全 文 ：基于 ＲＡＰＤ标记的 ＳＣＡＲ分子标记技术
鉴定川牛膝及其混淆品
田孟良１，官宇１，刘帆１，袁继超１，杨华２
（１四川农业大学 农学院，四川 雅安 ６２５０１４；２四川农业大学 科技管理处，四川 雅安 ６２５０１４）
［摘要］ 目的：基于ＲＡＰＤ标记开发ＳＣＡＲ标记，为川牛膝及其混淆品鉴定提供有效方法。方法：建立了收集于四川天
全、宝兴、会理、金口河等地的１９个牛膝种群（包括川牛膝及其混淆品红牛膝、怀牛膝）的ＲＡＰＤ指纹图谱，从中找到能有效区
分上述材料的多态性谱带Ｆ３００，Ｆ５００进行克隆与测序；根据测序结果设计２对特异引物对１９份材料进行 ＰＣＲ扩增。结果：
引物ＳＣ３２０能稳定地区分川牛膝与怀牛膝，引物ＳＣ４９５则能稳定地区分川牛膝与红牛膝，２对引物结合能快速准确地鉴定川
牛膝、红牛膝和怀牛膝。结论：建立了鉴定川牛膝及其混淆品的ＳＣＡＲ标记技术体系
［关键词］ 川牛膝；混淆品；ＲＡＰＤ标记；ＳＣＡＲ标记
［收稿日期］ ２００９０９１１
［基金项目］ 国家科技支撑计划项目（２００６ＢＡＩ０６Ａ１２０２）
［通信作者］ 杨华，主要从事作物遗传育种研究，Ｅｍａｉｌ：ｙａｎｇｈｕａ
００１＠ｓｏｈｕｃｏｍ
［作者简介］ 田孟良，博士，副教授，主要从事中药材育种和生物技
术研究，Ｅｍａｉｌ：ｓｅｃｏｎｄａｔ＠ｑｑｃｏｍ
川牛膝ＲａｄｉｘＣｙａｔｈｕｌｅ为苋科Ａｍａｒａｎｔｈａｃｅａｅ植
物川牛膝ＣｙａｔｈｕｌａｏｆｉｃｉｎａｌｉｓＫｕａｎ的干燥根，微苦，
性平，具逐瘀通经，通利关节，利尿通淋的功效，是著
名川产道地药材之一，以四川天全、宝兴和乐山金口
河产量最大，天全产者品质最佳［１］。目前产区以头
花怀苋Ｃｃａｐｉｔａｔａ的根作为商品川牛膝，俗称红牛
膝，实为川牛膝伪品［２］。此外，在临床中药处方中
医务人员及患者常将川牛膝与怀牛膝（基原植物为
ＡｂｉｄｅｎｔａｔａＢＩ）混用。川牛膝、红牛膝和怀牛膝在
药材外观上非常相似，准确鉴定川牛膝、红牛膝和怀
牛膝有利于在生产中对品种正本清源、在医疗上准
确用药。
ＲＡＰＤ技术近年来在中药材种质资源遗传多样
性研究、中药混淆品代用品鉴定、多来源中药鉴定、
名贵中药鉴定、道地中药鉴定等方面得到了广泛应
用。但由于ＲＡＰＤ标记技术假阳性高、稳定性和重
复性差等缺陷，常常使得研究结果无法作为有效的
标记保存下来并用于中草药分类鉴定、筛选育种与
质量检验。将原 ＲＡＰＤ片段转化为 ＳＣＡＲ标记，就
能有效地克服 ＲＡＰＤ重复性欠佳的弱点。目前
ＳＣＡＲ标记技术已在人参、卡瓦胡椒、甘草、黄芪等
药用植物中得到应用［３６］，但川牛膝及其混淆品鉴别
的相关研究尚未见报道。
本研究拟采用ＲＡＰＤ标记技术对来源不同的川
牛膝及其混淆品红牛膝和怀牛膝进行多态性分析，
将获得的特异 ＲＡＰＤ标记转化为 ＳＣＡＲ标记，为快
速准确地鉴定川牛膝提供稳定高效的新方法。
１ 材料与方法
１１ 材料 ２００６年１１月—２００７年２月分别从四
川天全、西昌、宝兴、乐山等地收集牛膝种群１９个，
其中川牛膝种群１２个，红牛膝种群５个，怀牛膝种
群２个，各种群采集地见表１。每个种群分别收集
三年生种子，集中种植于四川省雅安市二郎山牛膝
ＧＡＰ基地。２００８年５月从每个二年生种群中随机
选择１０株新发幼苗植株，取适量叶片混合后加液氮
研磨至粉末，采用改良ＣＴＡＢ法提取基因组ＤＮＡ。
１２ ＲＡＰＤ标记扩增 用随机引物对供试材料基
因组ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增。反应体系为ＤＮＡ（５０ｍｇ
·Ｌ－１）０９μＬ，ＴａｑＢｕｆｅｒ（１０×；Ｍｇ２＋ｆｒｅｅ）２μＬ，
