全 文 :大孔树脂吸附骨碎补总黄酮特性的研究
陈 顺,关延彬
(华中科技大学 同济医学院 药学院,湖北 武汉 430030)
[收稿日期] 20051210
[通讯作者] 关延彬,Tel:(027)83692221,Email:guanyan
bin96@163.com
骨碎补为水龙骨科多年生附生蕨类植物槲蕨
Drynariafortunei(Kunze)J.Sm的根茎。传统中医
认为骨碎补性味苦温归肾肝经,具有补肾强骨、续伤
止痛功效,用于肾虚腰痛、耳鸣耳聋、牙齿松动,跌扑
闪挫,筋骨折伤;有报道称骨碎补总黄酮有刺激骨生
长[1]、预防骨质疏松[2]和抗炎作用[3]。
大孔树脂对于黄酮类化合物是较理想的吸附
剂,但应用于骨碎补总黄酮的研究还不多见。作者
比较了7种不同型号的大孔树脂对骨碎补总黄酮吸
附性质,对其中效果较好的AB-8型树脂进行了吸
附动力学及热力学特性研究,其结果可为研究骨碎
补的提取纯化方法提供参考。
1 仪器与材料
UV754分光光度计(上海第三分析仪器厂),
DF-101S智能恒温水浴锅(巩义市英裕华中仪器
厂),旋转蒸发器 RE52-99(上海亚荣生化仪器
厂),骨碎补(市售,经本院张长弓教授鉴定),柚皮
苷对照品(中国药品生物制品检定所,批号 0722
200108),大孔树脂D101(天津农药厂),CAD40(安
徽三星树脂厂),D4006,AB-8,S-8,NKA2,NKA9
(南开大学化工厂)。
2 方法与结果
2.1 方法学考察
2.1.1 标准曲线制备 精密称取柚皮苷5mg置
50mL量瓶,纯化水定容摇匀,分别精密吸取1,2,3,
4,5,6mL分别置25mL量瓶,纯化水定容摇匀,在
283nm测定吸光度,以吸光度对质量浓度求回归方
程为A=0005+00274C,r=09999,结果表明两
者在4~24μg·mL-1线性关系良好。
2.1.2 精密度试验 取标准曲线项下 10μg·
mL-1溶液连续进样6次,其峰面积 RSD063%,结
果表明方法精密度高。
2.1.3 稳定性试验 取标准曲线项下 10μg·
mL-1溶液,分别于0,4,8h测定其吸光度。结果分
别为 0303,0304,0302,RSD033%。证明其溶
液在8h内稳定。
2.1.4 加样回收率 取已知浓度的样液配置成3
个质量浓度,每个浓度分别取3个样,共9份,分别
加入等量柚皮苷标准液,等量稀释,测定吸光度,计
算加样回收率,见表1。
表1 柚皮苷加样回收率
样品中含量
/μg
测得量
/μg
回收率
/%
平均值
/%
RSD
/%
1305 2732 9962 9936 106
1305 2728 9934
1305 2725 9913
1588 3000 9860 9883
1588 3000 9860
1588 3010 9930
1900 3349 10115 10096
1900 3335 10017
1900 3355 10157
注:加入量均为1433μg
2.2 骨碎补样品液的制备
将骨碎补粉碎过60目筛,加60%乙醇25倍体
积回流提取3次,每次1h,合并滤液,置于旋转蒸发
仪蒸发回收乙醇至膏状,再加适量热水溶解,抽滤,
即得样品液。
2.3 大孔树脂的预处理 将色谱柱及管道清洗干
净,排净柱内水分,于柱内加入少量的95%乙醇,称
取一定量的大孔树脂以95%乙醇湿法上柱,使液面
高于树脂表面30cm,浸泡24h,然后用2BV(柱体
积)乙醇,以05BV·h-1流速通过树脂层,浸泡4
h。再以95%乙醇以2BV·h-1的流速通过树脂层,
洗至流出液加水(1∶5)不浑浊,且在200~400nm
无其他吸收为止。用双蒸水洗净乙醇。用2BV的
5%HCl溶液,以4~6BV·h-1的流速通过树脂层,
并浸泡4h,然后以纯化水洗至pH7。再用2BV的
2%NaOH溶液,以4~6BV·h-1的流速通过树脂
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层,并浸泡4h,以纯化水洗至pH7,备用。
