全 文 ：灯盏细辛组分对脑神经细胞损伤保护作用的
谱效关系研究
黄勇１，齐晓岚２，官志忠２，王永林１，王爱民１，李翠兵１，迟明艳１
（１贵阳医学院 药学院，贵州 贵阳 ５５０００４；
２贵阳医学院 分子生物学重点实验室，贵州 贵阳 ５５０００４）
［摘要］ 目的：研究灯盏细辛中各组分对神经母细胞瘤（ＳＨＳＹ５Ｙ）细胞的保护作用，探讨其在阿尔茨海默病（ＡＤ）治疗
中的作用物质基础。方法：用柱色谱技术将灯盏细辛提取物划分为３个极性组分，并采用正交法将其配伍，以细胞ＭＴＴ还原
率、脂质过氧化产物（丙二醛，ＭＤＡ）、神经型尼古丁受体α７蛋白表达等为活性指标，研究灯盏细辛各配伍组分对 β淀粉样肽
（Ａβ）损伤神经细胞的保护作用；将各配伍组分活性信息与其相应的ＵＰＬＣ指纹图谱化学信息进行方差分析和相关性分析研
究，推测活性物质基础。结果：谱效相关性研究发现，灯盏细辛在指纹图谱中的Ｂ，Ｃ组分段具有明显活性；其中４，７～１２号色
谱峰与活性呈现正相关。结论：通过谱效研究，推测了灯盏细辛体外对抗 Ａβ神经细胞毒性的活性组分以及化学成分。为灯
盏细辛深层次研究开发奠定一定的实验基础。
［关键词］ 灯盏细辛；谱效关系；β淀粉样肽；阿尔茨海默氏病
［收稿日期］ ２００９０９１９
［基金项目］ 国家科技重大专项课题（２００８ＺＸ０９１０１０２１）；国际科
技合作项目（２００６ＤＦＡ３３５３０）
［通信作者］ 王永林，Ｔｅｌ：（０８５１）６９０８８８９９，Ｅｍａｉｌ：ｇｙｗｙｌ＠ｇｍｌ．
ｅｄｕ．ｃｎ
中药成分复杂，其特点是“多成分、多靶点、多
渠道”，往往不是一个有效成分，而是有效成分之间
的相互协同、相加甚至拮抗的共同效应发挥疗效，因
此中药应作为一个整体进行研究［１］。近年来，学者
们提出的中药谱效学［２］以及组分配伍的研究思
路［３］为中药成分复杂体系的药效物质基础研究提
供了借鉴，这不仅对中药复方，而且对于具有独特疗
效的单味中药药效物质基础的研究同样具有积极
意义。
灯盏细辛是临床广为应用的单味中药。对于灯
盏细辛的化学成分和药理活性已经进行了较多的基
础研究，发现其具有广泛的心脑血管方面的活
性［４］，但大量研究仅局限于灯盏细辛中的主要化学
成分之一的野黄芩苷上。作者最近的研究表明灯盏
细辛具有神经细胞保护作用［５］，而神经系统退变性
疾病，如阿尔茨海默病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ′ｓｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）正
是一组以胆碱能系统功能缺陷、氧化应激和神经信
号转导通路异常等为特征的原发性神经元变性的疾
病。作者还发现灯盏细辛的神经细胞保护作用来自
于其复杂的多化学组分，而并非单一成分。因此，在
某种程度上，灯盏细辛对神经系统病变保护作用机
制和物质基础尚未完全清楚。本研究采取中药谱效
学和组分配伍研究思路，以指纹图谱为指导采用
ＭＣＩ柱色谱技术，将灯盏细辛提取物划分为高中低
３个极性组分，将各组分按正交试验法组成配比不
同的９个组合物；对组合物进行 ＵＰＬＣ指纹分析和
β淀粉样肽损伤神经细胞模型保护作用试验，将指
纹图谱化学信息和药理活性信息，数据经统计学处
理，以挖掘组分和化学物质与活性的相关性，探讨灯
盏细辛中活性组分及活性成分。
１ 材料
１１ 药物与试剂
灯盏细辛药材产于贵阳市花溪区，由贵阳医学
院生药学研究室鉴定为菊科植物短葶飞蓬 Ｅｒｉｇｅｒｏｎ
ｂｒｅｖｉｓｃａｐｕｓ（Ｖａｎｔ）ｈａｎｄＭａｚｚ的干燥全草。野黄
芩苷、３，５二咖啡酰氧基奎宁酸、绿原酸购于中国药
品生物制品鉴定所（批号分别为 １１０８４２２００４０３，
