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大孔树脂吸附骨碎补总黄酮特性的研究



全 文 :大孔树脂吸附骨碎补总黄酮特性的研究
陈 顺,关延彬
(华中科技大学 同济医学院 药学院,湖北 武汉 430030)
[收稿日期] 20051210
[通讯作者] 关延彬,Tel:(027)83692221,Email:guanyan
bin96@163.com
  骨碎补为水龙骨科多年生附生蕨类植物槲蕨
Drynariafortunei(Kunze)J.Sm的根茎。传统中医
认为骨碎补性味苦温归肾肝经,具有补肾强骨、续伤
止痛功效,用于肾虚腰痛、耳鸣耳聋、牙齿松动,跌扑
闪挫,筋骨折伤;有报道称骨碎补总黄酮有刺激骨生
长[1]、预防骨质疏松[2]和抗炎作用[3]。
大孔树脂对于黄酮类化合物是较理想的吸附
剂,但应用于骨碎补总黄酮的研究还不多见。作者
比较了7种不同型号的大孔树脂对骨碎补总黄酮吸
附性质,对其中效果较好的AB-8型树脂进行了吸
附动力学及热力学特性研究,其结果可为研究骨碎
补的提取纯化方法提供参考。
1 仪器与材料
UV754分光光度计(上海第三分析仪器厂),
DF-101S智能恒温水浴锅(巩义市英裕华中仪器
厂),旋转蒸发器 RE52-99(上海亚荣生化仪器
厂),骨碎补(市售,经本院张长弓教授鉴定),柚皮
苷对照品(中国药品生物制品检定所,批号 0722
200108),大孔树脂D101(天津农药厂),CAD40(安
徽三星树脂厂),D4006,AB-8,S-8,NKA2,NKA9
(南开大学化工厂)。
2 方法与结果
2.1 方法学考察
2.1.1 标准曲线制备 精密称取柚皮苷5mg置
50mL量瓶,纯化水定容摇匀,分别精密吸取1,2,3,
4,5,6mL分别置25mL量瓶,纯化水定容摇匀,在
283nm测定吸光度,以吸光度对质量浓度求回归方
程为A=0005+00274C,r=09999,结果表明两
者在4~24μg·mL-1线性关系良好。
2.1.2 精密度试验 取标准曲线项下 10μg·
mL-1溶液连续进样6次,其峰面积 RSD063%,结
果表明方法精密度高。
2.1.3 稳定性试验 取标准曲线项下 10μg·
mL-1溶液,分别于0,4,8h测定其吸光度。结果分
别为 0303,0304,0302,RSD033%。证明其溶
液在8h内稳定。
2.1.4 加样回收率 取已知浓度的样液配置成3
个质量浓度,每个浓度分别取3个样,共9份,分别
加入等量柚皮苷标准液,等量稀释,测定吸光度,计
算加样回收率,见表1。
表1 柚皮苷加样回收率
样品中含量
/μg
测得量
/μg
回收率
/%
平均值
/%
RSD
/%
1305 2732 9962 9936 106
1305 2728 9934    
1305 2725 9913    
1588 3000 9860 9883  
1588 3000 9860    
1588 3010 9930    
1900 3349 10115 10096  
1900 3335 10017    
1900 3355 10157    
  注:加入量均为1433μg
2.2 骨碎补样品液的制备
将骨碎补粉碎过60目筛,加60%乙醇25倍体
积回流提取3次,每次1h,合并滤液,置于旋转蒸发
仪蒸发回收乙醇至膏状,再加适量热水溶解,抽滤,
即得样品液。
2.3 大孔树脂的预处理 将色谱柱及管道清洗干
净,排净柱内水分,于柱内加入少量的95%乙醇,称
取一定量的大孔树脂以95%乙醇湿法上柱,使液面
高于树脂表面30cm,浸泡24h,然后用2BV(柱体
积)乙醇,以05BV·h-1流速通过树脂层,浸泡4
h。再以95%乙醇以2BV·h-1的流速通过树脂层,
洗至流出液加水(1∶5)不浑浊,且在200~400nm
无其他吸收为止。用双蒸水洗净乙醇。用2BV的
5%HCl溶液,以4~6BV·h-1的流速通过树脂层,
并浸泡4h,然后以纯化水洗至pH7。再用2BV的
2%NaOH溶液,以4~6BV·h-1的流速通过树脂
