全 文 ：ＩＴＳ序列鉴定西红花与其易混中药材
车 建，唐 琳，刘彦君，何 玮，陈 放
（四川大学 生命科学学院，四川 成都 ６１００６４）
［摘要］ 目的：通过研究比较西红花与其易混中药材 ＩＴＳ序列的差异和规律，建立西红花与其易混药材之间
的分子鉴别方法。方法：从正品西红花以及番紫花２个园艺品种中提取总ＤＮＡ，用ＩＴＳ序列通用引物扩增，扩增产
物克隆测序；从ＧｅｎＢａｎｋ中获得莲须、菊花、玉米、红花的ＩＴＳ序列。结果：测得西红花以及番紫花２个园艺品种的
ＩＴＳ全长序列，总长度分别为 ６５８，６３４，６３３ｂｐ，包括 ＩＴＳ１，５８Ｓ和 ＩＴＳ２区，ＧｅｎＢａｎｋ注册登记号为 ＤＱ０９４１８５，
ＤＱ２２４３６３，ＤＱ２２４３６４。西红花和番紫花２个园艺品种的 ＩＴＳ序列相似性均高于９１％；番紫花２个园艺品种之间
ＩＴＳ序列的相似性高达９９８４％；比较ＩＴＳ１区序列，正品西红花与其易混中药材的差异性均在４６％以上；比较ＩＴＳ２
区序列，正品西红花与其易混中药材的差异性均在４１％以上。结论：根据ＩＴＳ序列特征，能有效区分西红花和其他
易混中药材。ＩＴＳ序列是正品西红花鉴定的有效的分子标记。
［关键词］ 西红花；ＩＴＳ序列；中药鉴定
［中图分类号］Ｓ５６７ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００１５３０２（２００７）０８０６６８０４
［收稿日期］ ２００５１１１４
［基金项目］ 四川省应用基础研究计划资助项目（０３
ＴＹ０２９０９０２）
［通讯作者］ 唐琳，Ｔｅｌ／Ｆａｘ：（０２８）８５４１７２８１，Ｅｍａｉｌ：ｔａｎｇｌｉｎ
＠ｓｃｕｅｄｕｃｎ
西红花 ＣｒｏｃｕｓｓａｔｉｖｕｓＬ系鸢尾科番红花属植
物，具有很强的活血化瘀和散郁开结的功效［１］。其
疗效可靠，货源稀少，价格高昂。市场上常见伪品及
掺伪品有：菊科植物菊花 Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍｃｈａｎｅｔｉ；
莲须———睡莲科植物莲 ＮｅｌｕｍｂｏｎｕｃｉｆｅｒａＧａｅｒｔｎ的
干燥雄蕊经染色而成；禾本科植物玉米ＺｅａｍａｙｓＬ
的须染色；菊科植物红花 ＧａｒｔｈａｍｕｓｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓＬ染
色制作的伪品等。
番紫花Ｃｒｏｃｕｓｖｅｒｎｕｓ，鸢尾科番红花属植物，别
名春番红花。作为和西红花同属的近缘园艺品种，
番紫花的植株形态和西红花相近，根据形态、组织特
征和理化性质等常规方法难以区分。
ＩＴＳ序列存在于高度重复的核糖体 ＤＮＡ中，是
高度重复的串联序列单位，具位点内或位点间的协
同进化。被子植物 ＩＴＳ区长度较稳定，总长度为
６００～７００ｂｐ，易于测序。因此，ＩＴＳ适用于科以下，
特别是属、种的亲缘关系与分类鉴别研究［２４］。本实
验旨在通过对西红花的 ＩＴＳ序列进行测序，将其与
各种易混中药材的 ＩＴＳ序列进行比较分析，为西红
花的正品鉴定提供分子依据。
１ 材料和方法
１１ 材料 正品西红花Ｃｓａｔｉｖｕｓ采自四川大学生
命科学学院种植基地；番紫花 ２个园艺品种
（Ｃｖｅｒｎｕｓｗｈｉｔｅ和Ｃｖｅｒｎｕｓｐｕｒｐｌｅ），从荷兰引种，其
中Ｃｖｅｒｎｕｓｗｈｉｔｅ开白色花，Ｃｖｅｒｎｕｓｐｕｒｐｌｅ开紫色
花。材料均由四川大学唐琳副教授提供并鉴定。
１２ 总 ＤＮＡ提取 用 ＣＴＡＢ法提取总 ＤＮＡ［５７］。
