大学，内蒙古 通辽 028000
【摘 要】 目的:研究肋柱花水煎液在 D － GlaN致急性肝损伤模型大鼠尿液中的化学成分。方法:采用腹腔注射 D － GlaN 制备急性
肝损伤大鼠模型;利用液质联用法对模型大鼠灌胃肋柱花水煎液后尿液中化学成分进行分析，检测波长 280nm;流动相为甲醇 － 0. 1%甲酸
水溶液;流速 1. 0ml /min;柱温 35℃;梯度洗脱，质谱定性采用多级离子阱质谱，负离子模式扫描。结果:在含药尿液中共标识 19 个峰，
1 个为药物原型成分，14 个为代谢产物，其余为尿液内源性成分。结论:该方法较全面的分析肋柱花在急性肝损伤模型大鼠尿液中的化学
成分，为进一步研究肋柱花药效物质基础提供依据。
【关键词】 肋柱花;液质联用;急性肝损伤模型;尿液
【中图分类号】Ｒ284. 1 【文献标志码】A 【文章编号】1007 － 8517 (2015)05 － 0012 － 03
Chemical composition analysis of Herba Lomatognii in the urine from ratmodel of D －GlaN induced acute liver injury by LC －MS
TONG Yu-feng，BA Gen-na，BAI Mei-rong，BAO Ming-lan，YE Ｒi-gui
Inner Mongolia University for the Nationalities，TongLiao 028000，China
Abstract:Objective To analyze the chemical composition of Herba Lomatognii water decoction in the urine from rat model of D －
GlaN induced acute liver injury． Methods Intraperitoneal injected D － GlaN to prepare rat model of acute liver injury;Analyze the
chemical composition of the urine after the rats were given Herba Lomatognii water decoction by gavage;The detection wavelength was
280nm;the mobile phase was methanol and water;the flow rate was 1. 0ml /min;column temperature was 35℃;gradient elute． Ｒe-
sults 19 compositions were detected in the Medicated urine，1 ones were drug － induced compositions，14 ones were metabolites，and
others were the natural ingredients for urine． Conclusion This method comprehensively analyzed the chemicalcomposition of Herba Lo-
matognii in the urine from rat model of D － GlaN induced acute liver injury． This research is a theoretical indication for the further re-
search on effective substance of Herba Lomatogonii．
Key words:Herba Lomatogonii;LC － MS;Acute liver injury model;Urine
肋柱花为龙胆科肋柱花属植物肋柱花 Lomatogonium ro-
tatum (L. )Fries ex Nym 的干燥全草。广布在我国西藏、
云南、四川、青海、甘肃、新疆、内蒙、山西和河北。该
药是蒙医特色药材，具有平息协日、清热、健胃、愈伤之
功。主要用于清协日热、瘟疫、流感、伤寒、中暑头痛、
肝胆热、黄疸、胃协日、伤热等病症［1］。1998 年收载于卫
生部药品标准 (蒙药分册)。近年来，研究资料显示，肋柱
花所含黄酮类化合物、木犀草素、齐敦果酸等均具有不同
程度的利胆、保肝活性［2］，在一定程度上提示肋柱花可用
于治疗肝胆疾病。
课题组对该药材乙酸乙酯、氯仿、正丁醇及石油醚提
取物化学成分进行系统研究，并发现了新化学成分［3 － 6］。
本研究通过灌胃给予 D － GlaN 致急性肝损伤模型大鼠肋柱
