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Study on correlation between effective ingredients of
Dogwood Fruit from genuine producing regions and traits

山茱萸道地产区有效成分变异与性状相关研究



全 文 :山茱萸道地产区有效成分变异与性状相关研究
喻卫武,符庆功,戴文圣,黎章矩
(浙江林学院 浙江省现代森林培育技术重点实验室,浙江 临安311300)
[摘要] 目的:通过对道地产区山茱萸果实有效成分变异、有效成分间及有效成分与外形、营养指标之间的相
关研究,为山茱萸基于有效成分的良种选择提供理论基础。方法:采集山茱萸道地产区浙江省淳安县、临安市实生
单株完熟果实,运用HPLC测定单株果实的马钱素、熊果酸、齐墩果酸含量,同时测定山茱萸果实的纵径/横径、可
溶性固形物、出皮率等性状。结果:①道地产区内熊果酸、齐墩果酸、马钱素变异幅度分别为01010% ~0478
6%,00149%~01274%,059%~230%,RSD分别为3433%,4048%,2850%;②有效成分间及有效成分与
外形、营养指标之间的相关关系如下:熊果酸、齐墩果酸相关极显著,相关系数为09796;熊果酸、齐墩果酸与可溶
性固形物成极显著负相关,相关系数分别为-05544,-05118;马钱素与可溶性固形物成显著相关,相关系数为
02412;熊果酸、齐墩果酸、马钱素与出皮率成显著负相关,相关系数分别 -02507,-02443,-02406;3种有
效成分与纵径/横径相关不明显。结论:山茱萸单株间有效成分变异明显,选种潜力巨大;利用有效成分间及有效
成分与外形、营养指标之间的相关关系,进行以有效成分为指标的选育种时,应以单株选种为主,可将熊果酸与齐
墩果酸合并作为1个指标,并可用可溶性固形物做粗步筛选。
[关键词] 山茱萸;有效成分;变异;性状相关
[中图分类号]S567 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)23275105
[收稿日期] 20080124
[基金项目] 浙江省重中之重学科浙江林学院森林培育学科
开放基金(200511);浙江省教育厅项目(2451001066)
[通讯作者] 喻卫武,Tel:(0571)63743865,Email:yww888
@zjfc.edu.cn
  中药现代化的源头是良种,只有在种源优良的
基础上建立规范化的栽培技术,才能保证生药品质
优良且稳定一致。山茱萸 Cornusoficinalis是山茱
萸科山茱萸属的一种传统珍贵中药材,临床用于内
热消渴、眩晕耳鸣、腰膝酸痛、阳痿遗精、大汗虚脱
等[1],为六味地黄丸等多个汉方的主要用药原料,
是25种用量最多的也是19个国家要求大力发展的
中药材之一[2]。山茱萸有效成分复杂,1995,2005
年版药典分别以熊果酸和马钱素作为山茱萸的质量
控制指标。
小样本试验也表明,同一区域山茱萸单株间在
熊果酸、马钱素等有效成分含量上也存在显著差
异[3]。因此在种源内有效成分变异研究基础上,建
立种质主要形态、营养指标与有效成分相关关系,可
形成以有效成分含量为主,兼顾果实特性和营养成
分的多性状综合选择指标体系,既可筛选、保存优良
单株,又能提高定向选育效率,对促进相关药用产业
的发展有积极意义。
本研究通过对山茱萸道地产区内单株果实药用
有效成分马钱素、熊果酸和齐墩果酸含量的分析,对
果实外形和营养指标的测定,确定了产区内药用有
效成分的变异范围,建立了有效成分间及有效成分
与外形、营养指标之间的相关关系,为进一步开展良
种选择提供了理论基础,收集和保存了部分有利用
潜力的种质。
1 样品采集区概况
试验样品全部采集自浙江省临安市、淳安县交
界的山茱萸集中分布区(北纬29°11′~30°02′,东经
118°20′~119°20′),该地年平均气温178℃。年极
端最低气温-151℃,年极端最高气温407℃,总
降水量14257mm,海拔550~800m,是传统上的
山茱萸道地产区。
2 材料与方法
2.1 仪器与试剂
WatersTM600二元泵(沃特斯公司),手动进样,
WatersTM486紫外检测器,HS2000液相色谱工作站
(英谱公司),Mili-Q超纯水装置。马钱素、熊果
酸、齐墩果酸对照品由上海君创生物科技有限公司
提供,含量不低于98%;水为超纯水;甲醇(天津四
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友公司)为色谱纯;其他试剂均为分析纯;流动相过
045μm滤膜。
2.2 采样方法
选择浙江山茱萸集中分布的几个乡镇,按成熟
时间、外形差异,采集不同类型实生山茱萸形态完全