西红花以及番紫花园艺品种在实验的过程当中，采
取单个个体和同种４～７个个体混合后取样相结合
的策略来提取总ＤＮＡ，以期能有效的检查出种内的
个体差异，消除实验误差产生的不利影响，从而保证
实验数据的稳定性和可靠性。
１３ ＩＴＳ的扩增、纯化、测序 扩增ＩＴＳ序列引物依
据文献［８］设计，引物序列为：引物 ＩＴＳ１５′ＡＧＡ
ＡＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＧＧＴＴＴＣＣＧＴＡＧＧ３′，引物ＩＴＳ４
５′ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ３′。扩增程序
为：９４℃预变性８ｍｉｎ，９４℃ １ｍｉｎ，５７℃ ２ｍｉｎ，７２
℃ ３ｍｉｎ，循环３６次，最后７２℃ １０ｍｉｎ。反应体系
为：５０μＬ反应体积含各５μＬ（２μｍｏｌ·Ｌ－１）的引
物ＩＴＳ１和ＩＴＳ４，０２μＬＴａｑ酶（５Ｕ·μＬ－１），５μＬ
１０×ｂｕｆｅｒ（２５ｍｍｏｌ·Ｌ－１ＭｇＣｌ２），５μＬ的 ｄＮＴＰ
（２５ｍｍｏｌ·Ｌ－１）及１０～２５ｎｇ模板，加水至５０μＬ。
ＰＣＲ产物经纯化克隆后测序。
测序采用ＩＴＳ序列测定的通用引物测序，上游
·８６６·
第３２卷第８期
２００７年４月
中 国 中 药 杂 志
ＣｈｉｎａＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ
Ｖｏｌ．３２，Ｉｓｓｕｅ ８
Ａｐｒｉｌ，２００７
引物为 ａ：５′ＧＧＡＡＧＴＡＡＡＡＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＧＧ３′，下
游引物为 ｄ：５′ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ３′。为
了保证序列测定的精度，除了用ａ和 ｄ以外，尚用 ｂ
和ｃ分别进行逆向测序（序列ｂ：５′ＧＣＴＡＣＧＴＴＣＴＴＣ
ＡＴＣＧＡＴＧＣ３′；序列ｃ：５′ＧＣＡＴＣＧＡＴＧＡＡＧＡＡＣＧＴ
ＡＧＣ３′）。
１４ 西红花及其易混中药材ＩＴＳ序列分析［７，９］ 本
研究测得正品西红花以及番紫花２个园艺品种（Ｃ
ｖｅｒｎｕｓｗｈｉｔｅ和Ｃｖｅｒｎｕｓｐｕｒｐｌｅ）的ＩＴＳ全序列，包含
ＩＴＳ１，５８Ｓ区和 ＩＴＳ２，１８Ｓ片段和 ２６Ｓ片段已被删
除。所测得的序列用软件ＣｌｕｓｔａｌＸ（１８１）进行同源
排序，必要时用手工排序；用 Ｍａｇｅ３０对序列特征
进行分析统计。其所有序列的注册登记号及序列特
征分析见表１。
表１ 各物种ＩＴＳ序列特征及ＧｅｎＢａｎｋ登录号
物种名
ＩＴＳ ＩＴＳ１ ５８Ｓ ＩＴＳ２
长度 Ｇ＋Ｃ 长度 Ｇ＋Ｃ 长度 Ｇ＋Ｃ 长度 Ｇ＋Ｃ
注册登记号
番紫花Ｃｖｅｒｎｕｓｗ ６３４ ５９４ ２３６ ６０２ １６４ ５６７ ２３４ ６０７ ＤＱ２２４３６４
番紫花Ｃｖｅｒｎｕｓｐ ６３３ ５９４ ２３５ ５９６ １６４ ５６７ ２３４ ６０７ ＤＱ２２４３６３
西红花Ｃｓａｔｉｖｕｓ ６５８ ６０１ ２６０ ５８９ １６４ ５６７ ２３４ ６４１ ＤＱ０９４１８５
菊花Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍｃｈａｎｅｔｉ ６４１ ５２１ ２５５ ５０６ １６４ ５４２ ２２２ ５２３ ＡＦ３１４５９６
