全 文 ：ＨＰＬＣ测定大鼠脑脊液中梓醇的含量
何瑶１，祝慧凤２，李万玉１，陈刚３，李卓恒１，徐晓玉１，２
（１．重庆医科大学 药学院，重庆 ４０００１６；２．西南大学 药学院，重庆 ４００７１６；
３．重庆工商大学 药物化学与化学生物学研究中心，重庆 ４０００６７）
［摘要］ 目的：建立大鼠脑脊液中梓醇的含量测定方法。方法：大鼠按５０ｍｇ·ｋｇ－１尾静脉注射１０ｇ·Ｌ－１梓醇生理盐
水注射液，４０ｍｉｎ后，经大脑蛛网膜下腔抽取脑脊液；另抽取正常大鼠脑脊液作为空白对照，置－２０℃冰箱保存备用。样品经
处理后用ＨＰＬＣ检测。选用ＨｙｐｅｒｓｉｌＣ１８反相色谱柱，流动相为水乙腈（９９５∶０５），流速１０ｍＬ·ｍｉｎ
－１，检测波长２１０ｎｍ。
结果：脑脊液中梓醇在０５～４０ｍｇ·Ｌ－１浓度线性关系良好，ｒ＝０９９９７；测得低、中、高浓度绝对回收率为（９０２±１７１）％，
（８９１±１１７）％，（８６９±０９８）％；方法回收率为（９９８±１９８）％，（１０１１±３０４）％，（１００１±２３０）％；日内、日间精密度均
小于４％，在－２０℃下冷冻保存１５ｄ稳定。结论：本方法操作简便，能较准确的测出脑脊液中的梓醇含量。
［关键词］ 梓醇；大鼠；脑脊液；ＨＰＬＣ
［收稿日期］ ２００８１２０２
［基金项目］ 国家自然科学基金项目（３００７０９１５）
［通信作者］ 徐晓玉，Ｔｅｌ：（０２３）６８２５０７６５，Ｅｍａｉｌ：ｘｘｙ０６１８＠ｓｉｎａ．
ｃｏｍ
［作者简介］ 何瑶，硕士研究生，主要从事血管生成中药药理研究，
Ｔｅｌ：１３５９４１５５８６７，Ｅｍａｉｌ：ｋｏｗｈｌ２００３＠１６３．ｃｏｍ
梓醇（ｃａｔａｌｐｏｌ）是地黄 ＲｅｈｍａｎｎｉａｇｌｕｔｉｎｏｓａＬｉｂ
ｓｃｈ．的主要有效成分之一，是其“滋阴”作用的有效
活性成分［１］，为一种不太稳定的环烯醚萜苷类化合
物，具有利尿、缓泻、降血糖、保肝等多种药理活
性［２］。最新研究表明，梓醇对缺血性脑中风具有显
著的神经保护功能，并能激活脑神经元［３５］。但梓醇
作为水溶性物质，能否跨过血脑屏障（ｂｌｏｏｄｂｒａｉｎ
ｂａｒｉｅｒ，ＢＢＢ）发挥作用仍没有相关报道。本实验建
立了以ＨＰＬＣ测定脑脊液中梓醇的方法，其具有操
作简便，重复性好等特点，为进一步研究梓醇透过
ＢＢＢ的机制提供了其含量测定的方法学支持。
１ 材料
１．１ 仪器
ＬＣ２０１０高效液相色谱仪（含２０１０四元梯度泵
和２０１０紫外检测器，日本Ｓｈｉｍａｄｚｕ公司），７７５２ｉ进
样阀（美国Ｒｈｅｏｄｙｎｅ公司），ＨｙｐｅｒｓｉｌＣ１８色谱柱（大
连依利特公司）；８００型离心沉淀器（上海手术器械
十厂），ＡＥ２４０电子天平（瑞士ＭｅｔｌｅｒＴｏｌｅｄｏ公司），
ＷＨ２微型涡旋混合仪（上海沪西分析仪器厂），
ｂｃｄ１７６型家用冰箱（青岛海尔集团）。
１．２ 动物
雄性 ＳＤ大鼠 １０只，体重（２２０±１５）ｇ，周龄
（１２±２５）周。合格证号２００７０００３。
１．３ 药品与试剂
梓醇对照品（９９２％，中国药品生物制品检定
所，１１０８０８２００６０８），乙腈（色谱纯，天津四友公司，
２００７０８１４１１０），甲醇 （色谱纯，天津四友公司，
２００７０９０１１０２），超纯水 （重庆医科大学药学院
制备）。
２ 方法与结果
２．１ 色谱条件
ＨｙｐｅｒｓｉｌＣ１８色谱柱（４６ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ），
流动相水乙腈（９９５∶０５），流速１０ｍＬ·ｍｉｎ－１，
检测波长２１０ｎｍ，进样量２０μＬ。
２．２ 梓醇标准溶液的制备
精密称取梓醇对照品 １００ｍｇ于 １０ｍＬ量瓶
中，用超纯水溶解并稀释至刻度，配制成１０ｇ·Ｌ－１
的标准液，置于４℃冰箱中保存。
２．３ 脑脊液样品的采集
将１０只大鼠随机分为对照组和给药组，每组各
