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Vol.34，Issue 2
January，2009
第 34 卷第 2 期
2009 年 1 月
中药复方抑瘤饮对小鼠 S180 移植瘤
血管生成的动态研究
韩志鹏，王润田*，李铁民，杨志强，崔 澂，丁军颖，
张征峥，邓郁青，王 平
（河北医科大学 基础研究所 免疫室，河北 石家庄 050017）
[摘要] 目的：研究荷 S180 瘤小鼠灌服中药复方抑瘤饮不同时间点肿瘤内血管生成的动态变化，揭示抑瘤饮体内抗瘤
的作用机制。方法：56 只 BALB/c 小鼠随机分为抑瘤饮组和对照组（n=28），每组分为 4 个亚组（每亚组 7 只）。右腋皮下
接种 S180 肿瘤细胞 24 h 后，抑瘤饮组小鼠灌服抑瘤饮，对照组小鼠灌服等量凉开水，每日 2 次，每次 0.5 mL；2 组分别
于灌服第 10，20，30，40 天点各处死一亚组小鼠。分离肿瘤制成石蜡包埋切片，免疫组化法检测肿瘤组织内血管生成（CD34
染色）、血管内皮生长因子（VEGF）、血管内皮生长因子受体-2（VEGFR-2）和内皮抑素（ES）的动态变化，结果以阳性
酶点（positive enzyme dot，PED）表示。结果：抑瘤饮能显著降低肿瘤组织内微血管生成：抑瘤饮组 CD34 在第 10，20，
30，40 天点 PED 均低于对照组（分别 P<0.05，P<0.01，P<0.01 和 P<0.01）。抑制 VEGF 和 VEGFR-2 的表达：抑瘤饮组
VEGF 在第 10，20，30，40 天点 PED 均低于对照组（分别 P<0.05，P<0.01，P<0.01 和 P<0.01）；抑瘤饮组 VEGFR-2 在
相应时间点均低于对照组（分别 P<0.05，P<0.01，P<0.01，P<0.01）。促进 ES 的表达：抑瘤饮组 ES 在相应时间点与对照
组比第 10 天点 PED 无明显差异，在第 20，30，40 天点 PED 均高于对照组（分别 P<0.05，P<0.05 和 P<0.01）。结论：抑
瘤饮体内可通过下调 VEGF 和 VEGFR-2 表达，上调 ES 表达，抑制肿瘤组织内血管生成发挥抗瘤作用。
[关键词] 抑瘤饮；肿瘤血管生成；CD34；血管内皮生长因子；血管内皮生长因子受体-2；内皮抑素
19抑瘤饮是依中医“扶正祛邪”理论组成的中
药复方水煎剂，主要组方：黄芪、党参、云芝、三
七、仙鹤草、墨旱莲、鸡血藤、卷柏、大枣、陈皮
等。其中黄芪和党参补气为君；云芝和墨旱莲益气
养阴、扶正强身，三七、鸡血藤和卷柏活血化瘀，
仙鹤草消积，共为臣；陈皮理气和胃、燥湿化痰为
佐；大枣调和诸药为使。全方合用，益气养阴，活
血化瘀，化痰消积，共同起到扶正祛邪抑瘤之功效。
本室前期的动物实验显示其体内对小鼠 S180 移植
瘤确有一定抑瘤效果，40 d 灌服抑瘤率可达 59% [1]，
但尚不知其体内对肿瘤组织内的血管生成有否作
用。为此，本研究以小鼠接种荷 S180 肿瘤后每日
灌服抑瘤饮，于不同时间点处死小鼠取瘤制备切片
行免疫组化染色，动态观察肿瘤组织内血管生成
(CD34 染色)及相关因子 VEGF，VEGFR-2 和 ES 表