莲Ｎｅｌｕｍｂｏｎｕｃｉｆｅｒａ ６３７ ５２１ ２５４ ５５７ １６４ ５３６ ２１９ ４６６ ＡＦ１３６２９０
玉米Ｚｅａｍａｙｓ ５９７ ６７７ ２１３ ７０４ １６４ ５６７ ２２０ ７３２ ＡＦ０１９８１７
红花Ｇａｒｔｈａｍｕｓｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ ２５４ ５４０ ＡＦ１４０４５８
红花Ｇｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ ２１４ ５４０ ＡＦ１４０４５９
注：Ｇ＋Ｃ为序列的ＧＣ含量
２ 结果
２１ ＩＴＳ序列全长比较 比较 ＩＴＳ全长序列，发现
西红花和番紫花２个园艺品种的相似性较高，西红
花和Ｃｖｅｒｎｕｓｗ总共排序成对的６３２对碱基中有
５８２对碱基相同，西红花和Ｃｖｅｒｎｕｓｐ共６３１对碱基
中有５８０对碱基相同，相似性均高于９０％；２个园艺
品种之间的相似性更是高达９９８４％，仅 Ｃｖｅｒｎｕｓｐ
在ＩＴＳ１区有１个碱基的缺失和１个颠换替代（Ｃ→
Ａ）。西红花与其易混药材 ＩＴＳ序列差异较大，故将
ＩＴＳ１区和ＩＴＳ２区分别比较。
２２ ５８Ｓ区比较 西红花、Ｃｖｅｒｎｕｓｗ和
Ｃｖｅｒｎｕｓｐ的５８Ｓ区序列完全一致；西红花与其易
混药材菊、莲、玉米的５８Ｓ区长度均为１６４ｂｐ，相似
性分别为９２０７％，９１４１％，９１４６％。见表２。
表２ 西红花、菊花、莲和玉米５８Ｓ区的碱基对频率
物种 相同碱基 转换替代 颠换替代 总碱基对
菊花 １５１ ９ ４ １６４
莲 １４９ ７ ７ １６３
玉米 １５０ １０ ４ １６４
２３ 西红花与其易混药材的 ＩＴＳ１区、ＩＴＳ２区的比
较 西红花与菊、莲、玉米和红花的 ＩＴＳ１区差异较
大，相似性较低。其中，和玉米的相似性最大，在总
共排序成对的２０８对碱基中有１１１对相同碱基，相
似性为５３３７％；和莲的相似性最小，在总共排序成
对的２４３对碱基中仅有９５对相同碱基，相似性仅为
３９０９％。见表３。
表３ 西红花、菊花、莲、玉米和红花ＩＴＳ１区的碱基对频率
物种 相同碱基 转换替代 颠换替代 总碱基对
菊花 １１５ ４７ ７５ ２３７
莲 ９５ ７５ ７３ ２４３
玉米 １１１ ４１ ５６ ２０８
红花 １１４ ５２ ８１ ２４７
比较西红花与其易混药材的ＩＴＳ２区序列，发现
西红花和玉米的相似性最高，在总共排序成对的
２０３对碱基中有 １１８对相同碱基，相似性也仅为
５８１３％。见表４。
表４ 西红花、菊花、莲、玉米和红花ＩＴＳ２区的碱基对频率
物种 相同碱基 转换替代 颠换替代 总碱基对
菊花 １０７ ４９ ４３ １９９
莲 １０２ ４４ ４８ １９４
玉米 １１８ ３５ ５０ ２０３
红花 ９４ ５０ ６９ ２１３
２４ 西红花的鉴定 从各物种ＩＴＳ序列的排列中，
可以很清楚地看到有许多碱基的缺失和替代，尤其
在ＩＴＳ１区和 ＩＴＳ２区，西红花与其易混药材菊、莲、
玉米和红花均存在相当多的转换替代和颠换替代，
比如西红花在２０９ｂｐ处就有一段长达１６个碱基的
特有片段等，这为西红花的鉴定提供了有效和丰富
的信息位点。
通过测序后相似性的比较和序列的比对分析，
能够区分开西红花与其园艺品种，更能准确鉴定西
·９６６·
第３２卷第８期
２００７年４月
中 国 中 药 杂 志
ＣｈｉｎａＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ
Ｖｏｌ．３２，Ｉｓｓｕｅ ８
Ａｐｒｉｌ，２００７
红花与其易混中药材，研究结果表明 ＩＴＳ序列是鉴
定正品西红花的有效的分子标记。
３ 讨论
３１ 用ＩＴＳ序列鉴定西红花 ＩＴＳ序列等分子标记
是直接根据生物ＤＮＡ的多态特征，通过序列对比分
析得到相当稳定的信息位点，结果更为客观和准确。
测序鉴别的成功与否与引物的选择密切相关，
所选用的引物必须灵敏，才能检测出亲缘关系较近
的物种。从报道和相关文献来看，ＩＴＳ序列，种内的
差异小于１％［８］，种间差异值为１２％ ～１０２％，属
间差异值为９６％ ～２８８％［１０］。从测序结果看：番
紫花２个园艺品种之间的 ＩＴＳ序列高度相似，相似
性为９９８４％。番紫花２个园艺品种与同属的西红
花相比有较大的差异，其序列差异分别为７９１％和
８０８％。西红花与其易混中药材的ＩＴＳ序列之间则
有相当丰富的碱基缺失和变异位点。西红花与其易
混中药材在分类学上属于不同的科，其中和玉米的
ＩＴＳ２区相似性最大，也仅为５８１３％。可见，ＩＴＳ序
列既能够区别西红花和其他易混中药材，在种内又
是保守的，同时能够很灵敏检测出亲缘关系较近的
物种。本实验在实现了ＩＴＳ序列鉴别正品西红花的
同时，也再次验证了 ＩＴＳ序列非常适用于种以上遗
传进化分析。结果表明所选择的引物是合适的。
３２ 西红花ｒＤＮＡＩＴＳ区序列特征 由于ＧｅｎＢａｎｋ
中没有西红花以及同属植物的ｒＤＮＡＩＴＳ序列登录，
因此西红花以及２个园艺品种ＩＴＳ序列的起始端和
终点参考了 ＧｅｎＢａｎｋ中和西红花同属于鸢尾科植
物的 ＩＴＳ序 列，其 ＧｅｎＢａｎｋ 注 册 登 记 号 有
ＡＦ１３０８３０，ＡＦ４８８７５１，ＡＦ４８８７５２等。并用类似方
法［１１］对玉米的 ＩＴＳ序列进行了重新分区。得到西
红花ＩＴＳ序列全长６５８ｂｐ，ＣｖｅｒｎｕｓｗＩＴＳ序列全长
６３４ｂｐ，ＣｖｅｒｎｕｓｐＩＴＳ序列全长６３３ｂｐ，均包含完整
的ＩＴＳ１，ＩＴＳ２和５８Ｓ区，其中５８Ｓ区均为１６４ｂｐ，
ＧＣ的含量为５６７％。
３３ 西红花ｒＤＮＡＩＴＳ区序列特有指纹的应用 西
红花ＩＴＳ序列有非常丰富的碱基缺失和变异位点，
可以为真伪鉴定提供大量的信息位点。在具体应用
当中，可以通过寻找以特异位点为靶序列的限制性
内切酶，进行酶切，或者通过设计针对特异位点的专
门引物，作特异性ＰＣＲ扩增等办法简化鉴定程序。
［参考文献］
［１］ 中国科学院中国植物志编辑委员会中国植物志［Ｍ］第１６
卷北京：科学出版社，１９９９：１２２
［２］ 李隆云，钟国跃，卫莹芳，等ＤＮＡ分子标记及其在中药中
的应用［Ｊ］中国中医药科技，２００２，９（５）：３１５
［３］ 王建波，张文驹，陈家宽核 ｒＤＮＡ的 ＩＴＳ序列在被子植物
进化研究中的应用［Ｊ］植物分类学报，１９９９，３７（４）：４０７
［４］ ＢａｌｄｗｉｎＢＧ，ＳａｎｄｅｒｓｏｎＭＪ，ＰｏｒｔｅｒＪＭ，ｅｔａｌＴｈｅＩＴＳｒｅｇｉｏｎ
ｏｆｎｕｃｌｅａｒｒｉｂｏｓｏｍａｌＤＮＡ：Ａｖａｌｕａｂｌｅｓｏｕｒｃｅｏｆｅｖｉｄｅｎｃｅｏｎａｎｇｉ
ｏｓｐｅｒｍｐｈｙｌｏｇｅｎｙ［Ｊ］ＡｎｎＭｉｓｓｏｕｒｉＢｏｔＧａｒｄ，１９９５，８２（２）：
２４７
［５］ ＷＥＮＪ，ＺＩＭＭＥＲＥＡＰｈｙｌｏｇｅｎｙａｎｄｂｉｏｇｅｏｇｒａｐｈｙｏｆＰａｎａｘＬ
（ｔｈｅｇｉｎｓｅｎｇｇｅｎｕｓ，Ａｒａｌｉａｃｅａｅ）：ＩｎｆｅｒｅｎｃｅｓｆｒｏｍＩＴＳｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