５只。对照组大鼠不给药，经大脑蛛网膜下腔抽取
脑脊液，分别采集脑脊液约０１ｍＬ，作为空白脑脊
液，即对照组脑脊液；给药组大鼠按５０ｍｇ·ｋｇ－１
尾静脉注射 １０ｇ·Ｌ－１梓醇生理盐水注射液，４０
ｍｉｎ后，经蛛网膜下腔分别抽取脑脊液约０１ｍＬ，即
给药组脑脊液。采集完毕后，将脑脊液样品置 －２０
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℃冰箱保存备用。
２．４ 脑脊液样品的处理
将大鼠脑脊液样品０１ｍＬ置于１５ｍＬ离心管
中，加入０７ｍＬ甲醇乙腈（１∶１０）混合液，旋涡混合
２ｍｉｎ后，４０００ｒ·ｍｉｎ－１离心１０ｍｉｎ，取上清液，置
１０ｍＬ离心管中，于４０℃水浴中，氮气吹干，残渣用
０１ｍＬ流动相溶解，混匀后进样分析。
２．５ 分析方法的确证
２．５．１ 分析方法专属性 在上述色谱条件下，梓醇
的保留时间约为１０３ｍｉｎ，理论塔板数大于８０００。
在上述色谱条件下，空白脑脊液的内源性物质对梓
醇的测定无干扰（图１）。
Ａ．空白脑脊液；Ｂ．空白脑脊液中加入梓醇；
Ｃ．给药组大鼠脑脊液样品；１．梓醇。
图１ 大鼠脑脊液中梓醇ＨＰＬＣ图
２．５．２ 标准曲线 分别于离心管中加入空白脑脊
液０１ｍＬ，以倍比稀释的梓醇对照溶液，配成终浓
度为０５，１０，３０，５０，１０，２０，４０ｍｇ·Ｌ－１的含梓醇
脑脊液样品，按２．４项下方法进样处理分析。以梓
醇峰面积Ｙ对梓醇质量浓度Ｘ（ｍｇ·Ｌ－１）进行线性
回归，回归方程Ｙ＝５２１４１Ｘ＋１４９９４，ｒ＝０９９９７。
梓醇在０５～４０ｍｇ·Ｌ－１线性关系良好。
２．５．３ 精密度与检测限 分别取空白脑脊液０１
ｍＬ，加入梓醇对照溶液，配制成含梓醇１０，５０，２０
ｍｇ·Ｌ－１的脑脊液样品（ｎ＝５），按２．４项下方法操
作，于日内和５ｄ内各测定３批样品，计算日内和日
间精密度。低、中、高浓度日内精密度分别为
１７％，３０％，２３％；日间精密度分别为 １９％，
３５％，２８％。
最低检测限，当 Ｓ／Ｎ≥３，经测定最低检测限为
０３ｍｇ·Ｌ－１。
２．５．４ 绝对回收率 分别取空白脑脊液及超纯水
０１ｍＬ，加入梓醇对照溶液，配制成含梓醇 １０，
５０，２０ｍｇ·Ｌ－１的脑脊液样品及超纯水样品，各５
份，按 ２．４项下方法操作，进行绝对回收率试验。
低、中、高浓度的绝对回收率分别为 （９０２±
１７１）％，（８９１±１１７）％，（８６９±０９８）％。
２．５．５ 方法回收率 分别量取质量浓度为 １０，
５０，２０ｍｇ·Ｌ－１的梓醇脑脊液样品各５份，按２．４
项下方法操作。以测得量与加入量之比计算方法回
收率，低、中、高浓度的方法回收率分别为（９９８±
１９８）％，（１０１１±３０４）％，（１００１±２３０）％。
２．５．６ 冻存稳定性实验 分别量取质量浓度为
１０，５０，２０ｍｇ·Ｌ－１的梓醇脑脊液样品各５份，置
－２０℃冰箱冷冻保存，１５ｄ后按 ２．４项下方法操
作，记录梓醇峰面积，计算梓醇的浓度。低、中、高剂
量分别为（１０±０１８），（４９±０１１），（２００±
０１３）ｍｇ·Ｌ－１。
２．６ 结果
将对照组和给药组的脑脊液（ｎ＝５）按２．４项
下方法处理后，各进样２０μＬ，在上述色谱条件下测
定。结果表明，在正常生理状态及本给药剂量下，能
够在脑脊液中检测出梓醇，检出质量浓度为（５１±
１０３）ｍｇ·Ｌ－１（图１）。
３ 讨论
３．１ 样品的处理方法
梓醇在酸碱条件下稳定性差，且具有水溶性大
而脂溶性小的特点。兼顾蛋白质沉淀效率和药物回
收率，选用甲醇、乙腈混合物作为蛋白质沉淀剂。并
考察了甲醇和乙腈的不同配比和量对沉淀的影响，
最终选定甲醇乙腈（１∶１０）作为沉淀剂，脑脊液与沉
淀剂的体积比为１∶７作为处理条件。
３．２ 色谱条件的选择
流动相曾参考《中国药典》中测定梓醇含量的
方法，即０１％磷酸溶液乙腈（９９∶１）［６］，但梓醇吸
