全 文 ：收稿日期:2015-11-25
基金项目:国家自然科学基金(81160516，81560570) ;贵州省中药现代化科技产业研究开发专项项目(黔科合重 G字［2013］4001)
作者简介:胡露(1989-) ，女，在读硕士研究生，专业方向:中药药效物质基础研究;E-mail:232217786@ qq. com。
* 通讯作者:李勇军，Tel:0851-86908468，E-mail:liyongjun026@ 126. com。
·质量分析·
基于谱效关系的头花蓼抑菌作用物质基础研究
胡 露1，2，张 锦1，2，蔺良才1，3，廖尚高1，3，严 征4，徐国波1，3，李勇军1，3*
(1. 贵州医科大学药学院，贵州 贵阳 550004;2. 贵州省药物制剂重点实验室，贵州 贵阳 550004;3. 民族
药与中药开发应用教育部工程研究中心，贵州 贵阳 550004;4. 贵州医科大学公共卫生学院，贵州 贵阳
550004)
摘要 目的:明确头花蓼抗菌作用的物质基础。方法:采用 D101 大孔树脂和 MCI柱层析技术分段制备头花蓼
各组分;采用 UHPLC-UV技术建立头花蓼各组分的图谱，并通过对照品对主要色谱峰进行归属指认;采用均匀设
计，将获得的组分配制成峰组成各不相同的样品;通过考察各样品对泌尿系统主要感染菌大肠埃希菌的最低抑菌
浓度(MIC)确定它们的抑菌活性;运用灰色关联度分析法对 1 /MIC 与色谱峰峰面积进行相关性分析，明确与抑菌
活性相关的主要色谱峰，确定头花蓼抑菌作用的物质基础。结果:色谱峰没食子酸(1)、表儿茶素(6)、儿茶素(8)、
芦丁(13)、槲皮素-3-O-(2″-O-没食子酰基)-β-D-吡喃葡萄糖苷(17)和槲皮素(18)与 1 /MIC 关联度较好(＞ 0. 8)。
结论:头花蓼抑菌作用是其多个化学成分共同作用的结果，没食子酸、表儿茶素、儿茶素、芦丁、槲皮素-3-O-(2″-O-
没食子酰基)-β-D-吡喃葡萄糖苷和槲皮素是头花蓼发挥抑菌作用的主要物质基础。该研究结果为头花蓼及其相关
产品的质量控制及深层次开发奠定了基础。
关键词 头花蓼;抗菌作用;谱效关系;灰色关联度分析
中图分类号:Ｒ284. 1 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2016)09-2037-04
DOI:10. 13863 / j. issn1001-4454. 2016. 09. 026
A Study on the Antibacterial Material Basis of Polygonum capitatum by Spectrum-effect Ｒelationship
HU Lu1，2，ZHANG Jin1，2，LIN Liang-cai1，3，LIAO Shang-gao1，3，YAN Zheng4，XU Guo-bo1，3，LI Yong-jun1，3
(1. School of Pharmacy，Guizhou Medical University，Guiyang 550004，China;2. Guizhou Provincial Key Laboratory of Pharmaceutics，
Guiyang 550004，China;3. Engineering Ｒesearch Center For the Development and Application of Ethnic Medicine and TCM，Ministry
of Education，Guiyang 550004，China;4. School of Public Health，Guizhou Medical University，Guiyang 550004，China)
Abstract Objective:To clarify the antibacterial material basis of Polygonum capitatum. Methods:D101 macroporous resin and
MCI column chromatographic methods were used for the preparation of various fractions，while UHPLC-UV methods were used to estab-
lish the chromatogram for the fractions，and the chromatographic peaks were identified by comparing their retention times and UV spec-
tra with the authentic standards;uniform design was adopted for the preparation of samples with different peak concentrations，and their
antibacterial effects were evaluated by determining their MIC against Escherichia coli，the bacterium generally found in urinary tract in-
fections. Grey relational analysis was employed to investigate the relationship between the 1 /MIC values and the peak areas and to reveal
the antibacterial material basis of Polygonum capitatum. Ｒesults:Peaks 1(gallic acid) ，6(epicatechin) ，8(catechin) ，13(rutin) ，17
(quercetin-3-O-(2″-O-galloyl)-β-D-glucopyranoside)and 18(quercetin)showed a better correlation(grey relational grades were higher
than 0. 8)to the antibacterial activity. Conclusion:The antibacterial activity of Polygonum capitatum is attributed to the holistic effects of
most of the constitutional compounds，and gallic acid，epicatechin，catechin，rutin，quercetin-3-O-(2″-O-galloyl)-β-D-glucopyranoside
and quercetin are the main antibacterial material basis of Polygonum capitatum. This study forms a strong basis for the quality control
and exploitation of Polygonum capitatum and its products.