ｏｆｎｕｃｌｅａｒｒｉｂｏｓｏｍａｌＤＮＡ［Ｊ］ＭｏｌＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔＥｖｏｌ，１９９６，６：
１６６
［６］ 郭宝林，李家实，阎玉凝中药材 ＤＮＡ分子标记研究的技
术问题Ⅰ［１］植物药基因组 ＤＮＡ的提取［Ｊ］中草药，
２０００，３１（１２）：９５１
［７］ 邹喻苹，葛 颂，王晓东系统与进化植物学中的分子标记
［Ｍ］北京：科学出版社，２００１：１６
［８］ 曾 明，马雅军，郑水庆，等中药葛根及其近缘种的 ｒＤ
ＮＡＩＴＳ序列分析［Ｊ］中国药学杂志，２００３，３８（３）：１７３
［９］ ＣｅｒｂａｈＭ，ＳｏｕｚａＣｈｉｅｓＴ，ＪｕｂｕｅｒＭＦ，ｅｔａｌＭｏｌｅｃｕｌａｒｐｈｙｌｏｇ
ｅｎｙｏｆｔｈｅｇｅｎｕｓｈｙｐｏｃｈａｅｒｉｓｕｓｉｎｇｉｎｔｅｒｎａｌｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄｓｐａｃｅｒｓｏｆ
ｎｕｃｌｅａｒｒＤＮＡ：ｉｎｆｅｒｅｎｃｅｆｏｒｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌｅｖｏｌｕｔｉｏｎ［Ｊ］ＭｏｌＢｉｏｌ
Ｅｖｏｌ，１９９８，１５：３４５
［１０］ 屈良鹄，陈月琴生物分子分类检索表———原理与方法［Ｊ］．
中山大学学报（自然科学版），１９９９，３８（１）：１
［１１］ 沈 洁，丁小余，张卫明，等花椒及其混淆品的 ｒＤＮＡＩＴＳ
区序列分析与鉴别［Ｊ］药学学报，２００５，４０（１）：８０
ＭｏｌｅｃｕｌａｒｉｄｅｎｔｉｔｙｏｆＣｒｏｃｕｓｓａｔｉｖｕｓａｎｄｉｔｓｍｉｓｕｓｅｄｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓｂｙＩＴＳｓｅｑｕｅｎｃｅ
ＣＨＥＪｉａｎ，ＴＡＮＧＬｉｎ，ＬＩＵＹａｎｊｕｎ，ＨＥＷｅｉ，ＣＨＥＮＦａｎｇ
（ＣｏｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＳｉｃｈｕａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｅｎｇｄｕ６１００６４，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｆｉｎｄｔｈｅｐａｔｅｒｎｓｏｆｔｈｅｒＤＮＡＩＴＳｓｅｑｕｅｎｃｅｖａｒｉａｔｉｏｎｏｆＣｒｏｃｕｓｓａｔｉｖｕｓ，Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍｃｈａｎｅｔｉ，Ｎｅ
ｌｕｍｂｏｎｕｃｉｆｅｒａ，ＺｅａｍａｙｓａｎｄＧａｒｔｈａｍｕｓｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓａｎｄｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＣｓａｔｉｖｕｓ
·０７６·
第３２卷第８期
２００７年４月
中 国 中 药 杂 志
ＣｈｉｎａＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ
Ｖｏｌ．３２，Ｉｓｓｕｅ ８
Ａｐｒｉｌ，２００７