收峰与脑脊液内源性杂质峰分离度不够。后选用
水乙腈（９９５∶０５）［７８］，将梓醇的吸收峰保留时间
后移至１０３ｍｉｎ左右，能够很好的分离样品和杂
质，且峰型较好。
３．３ 结果分析
ＢＢＢ的存在，阻止了外来有害物质的入侵，维
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持脑内环境的稳定，但同时也限制了治疗药物的进
入，不利于疾病的治疗。相对分子质量小于６００的
亲脂性小分子容易以简单扩散的方式透过 ＢＢＢ［９］。
本研究结果表明，尽管梓醇是水溶性物质，但在大鼠
正常生理状态及本给药剂量下，脑脊液中能检测出
梓醇，说明梓醇能通过某种机制透过 ＢＢＢ。推测在
ｐＨ７４的血液中，梓醇大部分以非解离型分子存
在，能够通过被动转运方式向脑脊液转运；或者是梓
醇能透过 ＢＢＢ与脑摄取葡萄糖、氨基酸一样，有某
种转运蛋白的辅助，以载体转运的方式透过 ＢＢＢ。
具体机制有待进一步研究。由于脑损伤后（如脑卒
中、炎症等）ＢＢＢ的通透性增加，影响药物的透过
率［１０］，梓醇透过 ＢＢＢ的量有所增加。本研究为梓
醇应用于临床治疗缺血性脑中风等疾病提供了一种
可行的检测方法，也为梓醇用药的安全性和有效性
提供了技术支持。
［参考文献］
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ＨＰＬＣｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｃａｔａｌｐｏｌｉｎｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌｆｌｕｉｄｏｆｒａｔｓ
ＨＥＹａｏ１，ＺＨＵＨｕｉｆｅｎｇ２，ＬＩＷａｎｙｕ１，ＣＨＥＮＧａｎｇ３，ＬＩＺｈｕｏｈｅｎｇ１，ＸＵＸｉａｏｙｕ１，２
（１．ＣｏｌｅｇｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，ＣｈｏｎｇｑｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ４０００１６，Ｃｈｉｎａ；
２．ＣｏｌｅｇｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，ＳｏｕｔｈｗｅｓｔＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ４００７１５，Ｃｈｉｎａ；
３．ＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒｏｆＭｅｄｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＣｈｅｍｉｃａｌＢｉｏｌｏｇｙ，ＣｈｏｎｇｑｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄＢｕｓｉｎｅｓＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，
Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ４０００６７，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｎＨＰＬＣｍｅｔｈｏｄｆｏｒｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｃａｔａｌｐｏｌｉｎＣＳＦ（ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌｆｌｕｉｄ）ｏｆｒａｔｓ．