成熟的果实,编号后冷冻保存。样品由浙江林学院
森林培育学科戴文圣教授鉴定。
2.3 果实可溶性固形物、纵径/横径、出皮率的测定
果实可溶性固形物:取20粒完熟果实果肉,充
分混合后取样用手持折光仪直接测量3组数据,取
平均值;纵径/横径:同一株样品取3组,每组20粒
果实,用游标卡尺测量每粒果实的纵径/横径,分别
记录结果后计算平均值,认可误差在3%以内的数
据,最后计算每个单株的纵径/横径;出皮率:称取
20g左右的果实,手工去核后称重(总重减核重作
为果肉重),以果肉重与总重比值为出皮率,双平行
试验,认可误差不超过3%的数值,计算平均出皮率
为单株出皮率。
2.4 马钱素含量测定
马钱素含量测定参照2005年版《中国药典》方
法[4]。
2.4.1 色谱条件 色谱柱 WatersSunfireC18(46
mm×250mm,5μm);流动相甲醇水(30∶70);检测
波长 231nm;柱温为室温 20℃;流速 08mL·
min-1。在此条件下,马钱素与其他组分均能达到良
好分离(分离度大于15,马钱素对照品与样品的保
留时间分别为15602,15523min,图1)。
A.马钱素对照品;B.供试样品;1.马钱素
图1 马钱素对照品及供试样品色谱图
2.4.2 对照品溶液与供试品溶液的配制 对照品
溶液配制:精密称取马钱素对照品48mg,置10mL
量瓶中,加 30%甲醇溶解定容,得到标准储备液。
供试品溶液配制:取山茱萸新鲜果实,去核,置烘箱
内60℃烘干48h,冷却后粉碎过筛(60目),精密称
量粉末05g,置锥形瓶中,加入30%的甲醇10mL,
超声震荡15min,置于50mL的量瓶中,重复4次,
用适量的30%甲醇清洗残渣,并入量瓶,稀释至刻
度,摇匀,作为供试品溶液。然后取上清液至离心管
中,12000r·min-1离心10min,取上清液过045
μm微孔滤膜后进样。
2.4.3 线性关系考察 取马钱素对照品溶液,分别
进样2,4,6,8,10μL,以对照品质量(μg)为横坐标,
峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,计算回归方程为
Y=1184×109X+1677×105,r=09995,表明马
钱素在096~48μg进样量与峰面积线性关系良
好。
2.4.4 精密度、稳定性、重复性、加样回收率试验 
精密吸取上述对照品溶液10μL,连续进样5次,按
马钱素峰面积进行计算得峰面积的 RSD097%。
分别于0,1,2,4,8,12h精密吸取供试品溶液20μL
进样,按马钱素峰面积进行计算得 RSD13%。取
同一样品,5次重复制备测试,按马钱素峰面积进行
计算得峰面积的 RSD147%。精密称取马钱素对
照品20mg,加入精密称量的05g山茱萸样品粉
末中,按马钱素供试品溶液的配制方法制备样品溶
液,进样20μL,重复3次,计算平均加样回收率为
1018%。
2.5 熊果酸、齐墩果酸的含量测定
测定方法参考文献[5]。
2.5.1 色谱条件 色谱柱 WatersSunfireC18柱
(46mm×250mm,5μm),流动相甲醇04%磷酸
(85∶15),检测波长210nm,流速1mL·min-1,室温
20℃;在此条件下,熊果酸、齐墩果酸与其他组分均
能达到良好分离(分离度大于15,齐墩果酸、熊果
酸保留时间分别为25898,27632min,图2)。
2.5.2 对照品溶液与供试品溶液的配制 对照品
溶液的配制:分别精密称取齐墩果酸对照品、熊果酸
对照品48,49mg,充分溶解后用甲醇定容至 5
mL,即得到标准储备液。供试品溶液的配制:精密
称取山茱萸粉末 1g,加氯仿 50mL超声处理 30
min,取出,过滤,再加10mL氯仿洗涤残液,滤液回
收至干,10mL石油醚(30~60℃)脱脂约2min,倾
去石油醚,重复1次后残渣用甲醇溶解,定容至5mL,
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A.齐墩果酸对照品;B.熊果酸对照品;C.供试样品;
1.齐墩果酸;2.熊果酸
图2 齐墩果酸、熊果酸对照品及供试样品色谱图
用045μm微孔滤膜过滤后进样,进样量为20μL。
2.5.3 线性关系考察 取齐墩果酸和熊果酸对照
品溶液,分别进样 2,4,6,8,10μL,以对照品质量
(μg)为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,计
算熊果酸对照品回归方程为 Y=5215×108X-
2336×104,相关系数为09997,齐墩果酸对照品
回归方程为 Y=6156×109X+6952×104,r=
09997,表明熊果酸在196~98μg进样量与峰面
积线性关系良好、齐墩果酸在192~96μg进样量
与峰面积线性关系良好。
2.5.4 精密度、稳定性、重复性、加样回收率试验 