１１１７８２２００８０１，０７５３２００１１３）；飞蓬苷、灯盏花苷、
灯盏甲素、３，４二咖啡酰氧基奎宁酸、４，５二咖啡酰
氧基奎宁酸等由贵阳医学院药学院提供（经 ＮＭＲ
结构鉴定，纯度 ＞９５％）。乙腈（色谱纯，美国天地
公司）；ＭＣＩＧＥＬ树脂（ＣＨＰ２０Ｐ，日本三菱化学）。
ＤＭＥＭ培养液购自ＧｉｂｃｏＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；源于人脑
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的神经母细胞瘤细胞株（ＳＨＳＹ５Ｙ细胞）购于 Ｇｅｒ
ｍａｎＣｏｌｅｃｔｉｏｎｏｆＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓａｎｄＣｅｌＣｕｌｔｕｒｅｓ公
司；羊抗α７及鼠抗β肌动蛋白（βａｃｔｉｎ）多克隆抗体
及ＨＲＰ标记的抗羊及抗鼠二抗购自ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｃ。
１２ 仪器
Ｗａｔｅｒｓ超高效液相色谱（ＵＰＬＣ）Ａｃｑｕｉｔｙ系统，
包括二元超高压溶剂系统、二极管阵列检测器、Ｅｍ
ｐｏｗｅｒ２色谱工作站。
１３ 灯盏细辛组分制备
由贵阳医学院药学院制备提供，灯盏药材以乙
醇提取，回收溶剂，加水定容为１ｇ·ｍＬ－１（生药），
冷藏，滤除不溶物。提取药液采用 ＭＣＩ树脂（甲醇
水梯度系统）划分为相对的高中低极性（Ａ，Ｂ，Ｃ）组
分段，回收溶剂后，水定容到３ｇ·ｍＬ－１备用。
２ 方法与结果
２１ 供试样品制备
按Ｌ９（３
４）正交试验设计，水平分别为０，１０，３０
ｍＬ，调配９组由灯盏细辛各极性组分段所组成的配
伍组分，混合均匀后统一定容到相同体积即可。
２２ 配伍组分ＵＰＬＣ指纹图谱
色谱条件：ＷａｔｅｒｓＡｃｑｕｉｔｙＵＰＬＣＢＥＨＣ１８色谱柱
（２１ｍｍ×１５０ｍｍ，１７μｍ），流动相０１％磷酸溶
液（Ａ）乙腈（Ｂ），梯度洗脱（Ｂ：０～５ｍｉｎ为４％，５～
６ｍｉｎ为１５％，９ｍｉｎ为１８％，１４ｍｉｎ为１９％，１８ｍｉｎ
为５０％），流速０３５ｍＬ· ｍｉｎ－１，检测波长３００ｎｍ，
柱温４５℃，进样前样品以甲醇稀释，滤过，进样 １
μＬ。对灯盏细辛全样及各组分进行指纹图谱分析，
对全样指纹图谱主要特征峰进行定位，共１２个特征
峰，其中指认８个（图１）。
Ⅰ全样；Ⅱ高极性组分；Ⅲ中极性组分；Ⅳ低极性组分；２飞蓬苷；４绿原酸；７灯盏花苷；８野黄芩苷；
９３，４二咖啡酰氧基奎宁酸；１０３，５二咖啡酰氧基奎宁酸；１１灯盏甲素；１２４，５二咖啡酰氧基奎宁酸。
图１ 灯盏细辛全样及各组分指纹图谱
２３ 灯盏细辛不同配伍组分对神经细胞的保护作
用［６］
２３１ 安全浓度筛查 将灯盏细辛乙醇提取药液
稀释为１％～５０％，处理 ＳＨＳＹ５Ｙ细胞后２４ｈ后测
定ＭＴＴ还原率，检测试验安全浓度范围。以灯盏细
辛全样筛查安全浓度，当＞１０％时 ＳＨＳＹ５Ｙ神经细
胞ＭＴＴ还原率出现下降趋势，＞２０％时细胞 ＭＴＴ
还原率明显降低，表明浓度过高对细胞有毒性作用。
因此选择５％作为本次研究浓度。
２３２ 细胞培养，β淀粉样肽及灯盏细辛的处理
先用含 １５％胎牛血清的 ＤＭＥＭ培养液培养 ＳＨ
ＳＹ５Ｙ细胞，待细胞生长稳定后，改用不含血清的
ＤＭＥＭ培养液继续培养，培养箱中含５％ＣＯ２，温度
３７℃。在 ＳＨＳＹ５Ｙ细胞中加入 １μｍｏｌ· Ｌ－１的
β淀粉样肽Ａβ１４２，培养 ４８ｈ。为观察灯盏细辛对
Ａβ毒性作用的影响，灯盏细辛各配伍组分培养２４ｈ
后，再加入 １μｍｏｌ· Ｌ－１Ａβ１４２培养４８ｈ。每个实验