Ｍｅｔｈｏｄ：Ｒａｔｓｗｅｒｅｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓｌｙｉｎｊｅｃｔｅｄ１０ｇ·Ｌ－１ｃａｔａｌｐｏｌｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｓａｌｉｎｅ，ａｎｄｔｈｅｓａｍｐｌｅｏｆＣＳＦｆｒｏｍｓｕｂａｒａｃｈｎｏｉｄｓｐａｃｅｏｆ
ｔｈｅｃｅｒｅｂｒｕｍ４０ｍｉｎｕｔｅｓｏｆｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．ＴｈｅｓａｍｐｌｅｏｆＣＳＦｆｒｏｍｎｏｒｍａｌｒａｔｓｗａｓｕｓｅｄｆｏｒｂｌａｎｋｃｏｎｔｒｏｌ，ｔｈｅａｌｓａｍｐｌｅｓｗｅｒｅｐｒｅｓｅｒｖｅｄ
ｉｎａｒｅｆｒｉｇｅｒａｔｏｒｏｆ－２０℃，ａｎｄｕｓｅＨＰＬＣｗａｓｅｍｐｌｏｙｅｄｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｃａｔａｌｐｏｌｃｏｎｔｅｎｔ．Ｔｈｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｃａｔａｌｐｏｌｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄ
ｏｎＨｙｐｅｒｓｉｌＣ１８ｒｅｖｅｒｓｉｏｎｐｈａｓｅｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃｃｏｌｕｍｎ．Ｔｈｅｍｏｂｉｌｅｐｈａｓｅｃｏｎｓｉｓｔｅｄｏｆｗａｔｅｒａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ（９９５∶０５）ｗｉｔｈａｆｌｏｗｒａｔｅ
ｏｆ１０ｍＬ·ｍｉｎ－１ａｎｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｗａｖｅｌｅｎｇｔｈｏｆ２１０ｎｍ．Ｒｅｓｕｌｔ：ＴｈｅｌｉｎｅａｒｒａｎｇｅｏｆｃａｔａｌｐｏｌｉｎＣＳＦｗａｓ０５４０ｍｇ·Ｌ－１（ｒ＝０９９９
７）．Ｔｈｅａｂｓｏｌｕｔｅｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓｗｅｒｅ（９０２±１７１）％，（８９１±１１７）％ ａｎｄ（８６９±０９８）％；ａｎｄｔｈｅｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｃａｌｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓｗｅｒｅ
（９９８±１９８）％，（１０１１±３０４）％，（１００１±２３０）％ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＴｈｅｗｉｔｈｉｎｄａｙａｎｄｂｅｔｗｅｅｎｄａｙｄｅｒｉｖａｔｉｏｎＲＳＤｗｅｒｅｌｅｓｓ
ｔｈａｎ４％．Ｃａｔａｌｐｏｌｗａｓｓｔａｂｌｅｉｎａｒｅｆｒｉｇｅｒａｔｏｒｏｆ－２０℃ ｆｏｒ１５ｄａｙｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅｍｅｔｈｏｄｉｓｓｉｍｐｌｅａｎｄａｃｃｕｒａｔｅｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉ
ｎａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｃａｔａｌｐｏｌｉｎＣＳＦ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ ｃａｔａｌｐｏｌ；ｒａｔｓ；ＣＳＦ；ＨＰＬＣ
［责任编辑 古云侠］
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