ａｎｄｔｈｅｏｔｈｅｒｓＭｅｔｈｏｄ：ＡｆｔｅｒｔｈｅｔｏｔａｌＤＮＡｏｆＣｒｏｃｕｓｓａｔｉｖｕｓ，ＣｖｅｒｎｕｓｗａｎｄＣｖｅｒｎｕｓｐｗｅｒｅｅｘｔｒａｃｔｅｄ，ｔｈｅＩＴＳｓｅｑｕｅｎｃｅｗａｓａｍ
ｐｌｉｆｉｅｄｂｙＰＣＲｗｉｔｈｕｎｉｖｅｒｓａｌｐｒｉｍｅｒｏｆＩＴＳａｎｄＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｗａｓｓｅｑｕｅｎｃｅｄａｆｔｅｒｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｃｌｏｎｉｎｇＴｈｅＩＴＳｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＣｈｒｙｓ
ａｎｔｈｅｍｕｍｃｈａｎｅｔｉ，Ｎｅｌｕｍｂｏｎｕｃｉｆｅｒａ，ＺｅａｍａｙｓａｎｄＧａｒｔｈａｍｕｓｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｆｒｏｍＧｅｎＢａｎｋＲｅｓｕｌｔ：ＴｈｅｃｏｍｐｌｅｔｅＩＴＳｓｅ
ｑｕｅｎｃｅｏｆＣｒｏｃｕｓｓａｔｉｖｕｓ，ＣｖｅｒｎｕｓｗａｎｄＣｖｅｒｎｕｓｐ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇＩＴＳ１ｒＤＮＡ，５８ＳｒＤＮＡ，ＩＴＳ２ｒＤＮＡｗｅｒｅｍｅａｓｕｒｅｄＴｈｅＧｅｎＢａｎｋ
ａｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏｗａｓＤＱ０９４１８５，ＤＱ２２４３６３ａｎｄＤＱ２２４３６４ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙＴｈｅｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｏｆＩＴＳｓｅｑｕｅｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎＣｓａｔｉｖｕｓａｎｄｔｈｅｔｗｏ
ｇａｒｄｅｎｓｐｅｃｉｅｓｏｆＣｖｅｒｎｕｓｗａｓａｂｏｖｅ９１％；ｔｈｅｉｄｅｎｔｉｔｙｗａｓ９９８４％ ｂｅｔｗｅｅｎＣｖｅｒｎｕｓｗａｎｄＣｖｅｒｎｕｓｐＴｈｅｒａｎｇｅｏｆｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｂｅｔｗｅｅｎＣｓａｔｉｖｕｓａｎｄｏｔｈｅｒｈｅｒｂｓｗａｓａｂｏｖｅ４６％ ｂａｓｅｄｏｎＩＴＳ１ａｎｄａｂｏｖｅ４１％ ｂａｓｅｄｏｎＩＴＳ２Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｃｓａｔｉｖｕｓｃａｎｂｅｄｉｓｔｉｎ
ｇｕｉｓｈｅｄｆｒｏｍｍｉｓｕｓｅｄｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓｂｙｔｈｅＩＴＳｓｅｑｕｅｎｃｅＴｈｅＩＴＳｓｅｑｕｅｎｃｅｉｓａｎａｖａｉｌａｂｌｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒｆｏｒｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＣ
ｓａｔｉｖｕｓ