ＭｇＣｌ２（２５ｍｍｏｌ·Ｌ
－１）１２μＬ，ｄＮＴＰＭｉｘ（１０ｍｍｏｌ·
Ｌ－１ｅａｃｈ）１μＬ，引物（１０ｐｍｏｌ·Ｌ－１）０５μＬ，Ｔａｑ酶
（５Ｕ·μＬ－１）０３μＬ，加入 ｄｄＨ２Ｏ补齐到 ２０μＬ。
ＰＣＲ扩增程序为：９４℃预变性５ｍｉｎ，９４℃变性 １
ｍｉｎ，３７℃退火１ｍｉｎ，７２℃延伸２ｍｉｎ，共５个循
环；９４℃变性 １０ｓ，３７℃退火 １ｍｉｎ，７２℃延伸 ２
ｍｉｎ，共４０个循环；７２℃延伸１０ｍｉｎ。反应结束后
ＰＣＲ产物在１５％琼脂糖凝胶５Ｖ·ｃｍ－１的电压下
电泳３ｈ左右，然后在凝胶成像系统中观察照相。
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表１ 供试种群及来源
Ｎｏ 类型 采集地点 海拔／ｍ
１ 川牛膝 天全 １２００
２ 川牛膝 天全 １４００
３ 川牛膝 天全 １０００
４ 川牛膝 天全 １５００
５ 川牛膝 宝兴 １５００
６ 川牛膝 天全 １５００
７ 红牛膝 乐山 １７００
８ 川牛膝 西昌 １７００
９ 川牛膝 天全 １３００
１０ 川牛膝 天全 １３００
１１ 川牛膝 天全 １０００
１２ 红牛膝 天全 １３００
１３ 川牛膝 乐山 １７００
１４ 红牛膝 宝兴 １６００
１５ 红牛膝 宝兴 １６００
１６ 川牛膝 宝兴 １６００
１７ 怀牛膝 汉源 １４００
１８ 怀牛膝 会理 １２００
１９ 红牛膝 会理 １３００
用１００个１０ｂｐ的随机引物进行扩增，根据扩
增条带的有无将标记结果转化为“０，１”型数据，并
用ＮＴＳＹＳ３０进行聚类分析。根据扩增图谱筛选
能有效区分川牛膝、红牛膝和怀牛膝的特异性片段。
特异性条带的回收参照 ＵＮＩＱｋｉｔ（上海生工）说明
书；感受态细胞的制备、转化、阳性克隆的筛选鉴定
参照Ｓａｍｂｒｏｏｋ等［７］的方法。样品送上海英骏生物
技术有限公司测序。
１３ ＳＣＡＲ引物的设计及扩增 根据测序结果，参
照ＲＡＰＤ随机引物序列，在原有引物序列的基础上
向内延伸８～１２ｂｐ，设计并合成２对特异引物，对
１９份基因组 ＤＮＡ进行扩增，反应体系为 ＤＮＡ（５０
ｍｇ·Ｌ－１）２μＬ，ＴａｑＢｕｆｅｒ（１０×；Ｍｇ２＋ｆｒｅｅ）２μＬ，
ＭｇＣｌ２（２５ｍｍｏｌ·Ｌ
－１）１２μＬ，ｄＮＴＰＭｉｘ（１０ｍｍｏｌ·
Ｌ－１ｅａｃｈ）１μＬ，引物（１０ｐｍｏｌ·Ｌ－１）０５μＬ，Ｔａｑ酶
（５Ｕ·μＬ－１）０３μＬ，加入 ｄｄＨ２Ｏ补齐至 ２０μＬ。
混匀并离心后，按９４℃预变性４ｍｉｎ；９４℃变性１
ｍｉｎ，５５℃退火１ｍｉｎ，７２℃延伸２ｍｉｎ，共３０个循
环；７２℃延伸７ｍｉｎ。１５％琼脂糖凝胶电泳检测扩
增结果。
２ 结果与分析
２１ ＲＡＰＤ标记分析 从１００个随机引物中筛选
到２３个条带清晰、多态性好的随机引物对１９份材
料基因组ＤＮＡ进行 ＰＣＲ扩增，并基于扩增结果进
行聚类分析，将１９份材料聚为３类：第Ⅰ类为川牛
膝，第Ⅱ类为红牛膝，第Ⅲ类为怀牛膝，见图１，表明
ＲＡＰＤ标记能有效区分不同类型材料。进一步筛选
发现，引物ｓ９９能在相对分子质量３００ｂｐ左右处扩
增出特异性条带，将Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ区分开来，其扩增条
带命名为Ｆ３００；引物 ｓ２７８则能在５００ｂｐ左右处扩
增出特异性条带，将Ⅰ，Ⅱ区分开来，其扩增条带命
名Ｆ５００，见图２。
图１ １９份材料ＵＰＧＭＡ聚类图
Ａ引物ｓ９９；Ｂ引物ｓ２７８；从左至右分别为
ＤＮＡｍａｒｋｅｒ，１～１９号材料。
图２ 随机引物对１９份材料基因组ＤＮＡ的扩增结果