Key words Polygonum capitatum Buch. -Ham. ex D. Don;Antibacterial activity;Spectrum-effect relationship;Grey relational a-
nalysis
泌尿系统感染是当前临床上常见的细菌感染疾
病之一，在我国发病率达到 0. 91%〔1〕，大肠埃希菌
是泌尿系统感染的主要致病菌。头花蓼 Polygonum
capitatum Buch. -Ham. ex D. Don 系蓼科蓼属多年生
草本植物，全草入药，具有清热利湿、活血止痛的功
效，主要用于治疗痢疾、肾盂肾炎、膀胱炎、尿路结
石、风湿痛、跌打损伤、痄腮、疮疡、湿疹等〔2〕。在前
期研究中，笔者发现头花蓼抗菌作用与多种成分有
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关，富含的黄酮组分是头花蓼的主要抗菌有效组
分〔3〕，但是，究竟哪些成分与头花蓼的抗菌作用相
关尚不明确。
本文采用 D101 大孔树脂和 MCI 柱层析技术分
段制备头花蓼各组分，利用均匀设计，配制由各组分
配比获得的样品，建立各样品的 UHPLC 图谱，并考
察样品对大肠埃希菌的最低抑菌浓度(MIC) ;运用
灰色关联度分析法对 1 /MIC 与色谱峰峰面积进行
相关性分析，明确头花蓼发挥抑菌作用的主要物质。
1 仪器与材料
1. 1 仪器 UltiMate 3000 型高效液相色谱仪(包
括系统控制器，输液泵，脱气组件，低压梯度组件，自
动进样器，柱温箱，温控样品室，UV-DAD 检测器，
Chromeleon色谱数据工作站) ;AE240 1 /10 万电子
天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司) ;超纯水机
(四川沃特尔科技发展有限公司) ;电热恒温培养箱
(天津市泰斯特仪器有限公司) ;恒温振荡培养箱
(上海精宏实验设备有限公司)。
1. 2 材料 实验用头花蓼药材购自贵州施秉头花
蓼 GAP种植基地，由贵阳医学院生药教研室龙庆德
副教授鉴定为蓼科蓼属植物头花蓼 Polygonum capi-
tatum Buch. -Ham. ex D. Don的全草;没食子酸、原儿
茶酸、表儿茶素、儿茶素、杨梅苷、芦丁、陆地棉苷、鞣
花酸、槲皮苷、槲皮素-3-O-(2″-O-没食子酰基)-β-D-
吡喃葡萄糖苷、槲皮素对照品均由本实验室从头花
蓼药材中提取分离制备得到〔4，5〕，HPLC 质量分数均
大于 98%;环丙沙星购自北京索莱宝科技有限公
司;乙醇为分析纯(上海振兴化工一厂) ;甲酸、甲醇
为色谱纯(Fisher Scientific 公司) ;MCI GEL 树脂
(CHP20P，日本三菱化学) ;D101 大孔吸附树脂柱
(日本三菱化学公司) ;MH(A)培养基(北京索莱宝
科技有限公司) ;MH 液体培养基(杭州微生物试剂
有限公司) ;标准株大肠埃希菌 ATCC25922(批号:
10104-2a18)购自中国食品药品检定研究所。
2 方法与结果
2. 1 头花蓼组分制备〔3〕 取头花蓼药材 2 kg，加
水煎煮 2 次，每次 2 h，过滤，合并煎煮液并浓缩至一
定体积，加入 3 倍量 95%乙醇，冷浸 24 h过滤，滤液
浓缩至浸膏，浸膏用水溶解后上 D101 大孔树脂，收
集 80%乙醇洗脱液，洗脱液回收乙醇，浓缩至浸膏，
得头花蓼有效组分(PCAF) ;所得浸膏水溶解后上
MCI柱，分别以 3 倍柱体积的 10%(A)、20%(B)、
30%(C)、40%(D)、50%(E)、95%(F)乙醇梯度洗
脱，收集洗脱液，浓缩干燥，分别得到 6 个组分 Fr. A
～ F，将 6 个组分配制成浓度均为 1 mg /mL的溶液。
2. 2 均匀设计试验方案 采用均匀设计表 U22
(226)进行组分配比，上述制备的 6 个组分 Fr. A ～ F
作为考察因子，设计为 22 个剂量水平。6 个组分在
22 个头花蓼供试品溶液中的配比见表 1。按照表 1
的配比配制 22 个头花蓼供试品溶液。
表 1 6 个组分(Fr. A ～ F)在 22 个头花蓼供试品
溶液中的原始配比(mg)
样品 /组分 A B C D E F
S1 0. 00 8. 00 13. 71 14. 86 18. 29 22. 86
S2 1. 14 17. 14 2. 29 4. 57 11. 43 20. 57
S3 2. 28 0. 00 17. 14 29. 57 4. 57 18. 29
S4 3. 43 9. 14 9. 57 10. 29 24. 00 16. 00
S5 4. 57 18. 29 20. 57 0. 00 17. 14 13. 71