[收稿日期] 2008-02-10
[基金项目] 河北省中医药管理局基金项目（2006054）
[通信作者] *王润田，Tel：（0311）86265559，E-mail：wangrt5686@sina.
com
达的变化，从影响肿瘤组织血管生成角度揭示抑瘤
饮体内抑制肿瘤生长的机制。
1 材料
1.1 动物与细胞 清洁级健康雌性 BALB/c 小鼠，
18～22 g，由河北医科大学实验动物中心提供，合
格证号 04-039。动物分笼饲养，自由摄食、饮水，
饲养间温度控制在（21±2）℃，相对湿度控制在
50%~60%。小鼠肉瘤细胞株 S180 为本实验室保存。
1.2 药物 抑瘤饮由河北保定新东方中医药研究
开发公司提供，河北保定新东方医院制剂（批号
20051227），按生药含量 750 g·L-1，GMP 条件下，
加水煎煮 3 次，每次 1 h，合并煎液，滤过，浓缩，
加乙醇至终浓度 70%，搅匀，静置，滤过，滤液减
压，回收乙醇，加水恢复煎液量。检测符合《中国
药典》2005 年版一部合剂项下规定。成人日剂量
100~250 mL，可分 2~3 次口服；小鼠（体重以每只
约 20 g 计）体内实验用抑瘤饮剂量经预实验确定，
以临床成人（体重以每人 50 kg 计）每日最低口服


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剂量 100 mL（约为 2 mL·kg –1），按小鼠与人剂量
换算倍数（50~100 倍）[2] 的最低倍数再降低 1 倍，
即相当于成人日口服剂量 25 倍，定为每只每日 1
mL，分 2 次灌服，每次 0.5 mL。
1.3 试剂 SP-9001 免疫组化染色试剂盒、SP-9002
免疫组化染色试剂盒和 ZLI9018 浓缩型 DAB 显色
试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号分
别为 K82721E，1368913，K85620F）；免疫组化染
色用一抗：小鼠抗小鼠 VEGF 单克隆抗体和小鼠抗
小鼠 VEGFR-2 单克隆抗体（Santa Cruz 公司，批号
分别是 E1407，T0924），兔抗小鼠 ES 多克隆抗体
和兔抗小鼠 CD34 多克隆抗体（武汉博士德生物工
程有限公司，批号分别为 BA1609，BA0532）。
2 方法
2.1 荷瘤小鼠模型的建立、分组和给药[1] 56 只
BALB/c 小鼠随机分为抑瘤饮组和对照组，每组 28
只；每组再随机各分为 4 个亚组，每亚组 7 只。S180
腹水瘤细胞用生理盐水 1 500 r·min-1 5 min，离心洗
涤 2 次，以 1×107 个/mL 的细胞行小鼠右腋皮下接
种，每只 0.2 mL。24 h 后，抑瘤饮组小鼠灌服抑瘤
饮，对照组小鼠灌服等量凉开水，每日 2 次，每次
0.5 mL。2 组分别于灌服第 10，20，30，40 天的次
日处死一亚组小鼠。
2.2 肿瘤组织获取及切片制备 依分组设定的处
死日摘眼球放血处死小鼠，完整剥离肿瘤。将肉眼
所见非坏死区域肿瘤组织浸于 10%福尔马林固定，
常规制蜡块做 4 μm 连续切片，室温保存供染色使
用。切片常规 HE 染色，光镜下行病理学观察。
2.3 切片免疫组化染色 [3] 分别以抗 CD34，
VEGF，VEGFR-2 及 ES 的抗体为一抗，阴性对照
用 PBS 代替一抗，严格按照试剂盒说明书行 SP 法
免疫组化染色。以肿瘤组织内出现棕黄色颗粒为阳
性染色。调整显微镜的光圈和亮度至最适观察参
数，在整个指标的测定过程中保持不变。每张切片
均先以低倍镜（10×10）找到染色组织区域，再以
高倍镜（10×40）在其上、下、左、右、中部各随
机选取 1 个视野共计 5 个视野进行图像分析。以 5
个视野阳性酶点（positive enzyme dot，PED）平均
值，作为该切片免疫组化染色定量图像分析结果。
2.4 统计学处理 数据以 x s± 表示。使用 SPSS
11.5 版统计软件，对所得免疫组化染色图像分析的
数据进行处理。同一指标同一时间点 2 组间比较采
用成组设计两样本均数比较 t 检验，同一指标同组
不同时间点之间比较采用完全随机设计的单因素
方差分析。P<0.05 为有显著性差别。
3 结果
3.1 组织病理学观察 第 10 天点即可见抑瘤饮组
移植瘤内肿瘤细胞密度减低和间质增加；第 20 天
点 2 组肿瘤组织均有坏死灶出现，但抑瘤饮组坏死
面积明显大于对照组；第 30 天至第 40 天点 2 组肿
瘤组织坏死面积均增大，但抑瘤饮组增大更为显著
（图 1）。