2.4 大孔树脂的筛选
平行称取20g抽滤至干的不同类型湿树脂
7份,加入30mg·mL-1的骨碎补样品液50mL,
置恒温水浴箱25℃吸附24h,测其上清液总黄酮
浓度。滤除上液,用纯化水洗净树脂过滤,加入
100mL95%乙醇,25℃解吸24h,过滤,测解吸液
中总黄酮浓度。解吸液水浴浓缩并干燥,称取适
量,以纯化水超声溶解定容,测其总黄酮含量,即
纯度。
本试验以树脂吸附率、比吸附量、解吸率以及纯
度来考察7种树脂对骨碎补总黄酮的选择性。各指
标的计算公式如下:
树脂吸附率(%)=
C0-C1
C0
×100%;
树脂比吸附率(mg·g-1)=
V1×(C0-C1)
G
树脂解吸率(%)=
V2×C2
V1×(C0-C1)
×100%
纯度(%)=m1/m2×100%
式中:C0为初始骨碎补样品液中总黄酮浓度,
mg·mL-1;C1为吸附24h后上液中总黄酮浓度(mg
·mL-1);C2为解吸液中总黄酮浓度(mg·mL
-1);
V1为吸附骨碎补样品液体积(mL);V2为解吸液体积
(mL);m1为解吸液干燥后称取适量样品中总黄酮
的测定量,m2为称样量;G为树脂质量(g)。见表2。
表2 不同树脂对骨碎补总黄酮的选择性
树脂型号
吸附率
/%
比吸附量
/mg·g-1
解吸率
/%
纯度
/%
D4006 550 436 847 660
CAD-40 503 399 804 893
AB-8 615 487 839 755
D101 5819 462 810 715
S-8 734 582 455 728
NKA-2 183 144 674 611
NKA-9 318 251 856 751
由表2可知,就比吸附量来说,D4006,AB-8,
D101,S-8效果较好。但 S-8的解吸率仅
455%,远低于其他型号树脂,综合考虑,本试验确
定AB-8为骨碎补的优选树脂。
2.5 静态吸附试验
称取20g抽滤至干的湿树脂,加入50mL一
定质量浓度的骨碎补样品溶液,置于恒温水浴箱分
别在25,30,35℃吸附,定时取样05mL,适当稀释
后,测其质量浓度,同时补充05mL纯化水。
吸附试验结果表明12h时,AB-8树脂基本达
到吸附平衡,24h完全达到吸附平衡,由下式计算
平衡吸附量 Q=
V0×(C0-Ce)
G 。式中:V0为骨碎补
样品溶液体积(mL);C0为初始样液浓度(mg·
mL-1);Ce为骨碎补样品溶液平衡浓度(mg·
mL-1);G为树脂质量(g);以吸附达平衡时吸附量
为纵坐标,平衡时浓度为横坐标[5],绘制等温吸附
线,数据见表3。
表3 不同温度对树脂吸附平衡的吸附量
温度/℃ 平衡质量浓度 吸附量
25 106 6125
30 4982
35 4325
25 046 3150
30 2564
35 2000
25 021 1650
30 1250
35 975
25 017 1225
30 1081
35 900
25 011 775
30 634
35 425
25 009 625
30 488
35 375
由表3可以看出,树脂的吸附量随温度的升高
呈下降趋势。
采用Langmuir和Freundlich吸附等温式分别对
25,30,35℃时所得吸附等温吸附线数据进行回归,
得到树脂对总黄酮的吸附方程,结果如表4所示。
表4 树脂对总黄酮吸附等温式方程
t/℃ 方程类型1) 回归方程 r
25 Langmuir Q=C/(142×10-2-6×10-3C) 09979
Freundlich Q=41291C09255 09964
30 Langmuir Q=C/(192×10-2-33×10-3C) 09895
Freundlich Q=39185C09569 09959
35 Langmuir Q=C/(365×10-2-9×10-3C) 09949
Freundlich Q=35337C10586 09908
由相关系数可以看出,采用 Langmuir方程和
Frenundlich方程均可取得较好的拟和。