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Vol.32,Issue 8
April,2007
层,并浸泡4h,以纯化水洗至pH7,备用。
2.4 大孔树脂的筛选
平行称取20g抽滤至干的不同类型湿树脂
7份,加入30mg·mL-1的骨碎补样品液50mL,
置恒温水浴箱25℃吸附24h,测其上清液总黄酮
浓度。滤除上液,用纯化水洗净树脂过滤,加入
100mL95%乙醇,25℃解吸24h,过滤,测解吸液
中总黄酮浓度。解吸液水浴浓缩并干燥,称取适
量,以纯化水超声溶解定容,测其总黄酮含量,即
纯度。
本试验以树脂吸附率、比吸附量、解吸率以及纯
度来考察7种树脂对骨碎补总黄酮的选择性。各指
标的计算公式如下:
树脂吸附率(%)=
C0-C1
C0
×100%;
树脂比吸附率(mg·g-1)=
V1×(C0-C1)

树脂解吸率(%)=
V2×C2
V1×(C0-C1)
×100%
纯度(%)=m1/m2×100%
式中:C0为初始骨碎补样品液中总黄酮浓度,
mg·mL-1;C1为吸附24h后上液中总黄酮浓度(mg
·mL-1);C2为解吸液中总黄酮浓度(mg·mL
-1);
V1为吸附骨碎补样品液体积(mL);V2为解吸液体积
(mL);m1为解吸液干燥后称取适量样品中总黄酮
的测定量,m2为称样量;G为树脂质量(g)。见表2。
表2 不同树脂对骨碎补总黄酮的选择性
树脂型号
吸附率
/%
比吸附量
/mg·g-1
解吸率
/%
纯度
/%
D4006 550 436 847 660
CAD-40 503 399 804 893
AB-8 615 487 839 755
D101 5819 462 810 715
S-8 734 582 455 728
NKA-2 183 144 674 611
NKA-9 318 251 856 751
  由表2可知,就比吸附量来说,D4006,AB-8,
D101,S-8效果较好。但 S-8的解吸率仅
455%,远低于其他型号树脂,综合考虑,本试验确
定AB-8为骨碎补的优选树脂。
2.5 静态吸附试验
称取20g抽滤至干的湿树脂,加入50mL一
定质量浓度的骨碎补样品溶液,置于恒温水浴箱分
别在25,30,35℃吸附,定时取样05mL,适当稀释
后,测其质量浓度,同时补充05mL纯化水。
吸附试验结果表明12h时,AB-8树脂基本达
到吸附平衡,24h完全达到吸附平衡,由下式计算
平衡吸附量 Q=
V0×(C0-Ce)
G 。式中:V0为骨碎补
样品溶液体积(mL);C0为初始样液浓度(mg·
mL-1);Ce为骨碎补样品溶液平衡浓度(mg·
mL-1);G为树脂质量(g);以吸附达平衡时吸附量
为纵坐标,平衡时浓度为横坐标[5],绘制等温吸附
线,数据见表3。
表3 不同温度对树脂吸附平衡的吸附量
温度/℃ 平衡质量浓度 吸附量
25 106 6125
30   4982
35   4325
25 046 3150
30   2564
35   2000
25 021 1650
30   1250
35   975
25 017 1225
30   1081
35   900
25 011 775
30   634
35 425
25 009 625
30   488
35   375
  由表3可以看出,树脂的吸附量随温度的升高
呈下降趋势。
采用Langmuir和Freundlich吸附等温式分别对
25,30,35℃时所得吸附等温吸附线数据进行回归,
得到树脂对总黄酮的吸附方程,结果如表4所示。
表4 树脂对总黄酮吸附等温式方程
t/℃ 方程类型1) 回归方程 r
25 Langmuir Q=C/(142×10-2-6×10-3C) 09979
  Freundlich Q=41291C09255 09964
30 Langmuir Q=C/(192×10-2-33×10-3C) 09895
  Freundlich Q=39185C09569 09959
35 Langmuir Q=C/(365×10-2-9×10-3C) 09949
  Freundlich Q=35337C10586 09908