A~D. 灌服第 10，20，30，40 天。
图 1 小鼠不同时间点 2 组肿瘤组织变化（HE，×400）



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3.2 抑瘤饮对肿瘤组织血管生成的影响 CD34 是
血管内皮细胞的标记物，表达于血管内皮细胞胞
浆，其 PED 示微血管密度，反映肿瘤组织血管生长
情况。抑瘤饮组在第 10，20，30，40 天点的 CD34
的 PED 均低于对照组（分别为 P<0.05，P<0.01，
P<0.01，P<0.01）；其第 20，30，40 天点均低于其
第 10 天点（分别为 P<0.05，P<0.01，P<0.01），变
化趋势呈渐下降。对照组第 10，30，40 天点间无
明显差异，但均低于 20 天点（均 P<0.01），变化趋
势呈先上升后下降（表 1）。
表1 抑瘤饮对不同时间点S180移植瘤内CD34 PED的影响（ ±x s ，n=7）
组别 10 d 20 d 30 d 40 d
对 照 392.86±42.01 81.49±58.344) 386.31±54.916) 376.69±28.716)
抑瘤饮 334.46±33.381) 289.34±39.632,3) 257.09±40.002,4) 246.57±36.782,4)
注：与同时间点对照组相比 1)P<0.05，2)P<0.01；与同组内 10 d 点比 3)P<0.05，4)P<0.01；与同组内 20 d 点相比 5)P<0.05，6)P<0.01；与同组内
30 d 点相比 7)P<0.05，8)P<0.01（表 2 同）。

3.3 抑瘤饮对肿瘤组织 VEGF 表达的影响
VEGF 阳性染色主要见于 S180 肿瘤细胞胞浆中，
也可见细胞外着色。抑瘤饮组 VEGF 的 PED 在
第 10，20，30，40 天点均低于对照组（分别为
P<0.05，P<0.01，P<0.01，P<0.01），第 20，30
天点均高于第 10 天点（均 P<0.01），第 40 天点
明显低于第 30 天点（P<0.05）。对照组肿瘤 VEGF
的 PED 在第 20，30，40 天点明显高于第 10 天
点（均 P<0.01），第 40 天点显著低于第 30 天点
(P<0.05)。2 组变化趋势均呈先上升后下降，只
是抑瘤饮组最高点在第 20 天点，对照组最高点
在第 30 天点（表 2）。
3.4 抑瘤饮对肿瘤组织 VEGFR-2 表达的影响
VEGFR-2 阳性染色主要见于血管内皮细胞胞膜
和部分肿瘤细胞胞膜。抑瘤饮组 VEGFR-2 的 PED，
在第 10，20，30，40 天点明显低于对照组（分别
为 P<0.05，P<0.01，P<0.01，P<0.01）；第 20，30，
40天点显著低于第10天点（分别为P<0.05，P<0.01，
P<0.01），变化趋势呈渐下降。对照组 VEGFR-2 的
PED，在第 20 天点达到最大值，明显高于第 10，
40 天点（均 P<0.01），变化趋势为先上升后下降
(表 2)。
3.5 抑瘤饮对肿瘤组织 ES 表达的影响 ES 阳性
染色多见于肿瘤组织间质，部分微血管管腔内也可
见阳性着色。2 组在第 10 天点无明显差异。抑瘤饮
组在第 20，30，40 天点均高于对照组（分别为
P<0.05，P<0.05，P<0.01）和第 10 天点（均 P<0.01）。
对照组在第 30 天点为最大值，与第 10，20，40 天
点比较有明显差异（分别为 P<0.01，P<0.01，
P<0.05），呈先上升后下降趋势（表 2）。
表 2 抑瘤饮对 S180 移植瘤内血管生成相关分子表达的 PED 影响（ ±x s ，n=7）
VEGF VEGFR-2 ES
时间/d
对照 抑瘤饮 对照 抑瘤饮 对照 抑瘤饮
10 852.63±81.65 718.40±94.941) 618.63±59.08 523.91±64.661) 250.26±36.27 249.57±40.23
20 1168.40±96.694) 866.54±72.402,4) 750.09±56.724) 449.03±46.852,3) 298.60±44.41 350.03±40.921,4)
30 1292.60±147.544) 859.31±74.022,4) 684.91±72.86 400.06±60.122,4) 450.86±38.954,6) 499.40±40.291,4)
40 1124.74±139.644,7) 753.34±72.952,7) 644.06±60.256) 339.89±45.392,4) 398.43±34.197) 497.94±42.762,4)