２２ ＲＡＰＤ特异片段回收、克隆及测序 对 Ｆ３００，
Ｆ５００片段进行回收、克隆、测序，Ｆ３００片段的实际
碱基数为 ３２０ｂｐ，Ｆ５００片段的实际碱基数为 ４９５
ｂｐ。在ＮＣＢＩ上对２条序列进行ｂｌａｓｔｎ搜索，未发现
同源序列，见图３。
２３ ＳＣＡＲ标记的建立 根据测序结果设计２对
ＰＣＲ特异引物，见表２。分别用合成的引物对１９个
材料的基因组 ＤＮＡ进行扩增。引物 ＳＣ３２０Ｆ，ＳＣ
３２０Ｒ在第Ⅲ类中有唯一的１条扩增带，约３００ｂｐ，
而在其他供试材料中均无相应的扩增带，这对引物
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Ａ引物ｓ９９扩增片段Ｆ３００；Ｂ引物ｓ２７８扩增片段Ｆ５００。
图３ 随机引物扩增片段的测序结果
可将怀牛膝从 １９份材料中区分出来；引物 ＳＣ
４９５Ｆ，ＳＣ４９５Ｒ在Ⅰ大类中有唯一的１条扩增带，约
５００ｂｐ，而在其他材料中均无相应的扩增带，这对引
物可将川牛膝从１９份材料中区分出来。这一结果
表明ＲＡＰＤ标记已被成功转化为 ＳＣＡＲ标记，可快
速、准确地鉴定川牛膝、红牛膝和怀牛膝，见图４。
表２ 川牛膝ＳＣＡＲ标记的构建
ＲＡＰＤ
引物
ＳＣＡＲ
引物
ＳＣＡＲ引物序列（５′３′）
退火温度
／℃
ｓ９９ ＳＣ３２０Ｆ ＣＣＡＴＧＡＣＴＴＧＴＣＣＴＣＴＣＡＡＣ ５６
ＳＣ３２０Ｒ ＡＧＡＡＧＡＣＡＧＡＧＧＡＡＧＣＣＴＡＴＧ
ｓ２７８ＳＣ４９５Ｆ ＴＴＣＡＧＧＧＣＡＣＡＡＴＧＧＧＣＴＴＧ ５９
ＳＣ４９５Ｒ ＴＴＣＡＧＧＧＣＡＣＴＣＡＣＡＡＡＴＣＴＧＧ
Ａ引物ＳＣ３２０；１～４川牛膝；５～６怀牛膝；
Ｂ引物ＳＣ４９５；１～３川牛膝；４～５红牛膝；
６～７怀牛膝；ＭＤＮＡＭａｒｋｅｒ。
图４ 川牛膝ＳＣＡＲ分子标记
３ 讨论
对川牛膝道地产区品种和生产情况进行调查的
结果表明，目前在道地产区作为川牛膝种植的品种
类型主要有传统地道品种川牛膝Ｃｏｆｉｃｉｎａｌｉｓ、混淆
品种头花杯苋Ｃｃａｐｉｔａｔａ（红牛膝）。二者均作为商
品牛膝在市场上流通，而且红牛膝因其产量较高种
植面积日益扩大。由于长期栽种忽视良种选育和提
纯，川牛膝品种退化严重，根条越来越小，纤维化程
度越来越高，原来的“油润、味甜、化渣”等特征几乎
丧失殆尽。进行川牛膝品种选育势在必行，弄清道
地产区川牛膝种质资源的遗传基础是重要的基础工
作。本研究用筛选到的２３个 ＲＡＰＤ随机引物对１９
份不同地理来源的川牛膝、红牛膝及怀牛膝材料进
行扩增，建立了川牛膝及其混淆品的 ＲＡＰＤ指纹图
谱，共扩增出４１９个谱带分子量在１４０～２５００ｂｐ的
ＲＡＰＤ位点，其中多态位点３７７个，多态性位点百分
率为９０％，与乌头、白芍、百合、野生人参等的ＲＡＰＤ
多态位点百分率相比，１９份材料的多态位点百分率
明显偏高［８］。从数据中去除５份红牛膝和２份怀牛
膝材料后，多态性位点百分率下降为３６８％。从地
理分布来看，川牛膝仅在四川西南部小范围内种植，
产地间的生态条件和海拔高度差异不大，遗传基础
较为狭窄。多态性的降低与川牛膝药材分布和生产
是相符合的。这一结果表明，川牛膝的遗传基础是
比较狭窄的，在育种中应当更多考虑现有川牛膝种
质资源的收集与提纯。
聚类分析将１９份材料分为３个类群，川牛膝、
红牛膝和怀牛膝各自聚为１类，表明 ＲＡＰＤ标记是
区分３类材料的有效分子标记。从ＲＡＰＤ图谱从中
找到能有效区分川牛膝、红牛膝和怀牛膝的多态性
谱带Ｆ３００，Ｆ５００进行测序，并根据序列设计出特异
性引物进行ＰＣＲ扩增，将 ＲＡＰＤ标记转化为 ＳＣＡＲ
标记。其中，ＳＣ３２０标记可以较快地稳定地在川牛