分别精密吸取熊果酸、齐墩果酸对照品溶液10μL,
连续进样5次,按熊果酸、齐墩果酸峰面积进行计算
得峰面积的RSD分别为124%,145%。精密量取
供试品溶液20μL,分别于0,1,2,4,8,12h时进样,
分别按熊果酸和齐墩果酸峰面积进行计算得峰面积
的RSD分别为12%,094%。取同一样品,5次重
复制备测试,按齐墩果酸、熊果酸峰面积计算得齐墩
果酸、熊果酸峰面积的RSD分别为307%,262%。
取已知含量的各样品10g左右,精密加入20mg
齐墩果酸和熊果酸对照品,重复3次,测定平均加样
回收率分别为973%,987%。
3 结果与分析
3.1 各指标测定结果
有效成分质量分数、外形、可溶性固形物、出皮
率测定结果见表1。
表1 有效成分质量分数、外形、可溶性固形物、出皮率测定
No.
熊果酸
/%
齐墩果酸
/%
马钱素
/%
纵径
/横径
可溶性固
形物/%
出皮率
/%
1 02313 00578 1453 139 966 7700
2 03829 01001 1197 164 867 7569
3 01809 00444 0769 150 966 8274
4 04786 01217 0757 151 800 7817
5 02881 00686 1714 155 1000 7498
6 01747 00395 1389 126 1133 8033
7 04591 01040 1394 153 933 7450
8 03237 00793 0918 157 967 8116
9 02411 00639 1037 138 933 8011
10 03664 00900 1619 158 1067 7439
11 02758 00677 0704 177 900 7779
12 02543 00572 1255 206 1067 8093
13 03261 00836 1703 143 633 7773
14 03250 00733 1307 177 1100 7369
15 02130 00498 1125 143 967 7763
16 04771 01305 0709 138 1000 7315
17 03015 00657 1333 150 1167 7752
18 02709 00641 1141 162 1033 6989
19 02183 00483 1559 156 1067 7455
20 02483 00591 1880 167 1133 7326
21 02586 00621 1838 148 1233 7192
22 02631 00680 1133 134 1267 7623
23 02399 00587 1004 171 1200 8176
24 01520 00334 0888 145 1167 7643
25 01749 00325 1507 154 1100 7254
26 02185 00517 1134 157 1100 7860
27 02312 00543 1547 159 1267 7734
28 01885 00375 1207 168 833 7512
29 02777 00697 0923 149 1033 7800
30 02791 00722 1389 157 1000 7067
31 02764 00705 1560 158 1033 7575
32 02452 00589 1146 152 1100 7415
33 01612 00306 1128 170 1167 8180
34 02060 00513 0683 157 1200 7910
35 02195 00572 1604 172 1100 6987
36 01890 00431 1779 144 1133 7586
37 02472 00607 1022 168 1233 7024
38 01949 00482 1383 153 1167 7607
39 03329 00849 1167 158 1000 7371
40 01858 00407 0810 164 1000 7995
41 03367 00838 1178 181 933 7912
42 02019 00425 1500 138 1300 7853
43 02477 00606 1263 173 1200 7831
44 03592 01002 1467 167 833 7944
45 03165 00825 1209 160 967 7769
46 01477 00317 1204 143 1233 8066
47 02479 00572 1362 152 1200 6716
48 03204 00816 0919 143 1167 7961
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续表1
No.