4 讨论
体内肿瘤的生长有赖于肿瘤血管生成，当肿瘤
直径达到 1~2 mm 后，若无新生血管生成以提供营
养则不能继续增长[4]。因此，以新生血管为靶点对
肿瘤进行生物治疗，已成为近年的研究热点。
CD34 是血管内皮细胞的标记物，可用于标记
肿瘤组织中的微血管[5-7]；其免疫组化染色的阳性酶
点（PED）可反映肿瘤组织内微血管密度。本研究
发现，抑瘤饮组 CD34 的 PED 明显低于对照组，且
随用药时间延长其呈进行性降低。揭示抑瘤饮可以
抑制肿瘤血管的生长，且这种抑制作用可随用药时
间延长而增强。因此，抑制肿瘤血管生长，应是抑


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瘤饮体内抑瘤的机制之一。
体内肿瘤组织的血管生成，是肿瘤组织内促血
管生成因子与抑血管生成因子综合作用的结果，受
两者比势影响。研究表明，VEGF 在促进肿瘤血管
生成中起着至关重要的作用[8-11]，其之信号转导主
要通过 VEGFR-2 介导[12-13]。VEGF 与 VEGFR-2 结
合,诱导其磷酸化,通过一系列级联反应,引起血管内
皮细胞增殖,促进血管生成,为肿瘤细胞快速增长提
供营养，促进肿瘤生长。ES 是一种能够强烈抑制血
管形成的因子,在体内外均能特异性作用于内皮细
胞,抑制其增殖和迁移,诱导其凋亡，显著抑制肿瘤
的生长和转移[14]。因此，在肿瘤血管生成过程中，
VEGF 及 VEGFR-2 是促血管生成因子，而内皮抑
素（ES）是抑血管生成因子。
本研究结果显示，抑瘤饮体内能显著抑制肿瘤
促血管生成因子 VEGF 和 VEGFR-2 表达，同时又
能显著提高肿瘤抑血管生成因子 ES 的表达，其之
综合作用必然是利于抑制肿瘤血管生成。因此，提
高 ES 表达和降低 VEGF 及 VEGFR-2 表达，从而抑
制肿瘤血管生长，应是抑瘤饮体内抑瘤机制之一。
由于中药复方体内抑制肿瘤生长除涉及肿瘤血管
生成以外，还有可能与影响肿瘤组织中的免疫细胞
浸润[15-16]和肿瘤细胞凋亡[17-18]等有关。因此，在本
研究的基础上，进一步对荷瘤机体其他方面的抗瘤
作用进行动态研究，显然有益于更多地揭示抑瘤饮
的体内抗肿瘤机制，相关的工作正在进行中。
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Dynamic study on effect of Chinese medicine compound Yiliuyin on angiogenesis
in transplanted S180 tumor of mouse