膝与怀牛膝中鉴定出怀牛膝，另一个ＳＣ４９５标记则
能稳定有效地在区分川牛膝与红牛膝。２个 ＳＣＡＲ
标记的ＰＣＲ结果表明所筛选的 ＳＣＡＲ标记特异性
好，稳定可靠，操作简单，是川牛膝鉴别中非常有效
的分子标记。
一般说来，能作为 ＳＣＡＲ标记区分不同类型材
料的ＤＮＡ序列往往有较重要的生物学意义［４６］。为
明确Ｆ３００及Ｆ５００这２条序列的功能，并进一步了
解其在川牛膝和红牛膝种群进化过程中的作用，在
ＮＣＢＩ上对这２个标记所扩增的 ＤＮＡ序列进行了
Ｂｌａｓｔ搜索，但未发现同源序列。还需要进行更深入
的工作以阐明这一问题。
［参考文献］
［１］ 万德光，彭成，赵军宁四川道地中药材志［Ｍ］成都：四川科
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第３５卷第８期
２０１０年４月
Ｖｏｌ３５，Ｉｓｓｕｅ ８
Ａｐｒｉｌ，２０１０
学技术出版社，２００５：４４
［２］ 谢宗万中药材品种论述［Ｍ］上海：上海卫生出版社，１９９４：
４０８
［３］ 邵鹏柱，曹晖中药分子鉴定［Ｍ］上海：复旦大学出版社，
２００４：１０９
［４］ 施江，辛莉，谭琳，等 一条卡瓦胡椒特异 ＲＡＰＤ带转化成
ＳＣＡＲ标记的研究［Ｊ］云南植物研究，２００７，２９（４）：４５７
［５］ 祁建军，李先恩，李学禹，等 甘草种子 ＳＣＡＲ标记的建立
［Ｊ］．中国农业科技导报，２００７，９（５）：１０１
［６］ 吴松权，祖元刚，吴基日膜荚黄芪ＳＣＡＲ标记的建立［Ｊ］植
物研究，２００８，２８（５）：５６０
［７］ ＳａｍｂｒｏｏｋＪ，ＦｒｉｔｓｃｈＥＦ，ＭａｎｉａｔｉｓＴＭｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ：Ａｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ［Ｍ］．ＵＳＡ：ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，
１９８９：５５
［８］ 田孟良，田迎秋，刘帆，等乌头种质资源遗传多样性的ＲＡＰＤ
分析［Ｊ］四川农业大学学报，２００７，２５（１）：６３
ＡｕｔｈｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＲａｄｉｘＣｙａｔｈｕｌｅａｎｄｉｔｓａｄｕｌｔｅｒａｎｔｓ
ｂａｓｅｄｏｎＳＣＡＲｍａｒｋｅｒｓ
ＴＩＡＮＭｅｎｇｌｉａｎｇ１，ＧＵＡＮＹｕ１，ＬＩＵＦａｎ１，ＹＵＡＮＪｉｃｈａｏ１，ＹＡＮＧＨｕａ２
（１ＣｏｌｅｇｅｏｆＡｇｒｏｎｏｍｙ，ＳｉｃｈｕａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａ′ａｎ６２５０１４，Ｃｈｉｎａ；
２ＳｅｃｔｉｏｎｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＭａｎａｇｅｍｅｎｔ，ＳｉｃｈｕａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａ′ａｎ，６２５０１４，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｃｈｕａｎｎｉｕｘｉ（ＲａｄｉｘＣｙａｔｈｕｌｅ）ｉｓｏｎｅｏｆｔｈｅｍｏｓｔｉｍｐｏｒｔａｎｔｇｅｏｈｅｒｂｉｎＳｉｃｈｕａｎｐｒｏｖｉｎｃｅ，ｗｈｉｃｈａｄｕｌｔｅｒａｎｔｓａｒｅ