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ Ｃｒｏｃｕｓｓａｔｉｖｕｓ；ＩＴＳｓｅｑｕｅｎｃｅ；Ｃｈｉｎｅｓｅｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｍｅｄｉｃｉｎｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
［责任编辑 张宁宁］
不同来源莲 ｒＤＮＡＩＴＳ的 ＰＣＲ扩增、克隆及序列分析
林 珊１，２，郑伟文２，吴锦忠１，周莉娟２，宋亚娜２
（１福建中医学院 药学系，福建 福州 ３５０００３；
２福建省农业科学院 生物技术研究所，福建 福州 ３５０００３）
［摘要］ 目的：通过分析不同来源莲的ＩＴＳ序列，为莲的鉴别提供 ＤＮＡ分子标记。方法：利用特异性引物进
行ＰＣＲ扩增和克隆、测序技术对莲的ｒＤＮＡＩＴＳ区间碱基序列进行测定，比较其差异。结果：得到参试的１１个莲栽
培品种的ｒＤＮＡ的ＩＴＳ及５８ＳｒＤＮＡ全序列，１８Ｓ和２６ＳｒＤＮＡ部分序列，共约７５０ｂｐ。显示了不同产地、不同栽培
品种莲的ｒＤＮＡＩＴＳ的差异。结论：本研究为利用ＩＴＳ区序列差异，鉴别不同来源的莲提供了依据，此法可用于莲种
间及真伪品鉴别。
［关键词］ 分子鉴定；莲；ＩＴＳ序列；序列分析
［中图分类号］Ｓ５６７ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００１５３０２（２００７）０８０６７１０５
［收稿日期］ ２００６０４０７
［基金项目］ 福建省科技重大项目（２００２Ｙ００６）；福建省科技项
目（２００４Ｙ００７，２００１Ｚ０２６）
［通讯作者］ 郑伟文，Ｅｍａｉｌ：ｂｃｆａａｓ０１＠ｈｏｔｍａｉｌｃｏｍ
莲ＮｅｌｕｍｂｏｎｕｃｉｆｅｒａＧａｅｒｔｎ为睡莲科多年生大
型水生草本植物，经过长期的人工繁育，莲已形成了
籽莲、花莲和藕莲三大品系，种质资源相当丰富。莲
的分布较广，且栽培历史悠久，形成较多的栽培品
种。道地品种有湖南的湘莲、江西的赣莲、福建的建
莲和浙江的宣莲。随着种质资源的开发利用，不同
栽培品种莲的道地产区除栽培本地的传统品种外，
还有新培育品种如杂交莲和太空莲等。众多栽培品
种的混合种植，势必会影响莲的道地性和质量稳定
性。另外，莲的栽培品种中大多数的表型性状易受
环境影响，因此，以形态特征为基础的种质资源鉴定
的准确性已受到质疑。
近年来，分子标记技术和ＤＮＡ指纹分析技术的
迅猛发展及其在农作物种质鉴定上的广泛应用，为
揭示药用植物的遗传差异和鉴定中药材品种的道地
性提供了新的方法和手段，其中核糖体 ＤＮＡ（即
ｎｒＤＮＡ）ＩＴＳ区（包括 ＩＴＳ１，５８Ｓ和 ＩＴＳ２）序列已
被广泛的用于植物属内、近缘属间等的系统发育分
析［１５］。许多学者应用分子生物学方法对莲进行研
究，如 ＲＡＰＤ，ＡＦＬＰ，ＩＳＳＲ，ＦＩＳＨ等技术［６９］。在 ＩＴＳ
序列方面，有刘艳玲等对睡莲类植物 ＩＴＳ序列分子
系统发育的研究［１０１２］，但并未对序列差异进行分
析。本研究对不同来源的１１个莲品种，采用 ＰＣＲ
扩增以及测序技术进行了 ｒＤＮＡＩＴＳ区序列的测定
与分析，从分子水平比较了不同地区莲的差异，为莲
的种质资源道地性的鉴定、质量控制以及莲的 ＧＡＰ
·１７６·
第３２卷第８期
２００７年４月
中 国 中 药 杂 志
ＣｈｉｎａＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ
Ｖｏｌ．３２，Ｉｓｓｕｅ ８
Ａｐｒｉｌ，２００７