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2.6 吸附动力学方程
经过 i次取样后,骨碎补总黄酮浓度(C)与吸
附量(Q)之间的关系可用下式表示,式中 V为骨碎
补样液的体积,G为树脂质量。
Q=Σ
Ci-1-Ci
G ×V
以吸附量(Q)为纵坐标,时间(t)为横坐标,绘
制出树脂吸附动力学曲线如图1所示。
图1 不同浓度树脂吸附动力学曲线
从图1可知,吸附量与总黄酮初始浓度之间有
一定相关性,用最小二乘法进行多元回归,可得到
25℃ 时树脂吸附动力学方程[5]Q=04541+
77144C0+02783C0
2t(02558+00176C0-00057C02)。
2.7 pH的影响
平行称取2g已处理好的 AB-8树脂6份,分
别加入50mL一定浓度的骨碎补样品液,分别调节
pH为3,4,5,6,7,8,置25℃恒温水浴箱吸附24h
后,取上液测浓度,计算吸附量,结果分别为13,14,
125,11,10,85mg。
2.8 洗脱溶剂的筛选
取20g已处理好的 AB-8型大孔树脂装柱
(20mm×150mm)。精密吸取骨碎补样液20mL
(35mg·mL-1)上柱,吸附3h后,用水洗脱至还
原糖反应阴性(硫酸苯酚无颜色反应)。依次用
10%,20%,30%,50%,70%,95%的乙醇以 1mL
·min-1流速进行洗脱,每12mL收集为一个流分,
用水适量稀释,测吸光度并计算浓度。以流分编
号为横坐标,浓度为纵坐标,绘制洗脱曲线如下,
结果表明 50%醇能洗脱绝大部分总黄酮,是最佳
的洗脱溶剂[6]。
3 讨论
3.1 大孔树脂的极性、孔径、比表面积是影响吸附
性能的重要因素[7]。遵从相似相容原则,极性较大
的树脂适合用于在弱极性溶液中吸附极性大的物
质,极性小的树脂适合用于在强极性溶液中吸附极
性小的物质。骨碎补总黄酮主要物质柚皮苷为二氢
黄酮是极性物质,因此极性和弱极性树脂是较好的
选择。从数据可以看出,极性树脂的效果比较好,
S-8的比吸附量最大。
另外,吸附质的分子大小和树脂孔径对吸附也
有很大影响。骨碎补总黄酮相对分子质量为
58053的比较大分子,因此,大的孔径有利于树脂
的吸附。同是极性树脂的 S-8,NKA2,NKA9,其孔
径大小 S-8>NKA2>NKA9,故吸附量 S-8>
NKA2>NKA9。
大孔树脂吸附为一物理吸附过程,树脂的比表
面积大,更有利于树脂的吸附,D4006的比表面积远
大于其他树脂,因此虽然它的孔径小且为弱极性,但
是吸附量也相当大。故大孔树脂的吸附是一个综合
因素影响的过程,不能仅凭借某一方面来选择,而应
当多方面的试验来选择合适的树脂。
3.2 对等温吸附线进行 Freundich和 Langmuir方
程拟合,2个方程均能较好的拟合,通过2个方程的
计算,结果显示,低浓度时 Langmuir计算得到的最
大吸附量和试验结果相近,而高浓度时Freundich计
算得到最大吸附量和试验结果相近,这一结果说明,
在低浓度时,吸附是单分子吸附为主的吸附,而高浓
度时,发生的是多分子层吸附为主的吸附。
3.3 由25℃的吸附动力学的方程可以看出吸附量
的大小与骨碎补总黄酮的初始浓度和时间有关。初
始浓度越大,吸附量越大,时间越长,吸附量越大,到
达吸附平衡时,吸附量不再增加。
3.5 上柱药液的温度升高,树脂的比吸附量下降,
说明树脂的吸附过程为一放热反应,低温有利于树
脂吸附容量的提高,高温有利于树脂的解吸。
3.6 结果显示pH4树脂的吸附量较好,pH太大和
太小均不利于吸附,原因可能是骨碎补总黄酮为多
羟基酚类,呈酸性结构,pH太大易成盐,pH太小,易
形成烊盐[8],而树脂吸附时,吸附质以分子状态吸
附效果最好,pH太大或太小骨碎补总黄酮均不能以
分子结构存在,影响了吸附效果。
[参考文献]
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骨组织形态计量学影响[J].中国中药杂志,2004,29(4):343.