HAN Zhipeng，WANG Runtian*，LI Tiemin，YANG Zhiqiang，CUI Cheng，DING Junying，
ZHANG Zhengzheng，DENG Yuqing，WANG Ping
(Department of Immunology，Institute of Basic Medical Science，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China)

[Abstract] Objective：To investigate the dynamic changes in angiogenesis within the tumor tissue of mice bearing S180
tumor at different day-points of oral administration with a Chinese medicine compound “Yiliuyin”(YLY) and to explore the
anti-tumor mechanisms of YLY in vivo. Method：Fifty-six BALB/c mice were divided into YLY group and control group (28
mice/group) and each group was divided into four subgroups (7 mice/subgroup)，randomly. After 24 hrs of inoculation with S180
tumor cells subcutaneously in the right axilla，YLY in the mice of YLY group and equal volume of cold boiled-water in the mice of
control group were administered orally twice every day，0.5 mL each time. The mice of one subgroup from the two groups apiece
were killed at 10，20，30 th and 40 th day-point of oral administration, respectively. The tumors were isolated and were made into
paraffin embedded sections. The dynamic changes of the angiogenesis（CD34 staining），vascular endothelial growth factor（VEGF），
vascular endothelial growth factor receptor-2 （ VEGFR-2 ） and endostatin （ ES ） in tumor tissue were detected by
immunohistochemistry staining，and the results were shown as PED ( positive enzyme dot ). Result：YLY could remarkably decrease
the angiogenesis within tumor tissues. The PED of CD34 in control group at 10，20，30 th and 40 th day-point was 392.86±42.01，
481.49±58.34，386.31±54.91 and 376.69±28.71，and that in YLY group was 334.46±33.38，289.34±39.63，257.09±40.00 and
246.57±36.78，respectively. The PED of CD34 in YLY group at each day-point was lower than that in control group (P<0.05，
P<0.01，P<0.01 and P<0.01，respectively). The PED of VEGF in control group at 10，20，30 th and 40 th day-point was
852.63±81.65，1 168.40±96.69，1 292.60±147.54 and 1 124.74±139.64，and that in YLY group was 718.40±94.94，866.54±72.40，
859.31±74.02 and 753.34±72.95，respectively. The PED of VEGF in YLY group at each day-point was lower than that in control
group (P <0.05，P <0.01，P <0.01 and P <0.01，respectively). The PED of VEGFR-2 in control group at 10th，20th，30th and 40th
day-point was 618.63±59.08，750.09±56.72，684.91±72.86 and 644.06±60.25，and that in YLY group was 523.91±64.66，
449.03±46.85，400.06±60.12 and 339.89±45.39，respectively. The PED of VEGFR-2 in YLY group at each day-point was lower than
that in control group (P <0.05，P <0.01，P <0.01 and P <0.01，respectively). The PED of ES in control group at 10th，20th，30th and
40th day-point was 250.26±36.27，298.60±44.41，450.86±38.95 and 398.43±34.19，and that in YLY group was 249.57±40.23，
350.03±40.92，499.40±40.29 and 497.94±42.76，respectively. There was no difference between the two groups at 10th day-point.The
PED of ES in YLY group was higher than that in control group at 20，30，40 th day-point （P <0.05，P <0.01 and P <0.01，
respectively）. Conclusion：YLY could exert the anti- tumor role by down-regulating the expression of VEGF and VEGFR-2，
up-regulating the expression of ES and inhibiting the angiogenesis within tumor tissue.
[Key words] Yiliuyin；tumor angiogenesis；CD34；VEGF；VEGFR-2；endostatin
[责任编辑 古云侠]