  由相关系数可以看出,采用 Langmuir方程和
Frenundlich方程均可取得较好的拟和。
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2.6 吸附动力学方程
经过 i次取样后,骨碎补总黄酮浓度(C)与吸
附量(Q)之间的关系可用下式表示,式中 V为骨碎
补样液的体积,G为树脂质量。
Q=Σ
Ci-1-Ci
G ×V
以吸附量(Q)为纵坐标,时间(t)为横坐标,绘
制出树脂吸附动力学曲线如图1所示。
图1 不同浓度树脂吸附动力学曲线
  从图1可知,吸附量与总黄酮初始浓度之间有
一定相关性,用最小二乘法进行多元回归,可得到
25℃ 时树脂吸附动力学方程[5]Q=04541+
77144C0+02783C0
2t(02558+00176C0-00057C02)。
2.7 pH的影响
平行称取2g已处理好的 AB-8树脂6份,分
别加入50mL一定浓度的骨碎补样品液,分别调节
pH为3,4,5,6,7,8,置25℃恒温水浴箱吸附24h
后,取上液测浓度,计算吸附量,结果分别为13,14,
125,11,10,85mg。
2.8 洗脱溶剂的筛选
取20g已处理好的 AB-8型大孔树脂装柱
(20mm×150mm)。精密吸取骨碎补样液20mL
(35mg·mL-1)上柱,吸附3h后,用水洗脱至还
原糖反应阴性(硫酸苯酚无颜色反应)。依次用
10%,20%,30%,50%,70%,95%的乙醇以 1mL
·min-1流速进行洗脱,每12mL收集为一个流分,
用水适量稀释,测吸光度并计算浓度。以流分编
号为横坐标,浓度为纵坐标,绘制洗脱曲线如下,
结果表明 50%醇能洗脱绝大部分总黄酮,是最佳
的洗脱溶剂[6]。
3 讨论
3.1 大孔树脂的极性、孔径、比表面积是影响吸附
性能的重要因素[7]。遵从相似相容原则,极性较大
的树脂适合用于在弱极性溶液中吸附极性大的物
质,极性小的树脂适合用于在强极性溶液中吸附极
性小的物质。骨碎补总黄酮主要物质柚皮苷为二氢
黄酮是极性物质,因此极性和弱极性树脂是较好的
选择。从数据可以看出,极性树脂的效果比较好,
S-8的比吸附量最大。
另外,吸附质的分子大小和树脂孔径对吸附也
有很大影响。骨碎补总黄酮相对分子质量为
58053的比较大分子,因此,大的孔径有利于树脂
的吸附。同是极性树脂的 S-8,NKA2,NKA9,其孔
径大小 S-8>NKA2>NKA9,故吸附量 S-8>
NKA2>NKA9。
大孔树脂吸附为一物理吸附过程,树脂的比表
面积大,更有利于树脂的吸附,D4006的比表面积远
大于其他树脂,因此虽然它的孔径小且为弱极性,但
是吸附量也相当大。故大孔树脂的吸附是一个综合
因素影响的过程,不能仅凭借某一方面来选择,而应
当多方面的试验来选择合适的树脂。
3.2 对等温吸附线进行 Freundich和 Langmuir方
程拟合,2个方程均能较好的拟合,通过2个方程的
计算,结果显示,低浓度时 Langmuir计算得到的最
大吸附量和试验结果相近,而高浓度时Freundich计
算得到最大吸附量和试验结果相近,这一结果说明,
在低浓度时,吸附是单分子吸附为主的吸附,而高浓
度时,发生的是多分子层吸附为主的吸附。
3.3 由25℃的吸附动力学的方程可以看出吸附量
的大小与骨碎补总黄酮的初始浓度和时间有关。初
始浓度越大,吸附量越大,时间越长,吸附量越大,到
达吸附平衡时,吸附量不再增加。
3.5 上柱药液的温度升高,树脂的比吸附量下降,
说明树脂的吸附过程为一放热反应,低温有利于树
脂吸附容量的提高,高温有利于树脂的解吸。
3.6 结果显示pH4树脂的吸附量较好,pH太大和
太小均不利于吸附,原因可能是骨碎补总黄酮为多
羟基酚类,呈酸性结构,pH太大易成盐,pH太小,易
形成烊盐[8],而树脂吸附时,吸附质以分子状态吸
附效果最好,pH太大或太小骨碎补总黄酮均不能以
分子结构存在,影响了吸附效果。
[参考文献]
[1] 谢雁鸣,鞠大宏,赵晋宁.骨碎补总黄酮对去卵巢大鼠骨密度和
骨组织形态计量学影响[J].中国中药杂志,2004,29(4):343.