Ｈｏｎｇｎｉｕｘｉ（Ｃｙａｔｈｕｌａｃａｐｉｔａｔａ）ａｎｄＨｕａｉｎｉｕｘｉ（Ａｃｈｙｒａｎｔｈｅｓｂｉｄｅｎｔａｔａ）．ＩｎｔｈｉｓｐａｐｅｒＣｈｕａｎｎｉｕｘｉａｎｄｉｔｓａｄｕｌｔｅｒａｎｔｓｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙ
ＳＣＡＲｍａｒｋｅｒｓ．ＮｉｎｅｔｅｅｎｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓｆｒｏｍＴｉａｎｑｕａｎ，Ｂａｏｘｉｎ，ＨｕｉｌｉａｎｄＪｉｎｋｏｕｈｅｗｅｒｅｃｏｌｅｃｔｅｄａｎｄｔｈｅｉｒＲＡＰＤｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｓｗｅｒｅｅｓ
ｔａｂｌｉｓｈｅｄ．ＢａｓｅｄｏｎｔｈｅＲＡＰＤｐａｔｅｒｎｓ，ｔｗｏｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｂａｎｄｓＦ３００ａｎｄＦ５００ｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄ，ｒｅｃｙｃｌｅｄ，ｃｌｏｎｅｄａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅｄ．Ａｃ
ｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｔｗｏｐａｉｒｓｏｆｓｅｑｕｅｎｃｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄａｍｐｌｉｆｉｅｄｒｅｇｉｏｎｓ（ＳＣＡＲ）ｐｒｉｍｅｒｓｗｅｒｅｄｅｓｉｇｎｅｄａｎｄｕｓｅｄｔｏａｍｐｌｉｆｙａｌ
ｍａｔｅｒｉａｌｓｔｏｐｒｏｖｅｔｈｅｅｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｄｉｆｅｒｅｎｔｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ．ＣｈｕａｎｎｉｕｘｉａｎｄＨｕｉｎｉｕｘｉｃｏｕｌｄｂｅｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｅｄｂｙｔｈｅ
ｐｒｉｍｅｒＳＣ３２０，ＣｈｕａｎｎｉｕｘｉａｎｄＨｏｎｇｎｉｕｘｉｃｏｕｌｄｂｅｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｅｄｂｙｔｈｅｐｒｉｍｅｒＳＣ４９５．ＣｏｍｂｉｎｉｎｇｔｈｅｔｗｏＳＣＡＲｍａｒｋｅｒｓ，Ｃｈｕａｎｎｉ
ｕｘｉ，Ｈｏｎｇｎｉｕｘｉａｎｄｈｕａｉｎｉｕｘｉｃｏｕｌｄｂｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｅｆｅｃｔｉｖｅｌｙａｎｄｑｕｉｃｋｌｙ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ ＲａｄｉｘＣｙａｔｈｕｌｅ；ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓｍｅｄｉｃｉｎａｌｍａｔｅｒｉａｌｓ；ＲＡＰＤｍａｒｋｅｒ；ＳＣＡＲｍａｒｋｅｒ
ｄｏｉ：１０．４２６８／ｃｊｃｍｍ２０１００８０３
［责任编辑 吕冬梅］
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第３５卷第８期
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Ｖｏｌ３５，Ｉｓｓｕｅ ８
Ａｐｒｉｌ，２０１０