花水煎液，收集 24h 的尿液样品，通过液质联用技术，对
色谱峰归属进行分析，为进一步研究肋柱花药效物质基础
提供了方法学基础。
1 仪器与材料
1. 1 仪器 Agilent 1100 series LC － MSD 液质联用仪 (包
括:Agilent SL 型多级离子阱质谱仪、低压四元梯度泵、
DAD二级管阵列检测器、自动进样、柱温箱、chemistation
化学工作站) ;Agilent 1260 Infinitely半制备高效液相色谱仪
(美国安捷伦) ;TGL － 20B高速离心机;KQ － 200VDE双频
数控超声波清洗器;AUW120D 电子分析天平;DP － 01 无
油真空泵;过滤器和普通玻璃仪器等。
1. 2 药物和试剂 肋柱花药材 (兴安盟左翼中旗) ;木犀
草素 (批号:111520 － 200504)、齐墩果酸 (批号:110709
－ 201206)、獐牙菜苦苷 (批号:0785 － 200203)购自中国
药品生物制品检定所;甲醇、甲酸为色谱纯;水为娃哈哈
纯净水;其余试剂均为分析纯。
1. 3 动物 SPF 级 Wistar 雄性大鼠，体重 (200 ± 10) g，
由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供。
2 方法与结果
2. 1 肋柱花水提物制备 称取 1kg 肋柱花，第一次加水量
为 10 倍，煎煮提取 1. 5h，第二次加水量为 8 倍，煎煮提取
1h，第三次加水量为 6 倍，煎煮提取 1h，共提取 3 次，合
并 3 次提取液减压浓缩，干燥得浸膏，低温保存待用。
2. 2 体外药材溶液的制备 精密称取肋柱花浸膏 0. 1177g，
置于 100ml锥形瓶中，精密加入 25ml 色谱甲醇，密塞，称
定重量 70. 6425g (具塞) ，超声 40min 后放冷，再称定重
量，用色谱甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，精密吸取
上液 1ml过 0. 45μm微孔滤膜，得待测溶液。
2. 3 对照品溶液的制备 精密称取獐牙菜苦苷 1. 1mg、木犀
草素 1. 2mg、齐墩果酸 1mg，分别置 10ml量瓶中，加甲醇至
刻度，取 1ml上清液，过 0. 45μm微孔滤膜，得标准品溶液。
2. 4 色谱条件 色谱柱:Venusil MP C18 (4. 6 × 300mm，
5μm) ;流动相:A为 0. 1%甲酸水溶液，B 为甲醇;柱温:
35℃;进样体积:30μl;流速:1. 0ml /min;检测波长:
280nm，梯度洗脱。如表 1。
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表 1 不同时间流动相的情况
t /min 甲醇 (%) 0. 1%甲酸水溶液 (%)
0 10 90
10 20 80
20 40 60
40 60 40
60 75 25
2. 5 质谱条件 电离源:电喷雾离子源 (ESI) ;检测方
式:负离子检测;扫描范围:m/z 50 ～ 800;干燥气温度:
350℃;干燥气流量 9. 0L /min;雾化气压强:0. 24MPa
(35. 0psi) ;毛细管电压:4000V。实验数据采用 Data Anal-
ysis软件处理。
2. 6 D － GlaN致急性肝损伤模型的复制［7］ 选取大鼠 16
只，按体重随机分为正常对照组和模型组，模型腹腔注射
300mg /kg D － GlaN 24h 后处死小鼠，观察血清 AST、ALT
含量，正常对照组腹腔注射 300mg /kg 生理盐水，判断模型
是否成功。
2. 7 尿液样品的收集 取 Wistar 雄性大鼠 15 只，随机分
为空白组，模型组，模型加肋柱花组，每组各 5 只。将大
鼠正常饲养 3d使其适应环境，从第 4 天开始模型加肋柱花
组按 5. 4g /kg剂量灌胃肋柱花水煎液，空白组和模型组灌
胃等容量的生理盐水，每天 1 次，连续 7d，于末次给药后
1h，模型组和模型加肋柱花组大鼠按照 300mg /kg 腹腔注射
D － GlaN进行造模。将各组大鼠置于代谢笼中，分别收集
24h尿液，将尿液置于 － 40℃冰箱备用。
2. 8 尿液样品的预处理［8］
2. 8. 1 乙酸乙酯萃取法 将冻存的各组尿液样品置于室温
下缓慢融化，12000r /min离心 10min，取上清液 2. 0ml，每次
加 2倍量乙酸乙酯，萃取 3 次，合并萃取液，减压浓缩至
干，用 1. 0ml 色谱甲醇超声溶解，0. 22μm 微孔滤膜过滤
备用。
2. 8. 2 SPE小柱固相萃取法 将冻存的各组尿液置于室温
下缓慢溶解，12000r /min 离心 10min，取上清液 2ml，用
HBL固相萃取柱进行纯化，先用 1ml 蒸馏水洗去杂质，洗