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究[J].中国天然药物,2004,2(4):232.
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2004:85.
[8] 新 生.天然药物化学[M].北京:人民卫生出版社,2004:
175.
[责任编辑 鲍 雷]
HPLC测定加拿大红豆杉浸膏中紫杉醇的含量
何法霖1,卢建伟2,赵 锐3,张宏桂1
(1.北京中医药大学 中药学院,北京 100102;
2.吉林农业大学 中药材学院,吉林 长春 130118;
3.北京天然药物研究院,北京 100013)
[收稿日期] 20060530
[通讯作者] 张宏桂,Tel:(010)84738642,Email:zhanghong
zxcv@21cn.com
紫杉醇是当今一种重要的抗癌新药,1992年被
美国FDA批准为治疗卵巢癌的特效药而上市,1994
年4月被批准治疗晚期乳腺癌,它对肺癌也有较好
疗效[1],紫杉醇的开发、研究和应用成为近年来肿
瘤化疗研究中的热点之一。目前国内外紫杉醇的供
药主要依靠从植物中提取,因此涉及到如何分离并
去掉与紫杉醇结构相似的其他紫杉烷类化合物,但
是由于紫杉烷类化合物种类繁多,结构相似,干扰较
大,给分离检测工作带来很大的困难,国内外都进行
了大量的研究工作[25]。
作者对加拿大红豆杉浸膏中紫杉醇进行含量测
定,结果表明该方法操作简便,精密度好,准确可靠,
对确认加拿大红豆杉中紫杉醇的含量具有借鉴性,
具有一定的社会价值和经济效益。
1 仪器与试药
Agilent1100系列高效液相色谱仪,Agilent1100
自动进样仪,日丽U-2800紫外可见分光光度计。
紫杉醇对照品(北京百灵威化工仪器有限责任
公司,批号33069624),加拿大红豆杉浸膏由北京
天然药物研究院提供(批号为 T051101,T051102,
T051103)。甲醇为色谱纯(天津四有生物医学技术
公司),其他试剂均为分析纯(北京化工厂)。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 PFP柱(46mm×250mm,5
μm),流动相为甲醇乙腈水(10∶42∶48),流速10
mL·min-1,检测波长227nm,柱温室温,记录灵敏
度0001,进样量5μL,分析时间45min。
2.2 检测波长的选择 通过190~550nm进行扫
描,紫杉醇在227nm处有最大吸收,故选择227nm
为其检测波长。
2.3 对照品储备液的制备 精密称取紫杉醇对照
品(批号33069624)5064mg于100mL中以甲醇
溶解并定容,即得对照品储备液(05047mg·
mL-1)。
2.4 供试样品液 精密称取加拿大红豆杉浸膏
5042mg置50mL中,用甲醇溶解并定容,取部分
溶液,用045μm微孔滤膜滤过,即得。
2.5 线性关系考察 分别精确吸取上述对照品贮
备液 010,050,100,200,500,1000mL,分别
置于100mL量瓶中,用流动相定容后摇匀,各进样
5μL,以峰面积 Y为纵坐标,浓度 X为横坐标绘制
标准曲线,回归方程为 Y=9991×103+1443,r=
09999,在0005~050mg·mL-1线性关系良好。
对照品色谱图见图1。
2.6 系统适应性试验 取浓度为 05047mg·
mL-1对照品溶液进样,以紫杉醇计算理论塔板数为
12031,供试样品中,紫杉醇与最近峰的分离因子为
155与杂质分离良好,无干扰,见图1。
2.7 精密度及重复性试验 取05047mg·mL-1
对照品溶液,重复进样 5次,测定其峰面积,计算
RSD为123%;取同一批浸膏(T051101),精密称
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