组均设６个复孔。
２３３ 指标测定 ＭＴＴ测定：ＭＴＴ经活细胞线粒
体琥珀酸脱氢酶催化可生成蓝紫色的还原型 ＭＴＴ，
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该产物在４９０ｎｍ波长处有极大的吸收峰。ＭＤＡ测
定：收集培养神经细胞的培养液，测定丙二醛（脂质
过氧化的中间产物）含量，测定波长为 ５３２ｎｍ，操作
按照试剂盒说明书进行。尼古丁受体亚单位蛋白表
达测定：参照 Ｇｕａｎ等［７］的方法进行提取细胞膜蛋
白及用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ方法检测 β７ｎＡＣｈＲ亚单位蛋
白水平。以 βａｃｔｉｎ蛋白条带作为内参照，计算 α７
ｎＡＣｈＲ蛋白条带与之像素灰度的百分比值作为蛋
白质表达水平（表１）。
表１ Ｌ９（３
４）正交设计配伍组分活性测试结果（珋ｘ±ｓ，ｎ＝６）
Ｎｏ
ＭＴＴ
（Ａ）
ＭＤＡ
／ｍｍｏｌ· Ｌ－１
α７
／％
１ ０．４４３±０．０７８ ５．１８±０．６４ ５１±２３
２ ０．６３４±０．０６１ ４．２９±０．５７ ８１±１９
３ ０．７５５±０．０６９ ４．０５±０．７４ ８９±２１
４ ０．５５４±０．０６２ ５．０１±０．７６ ６４±２５
５ ０．７８０±０．０４９ ４．３２±０．７２ ８０±１９
６ ０．５７３±０．０６９ ４．７４±０．５８ ６９±２０
７ ０．６４４±０．０４９ ４．６２±０．７６ ７６±１９
８ ０．６１７±０．０５５ ４．５７±０．６６ ６７±２３
９ ０．６３２±０．０６７ ４．０５±０．６４ ７０±２２
注：各组配伍后分别定容到１００ｍＬ，全样组直接取３０ｍＬ定容
到１００ｍＬ。
２４ 灯盏细辛组分活性方差分析
以ＳＰＳＳ１１５统计学软件中Ｕｎｉｖａｒｉａｔｅ功能对以
上数据进行分析处理，ＢｅｔｗｅｅｎＳｕｂｊｅｃｔｓＥｆｅｃｔｓ统计
学检验结果为 Ｂ，Ｃ组分对 ＭＴＴ指标（细胞损伤修
复）有极显著性影响（Ｐ＜００１）；Ｂ组分对 ＭＤＡ指
标（脂质过氧化抑制）有极显著性影响（Ｐ＜００１）；
Ｃ组分对 β７ｎＡＣｈＲ蛋白表达有显著性影响（Ｐ＜
００５）。同时根据软件中 ＳＮＫ功能分析，除 Ｃ组分
对ＭＴＴ指标改善具有显著量效关系外（Ｐ＜００５），
Ｂ，Ｃ组分对以上细胞生物学指标的影响均无明显量
效关系。
２５ 灯盏细辛化学成分谱效相关性分析
利用 ＳＰＳＳ１１５软件的双变量（ｂｉｖａｒｉａｔｅ）相关
分析方法［８］，分析来源于各不同配伍组样品的１２个
特征色谱峰与生物活性指标的相关性。７～１２号色
谱峰与ＭＴＴ及α７ｎＡＣｈＲ蛋白表达指标相关显著，４
号和７号色谱峰与ＭＤＡ指标相关显著，且均呈现正
相关关系（表２）。研究结果提示４，７号色谱峰与对
抗脂质过氧化相关，７～１２号色谱峰与抑制细胞损
伤和上调尼古丁受体蛋白表达相关。综合以上试验
结果，灯盏细辛产生活性的主要成分可能为 ４号、
７～１２号色谱峰峰（分别为绿原酸、灯盏花苷、野黄
芩苷、３，４二咖啡酰氧基奎宁酸、３，５二咖啡酰氧基
奎宁酸、灯盏甲素、４，５二咖啡酰氧基奎宁酸）；结合
组分活性方差分析结果，以上物质峰亦主要出现在
Ｃ组分段。可以推测，灯盏细辛对抗 β淀粉样肽对
神经细胞毒性作用的药效物质基础，主要集中于双
咖啡酰类和黄酮类化合物。
表２ 各色谱峰与活性指标的相关系数
活性指标
特征峰峰号
１ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ １０ １１ １２