脱液弃用;再用 2ml甲醇洗脱，减压浓缩至干，残渣用 1ml
色谱甲醇溶解，0. 22μm微孔滤膜过滤备用。
2. 8. 3 正丁醇萃取法 将冻存的空白及给药组尿液样品置
于室温下缓慢融化，12000r /min 离心 10min，取上清液
2. 0ml，每次加 2 倍水饱和的正丁醇溶液，萃取 3 次，合并
萃取液，减压浓缩至干，用 1. 0ml 色谱甲醇超声溶解，
0. 22μm 微孔滤膜过滤备用。
2. 9 液质联用图谱测定 分别吸取空白尿液、模型尿液、
含药尿液供试品溶液、体外药材溶液及对照品溶液各 30μl
进样，记录 60min的色谱图。
2. 10 结果 对比空白尿液、模型尿液、肋柱花尿液、肋
柱花体外药材 HPLC图谱，发现肋柱花尿液共标识 19 个成
分，结合保留时间、紫外吸收和二级质谱分析得知 4、8、
13、19 号峰为尿液内源性成分，15 号峰为药物原型成分，
1、2、3、5、6、7、9、10、11、12、14、16、17、18 号峰
推测其为体内代谢产物。LC图谱比较如下图:
3 讨论
3. 1 尿液样品处理方法的选择 通过对比 SPE小柱固相萃
取法、乙酸乙酯萃取法和正丁醇萃取法液相图谱，发现
SPE小柱固相萃取法的选择性好、保留成分多、引入杂质
量少，对样品起到了很好的纯化作用，可作为含药尿液的
处理方法。
3. 2 流动相和检测波长的选择 实验中分别尝试了甲醇 －
水、甲醇 － 0. 1%甲酸水溶液等不同流动相梯度洗脱，对比
发现甲醇 － 0. 1%甲酸水溶液作为流动相的峰型好，分离度
良好，故选择了甲醇 － 0. 1%甲酸水溶液梯度洗脱为流动
相。检测波长分别测定了 210、238、254、280、305nm，其
中在 280nm 波长下基线平稳，分离度良好，故选择了
280nm为检测波长。
3. 3 结论 课题组前期实验研究表明肋柱花具有一定的保
肝作用［9］，经过适当途径给药后，在体内经过吸收、代谢
等过程最后吸收入血的往往是多个单体成分形成的有效成
分群，其结构既可以是肋柱花的原型成分，也可以是代谢
产物或肋柱花中各成分间相互反应形成的新成分，还可以
(下转第 16 页)
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3. 2. 6 色谱条件的确定 取供试品溶液与对照品溶液各
10μl，分别点于同一薄层板上，以氯仿 －乙酸乙酯 (15∶ 1)
为展开剂，展开，取出，晾干，喷以 5%硫酸香草醛试液，
105℃下显色后置日光下检视。
4 样品的测定
4. 1 生黄精的测定结果 取 10 批黄精药材，按“3. 1. 1
项”下制备的供试品溶液后，按“3. 2. 6”确定的色谱条件
进行检测，结果见图 8。
4. 2 蒸黄精的测定结果 取 10 批蒸黄精，按“3. 1. 1 项”
下制备的供试品溶液后，按“3. 2. 6”确定的色谱条件进行
检测，结果见图 9。
4. 3 酒黄精的鉴定 取 10 批酒黄精，按“3. 1. 1 项”下制
备的供试品溶液后，按 “3. 2. 6”确定的色谱条件进行检
测，结果见图 10。
5 结论与讨论
以薯蓣皂苷元为对照品的黄精药材薄层鉴别方法曾有
文献报道［5］，但其所使用的展开剂为苯与丙酮，因苯的毒
性大，出于对试验人员安全和减少试验对环境污染考虑，
本研究采用氯仿与乙酸乙酯作为展开剂。该方法操作简单、
分离度好、斑点清晰、经对 10 批药材及其不同炮制品进行
试验，均表明本薄层色谱鉴别方法重现性好，灵敏度高，
可用于黄精药材及炮制品的定性鉴别。
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(收稿日期:2014. 12. 05
檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾
)
(上接第 13 页)
是机体在药物作用下生成的新的内源性生理活性物质。这
些物质均须以血液为介质输送到靶点才能产生作用，药物
入血后通过肾脏的代谢排泄，由血液进入原尿中，外源性
成分 (肋柱花原型成分及其代谢产物)在尿液中的含量一
般情况下都要高于在血浆中的含量，所以，通过分析尿液
中的化学成分，阐明体内直接作用物质，将成为快速、准
确的研究肋柱花药效物质基础的有效方式。本实验采用液
相色谱 /离子阱质谱 (LC / MSD Trap)联用技术，结合保
留时间、紫外吸收和二级质谱分析，对肋柱花尿液中化学
成分进行了定性分析，共标识 19 个峰，1 个成分为药物原
型，14 个成分为代谢产物，其余为尿液内源性成分。若要
明确其肋柱花尿液化学成分结构，需通过制备技术以及核
磁共振等其他分析方法来进一步研究，以得到明确的结构。
参考文献
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