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2004:85.
[8] 新 生.天然药物化学[M].北京:人民卫生出版社,2004:
175.
[责任编辑 鲍 雷]
HPLC测定加拿大红豆杉浸膏中紫杉醇的含量
何法霖1,卢建伟2,赵 锐3,张宏桂1
(1.北京中医药大学 中药学院,北京 100102;
2.吉林农业大学 中药材学院,吉林 长春 130118;
3.北京天然药物研究院,北京 100013)
[收稿日期] 20060530
[通讯作者] 张宏桂,Tel:(010)84738642,Email:zhanghong
zxcv@21cn.com
  紫杉醇是当今一种重要的抗癌新药,1992年被
美国FDA批准为治疗卵巢癌的特效药而上市,1994
年4月被批准治疗晚期乳腺癌,它对肺癌也有较好
疗效[1],紫杉醇的开发、研究和应用成为近年来肿
瘤化疗研究中的热点之一。目前国内外紫杉醇的供
药主要依靠从植物中提取,因此涉及到如何分离并
去掉与紫杉醇结构相似的其他紫杉烷类化合物,但
是由于紫杉烷类化合物种类繁多,结构相似,干扰较
大,给分离检测工作带来很大的困难,国内外都进行
了大量的研究工作[25]。
作者对加拿大红豆杉浸膏中紫杉醇进行含量测
定,结果表明该方法操作简便,精密度好,准确可靠,
对确认加拿大红豆杉中紫杉醇的含量具有借鉴性,
具有一定的社会价值和经济效益。
1 仪器与试药
Agilent1100系列高效液相色谱仪,Agilent1100
自动进样仪,日丽U-2800紫外可见分光光度计。
紫杉醇对照品(北京百灵威化工仪器有限责任
公司,批号33069624),加拿大红豆杉浸膏由北京
天然药物研究院提供(批号为 T051101,T051102,
T051103)。甲醇为色谱纯(天津四有生物医学技术
公司),其他试剂均为分析纯(北京化工厂)。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 PFP柱(46mm×250mm,5
μm),流动相为甲醇乙腈水(10∶42∶48),流速10
mL·min-1,检测波长227nm,柱温室温,记录灵敏
度0001,进样量5μL,分析时间45min。
2.2 检测波长的选择 通过190~550nm进行扫
描,紫杉醇在227nm处有最大吸收,故选择227nm
为其检测波长。
2.3 对照品储备液的制备 精密称取紫杉醇对照
品(批号33069624)5064mg于100mL中以甲醇
溶解并定容,即得对照品储备液(05047mg·
mL-1)。
2.4 供试样品液 精密称取加拿大红豆杉浸膏
5042mg置50mL中,用甲醇溶解并定容,取部分
溶液,用045μm微孔滤膜滤过,即得。
2.5 线性关系考察 分别精确吸取上述对照品贮
备液 010,050,100,200,500,1000mL,分别
置于100mL量瓶中,用流动相定容后摇匀,各进样
5μL,以峰面积 Y为纵坐标,浓度 X为横坐标绘制
标准曲线,回归方程为 Y=9991×103+1443,r=
09999,在0005~050mg·mL-1线性关系良好。
对照品色谱图见图1。
2.6 系统适应性试验 取浓度为 05047mg·
mL-1对照品溶液进样,以紫杉醇计算理论塔板数为
12031,供试样品中,紫杉醇与最近峰的分离因子为
155与杂质分离良好,无干扰,见图1。
2.7 精密度及重复性试验 取05047mg·mL-1
对照品溶液,重复进样 5次,测定其峰面积,计算
RSD为123%;取同一批浸膏(T051101),精密称
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