S6 5. 72 1. 14 9. 14 16. 00 10. 29 11. 43
S7 6. 86 10. 29 24. 00 5. 72 3. 43 9. 14
S8 8. 00 19. 43 12. 57 21. 71 22. 86 6. 86
S9 9. 14 2. 29 1. 14 1. 14 16. 00 4. 57
S10 10. 29 11. 43 16. 00 1. 14 9. 14 2. 29
S11 11. 43 20. 57 4. 57 17. 14 2. 29 0. 00
S12 12. 57 3. 43 19. 43 6. 86 21. 71 24. 00
S13 13. 71 12. 57 8. 00 22. 86 14. 86 21. 71
S14 14. 86 21. 71 22. 86 12. 57 8. 00 19. 43
S15 16. 00 4. 57 11. 43 2. 29 1. 14 17. 14
S16 17. 14 13. 71 0. 00 18. 29 20. 57 14. 86
S17 18. 29 22. 86 14. 86 8. 00 13. 71 12. 57
S18 19. 43 5. 72 3. 43 24. 00 6. 86 10. 29
S19 20. 57 14. 86 18. 29 13. 71 0. 00 8. 00
S20 21. 71 24. 00 6. 86 3. 43 19. 43 5. 72
S21 22. 86 6. 86 21. 71 19. 43 12. 57 3. 43
S22 24. 00 16. 00 10. 29 9. 14 5. 72 1. 14
2. 2 PCAF段和分段组分的 UHPLC分析
2. 2. 1 色谱条件:Diamonsil C18 (250 mm × 4. 6
mm，5 μm)色谱柱;流动相:0. 1% 甲酸甲醇溶液
(A)-0. 1%甲酸溶液(B) ，梯度洗脱(0 ～ 5 min，10%
～20% A;5 ～ 25 min，20% ～ 40% A;25 ～ 42 min，
40% ～ 70% A) ;流速:1. 0 mL /min;柱温:45 ℃，进
样前样品以甲醇稀释至 4 mg /mL，0. 45 μm 微孔滤
膜滤过，进样量:10 μL。
2. 2. 2 UHPLC 分析及色谱峰归属:对 PCAF 段以
及分段组分进行 UHPLC 分析，实验分别考察了
220、254、270、300、330 nm 等 5 个波长对样品测定
的影响，发现在 270 nm 下，峰相对较多且响应度较
高，故确定各样品的特征图谱检测波长为 270 nm。
UHPLC色谱图共标定了 18 个特征峰，具有较好的
分离度。通过对照品与色谱图中色谱峰的保留时间
及谱图比对，鉴定了 11 个色谱峰，结果见图 1。
2. 3 MIC的测定〔6〕
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图 1 头花蓼有效组分(PCAF)及其亚组分(A ～ F)与混合对照品(DZP)的 UHPLC图谱
1. 没食子酸 3. 原儿茶酸 6. 表儿茶素 8. 儿茶素 12. 杨梅苷 13. 芦丁 14. 陆地棉苷 15. 鞣花酸 16. 槲皮苷
17. 槲皮素-3-O-(2″-O-没食子酰基)-β-D-吡喃葡萄糖苷 18. 槲皮素
2. 3. 1 细菌的培养与菌液制备:将选定的实验菌
株接种 MH于培养基上，37 ℃孵育 24 h，挑取菌落
至 2 ～ 3 mL液体培养基中，进行摇菌培养 6 h，将菌
液校正至 0. 5 麦氏比浊单位，使其含菌量为 1. 5 ×
108 CFU /mL。0. 5 麦氏比浊单位的菌悬液进行
1∶ 150稀释，使每管含量约为 1 × 106 CFU /mL。
2. 3. 2 测定:按美国临床实验室标准化委员会
NCCLS推荐的液体稀释法测定实验菌株的 MIC 值，
通过琼脂平板抑菌观察上述不同组分抗菌的 MIC
结果。每个组分均有 4 个浓度，分别为 70、60、50、
40 mg /mL，以 2 倍稀释法对药物进行稀释，稀释液
为无菌 MH液体培养基，向每 50 μL 的组分的系列
稀释 96 孔板中加入 50 μL校正的菌悬液(最终接种
菌量约为 5 × 105 CFU /mL)。以环丙沙星作阳性对
照。37 ℃培养 24 h，分别转种 MH 琼脂平板培养
基，24 h后无细菌生长的微孔则为药物最低抑菌浓
度(MIC)。结果见表 2。
2. 4 灰色关联度分析:分别以各样品对受试菌株
抑菌作用的 1 /MIC值为母序列，以各样品中图谱特
征峰的峰面积为子序列。将原始数据标准化处理
(归一化法) ，母序列记为{X0(k) }，子序列记为{Xi