ＭＴＴ ０．０７１ ０．１３７ ０．０７１ ０．４４３ ０．３７４ ０．３７４ ０．６８０１） ０．７９７１） ０．７８９１） ０．７９８２） ０．７８９１） ０．７８９１）
ＭＤＡ －０．１５４ －０．２６７ －０．１５４ －０．６９２１） －０．６５０ －０．６５０ －０．８０４１） －０．５１６ －０．５０３ －０．５１８ －０．５０３ －０．５０３
α７ －０．０９０ －０．０１５ －０．０９０ ０．４８３ ０．４１８ ０．４１８ ０．６９９１） ０．７４９１） ０．７４１１） ０．７５１１） ０．７４１１） ０．７４１１）
注：１）Ｐ＜００５，２）Ｐ＜００１。
３ 讨论
β淀粉样肽沉淀的形成可诱导细胞凋亡、触发
氧化应激、介导炎症反应、影响胆碱能神经系统以及
导致Ｃａ２＋超载等，故普遍认为β淀粉样肽脑组织中
的沉积可能是阿尔茨海默病发生、发展的中心环节，
因此以β淀粉样肽为靶点的阿尔茨海默病防治策
略正在被广泛研究和应用［９］。本研究用 Ａβ１４２处理
人类ＳＨＳＹ５Ｙ神经细胞，模拟ＡＤ状态脑内神经细
胞的病理过程，以此作为研究灯盏细辛对抗 ＡＤ的
体外细胞模型，在药物干预后测定细胞 ＭＴＴ还原
率、脂质过氧化产物 ＭＤＡ和神经型尼古丁受体蛋
白表达等指标，全面评价药物的活性特征。
正交试验方差分析表明灯盏细辛体外对抗β淀
粉样肽神经损伤作用的活性部位主要集中在 Ｂ，Ｃ
组分；这一结论与谱效相关性分析得出的主要活性
物质群基本吻合，也与文献报道的灯盏细辛所含双
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咖啡酰类化合物和黄酮类化合物具有较强心脑血管
系统活性［４］具有较强的一致性。本研究结果提示
灯盏细辛对神经系统病变治疗作用机制和物质基础
可能与上述物质基础相关，印证了中药活性物质
“多成分、多途径、多靶点”综合作用特征，这对于阐
明灯盏细辛的作用物质基础及其作用机制，建立灯
盏细辛及其提取物的多指标质量控制标准具有积极
意义。相关灯盏细辛多指标质量控制方面的工作本
课题组已经开展，有关研究论文正待发表。在此基
础之上的灯盏细辛化学成分谱毒相关性作用，整体
水平抗神经损伤研究值得开展。
有文献研究表明，由灯盏细辛乙醇提取物中分
离的非极性成分木栓酮具有显著的 β淀粉样肽聚
集抑制活性［１０］，而 β淀粉样肽的生成和蓄积正是
ＡＤ发病机制的源头过程。因此对灯盏细辛神经损
伤保护作用的深度研究，其应用模型与筛选手段不
应局限。
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Ｓｔｕｄｙｏｎｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｓｃｏｒｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｏｆｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ
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２ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＧａｉｙａｎｇＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｅｇｅ，Ｇｕｉｙａｎｇ５５０００４，Ｃｈｉｎａ）
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［责任编辑 张宁宁］
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