(k) }，则母序列与子序列的关联系数 Loi(k)可由下
式计算:
Loi(k)=(Δmax + Δmin)/(Δoi(k)+ ρΔmax)
式中，Δoi(k)表示两比较序列的绝对值差，即
Δoi(k)=︱X0(K)－ XI(K)︱(1≤ i≤m) ，Δmax和
Δmin分别表示所有比较序列绝对差中的最大值和最
小值。ρ为 0. 5。结果见表 3。
由表 3 可知，头花蓼抑菌作用是其多个化学成
分共同作用的结果，6 个峰(1、18、13、17、6、8)与 1 /
表 2 22 个头花蓼供试品溶液对大肠埃希菌的
MIC结果(mg/mL)
样品 MIC 样品 MIC
S1 2. 557 S12 0. 944
S2 0. 791 S13 0. 627
S3 2. 644 S14 2. 166
S4 4. 875 S15 1. 081
S5 2. 222 S16 1. 253
S6 3. 094 S17 0. 405
S7 0. 953 S18 1. 219
S8 9. 525 S19 0. 781
S9 4. 801 S20 0. 641
S10 0. 552 S21 0. 788
S11 0. 813 S22 0. 952
表 3 头花蓼各共有色谱峰与 1 /MIC
关联度分析结果
关联序 峰号 关联度 关联序 峰号 关联度
1 1 0. 8366 10 12 0. 7822
2 18 0. 8217 11 11 0. 7810
3 13 0. 8175 12 7 0. 7798
4 17 0. 8148 13 14 0. 7797
5 6 0. 8052 14 9 0. 7792
6 8 0. 8016 15 15 0. 7625
7 10 0. 7873 16 4 0. 7264
8 16 0. 7855 17 2 0. 6004
9 3 0. 7828 18 5 0. 5245
MIC的关联度大于 0. 8，表明这些成分［没食子酸、
槲皮素、芦丁、槲皮素-3-O-(2″-O-没食子酰基)-β-D-
吡喃葡萄糖苷、表儿茶素和儿茶素］是头花蓼发挥
抑菌作用的主要物质基础。
3 讨论
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头花蓼在临床上治疗泌尿系统感染有良好的疗
效，故实验选用泌尿系统感染的主要致病菌大肠埃
希菌作为实验受试菌株，以 MIC 值作为药效考察指
标。本实验以头花蓼的整体药效为基础，在有效组
分分离的基础上利用均匀设计法设计实验，不仅有
效解决了色谱峰峰面积多样性的问题，大大减少了
试验次数，通过分析处理试验数据，能够有效反映各
因素对试验结果的影响。
灰色关联度分析法是一种用灰色关联度来描述
两因素变化的态势(方向、大小和速度等)、了解因
素间关系的多因素统计分析方法，在数据较少、因素
较多的条件下相对于回归分析具有独特优势，已在
中药药效物质基础和谱效关系的研究中得到应用。
在所确定的 6 个主要色谱峰(1、18、13、17、6、8)中，
依据关联度的大小，各成分对抑菌作用贡献的大小
顺序为 1 ＞ 18 ＞ 13 ＞ 17 ＞ 6 ＞ 8，表明作为主要药效
物质基础的这些化合物对头花蓼抗菌作用的贡献依
次降低。结果表明通过灰色关联度分析不仅可以有
效揭示中药中的药效物质，也能对各成分对药效的
贡献大小进行评价，对中药等复杂体系中药效物质
基础的研究以及活性物质的发现具有重要意义。
参 考 文 献
［1］闫学政 . 浅谈泌尿系统感染的临床研究进展［J］．当代
医药论丛，2014，12(7) :280-281.
［2］ 国家中医药管理局《中华本草》编委会 . 中华本草
［M］．第二册 . 上海:上海科学技术出版社，1999:646-
647.
［3］ Liao SG，Zhang LJ，Sun F，et al. Antibacterial and anti-in-
flammatory effects of extracts and fractions from Polygonum
capitatum［J］． Journal of Ethnopharmacology，2011，134
(3) :1006-1009.
［4］张丽娟，王永林，王珍，等 . 头花蓼活性组分化学成分研
究［J］．中药材，2012，35(9) :1425-1428.
［5］张丽娟，廖尚高，詹哲浩，等 . 头花蓼酚酸类化学成分研
究［J］．时珍国医国药，2010，21(8) :1946-1947.
［6］张学沛，朱盛山，刘静，等 . 评价中药体外抑菌法的研究
进展［J］．药物评价研究，2014，37(2) :188-192.
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