熊果酸
/%
齐墩果酸
/%
马钱素
/%
纵径
/横径
可溶性固
形物/%
出皮率
/%
49 02915 00779 1531 150 1233 7884
50 01998 00444 2160 148 1300 7401
55 01890 00400 0998 169 1200 8349
56 03375 00880 1555 155 1267 7603
57 01635 00247 1749 161 1200 7866
58 02676 00621 1564 153 1333 7771
59 02845 00763 1678 150 1167 7421
60 02166 00525 1276 153 1300 8031
61 02430 00668 1783 183 1267 7684
62 01531 00323 0800 171 1100 8094
63 02570 00557 1072 152 1100 8094
64 01784 00468 1866 167 1267 7894
65 01841 00444 1255 145 1500 7636
66 01095 00229 2081 154 1767 7888
67 01213 00296 1132 151 1300 7924
68 01213 00213 0878 144 1333 8062
69 02015 00456 1183 149 1333 7420
70 01645 00365 1108 157 1200 7628
71 01448 00290 1550 151 1400 7628
72 01486 00360 1474 181 1800 7476
73 01013 00149 0592 175 1433 8050
74 01415 00403 1236 133 1633 8026
75 01010 00158 0770 161 1200 7401
76 01560 00354 1692 189 1467 7845
77 01747 00422 1326 169 1467 7761
78 01643 00309 0958 - - -
  注:78号样品量过少,纵径/横径、可溶性固形物、出皮率未测定
3.2 有效成分分布与变异
从表1中数据可以得出,山茱萸道地产区单株
间有效成分含量存在差异,变异明显。①马钱素变
异幅度为0592% ~2303%,RSD2850%,平均质
量分数为 1330%,单株最大含量为最小含量的
389倍,含量集中分布在 070% ~170%的有 64
株,占总测定数的 821%;②熊果酸变异幅度为
01010% ~04786%,RSD3433%,平均质量
  
分数为 02373%,单株最大含量为最小含量的
474倍,含量集中分布在015%~035%有63株,
占总株数的808%;③齐墩果酸变异幅度为0014
9% ~01274%,RSD4048%,平均质量分数为
00572%,单株最大含量为最小含量的855倍,含
量集中分布在 0025% ~0085%有 66株,占总测
定数的846%。
3.3 有效成分间及有效成分与外形、营养指标之间
的相关关系
运用DPS数据分析软件对表1数据处理,得出
有效成分间及有效成分与外形、营养指标间相关关
系(表2),可以得出:①山茱萸有效成分熊果酸与齐
墩果酸之间存在极显著相关,r=09796,熊果酸与
齐墩果酸都为有机酸,而且是一对同分异构体,在形
成机制上可能较为一致,因此两者相关性极为一致;
②山茱萸药用成分马钱素与熊果酸、齐墩果酸之间
相关不明显;③山茱萸可溶性固形物与马钱素之间
存在显著相关,r=02412,而与熊果酸、齐墩果酸
存在极显著负相关,r分别为 -05544,-05118,
这一结果与陈随清等分析的在山茱萸成熟过程中,
马钱素含量不断上升,而熊果酸含量不断下降一
致[6],果实成熟过程一般都伴随着可溶性固形物的
增加,有机酸含量的不断下降。也与测定结果一致;
④山茱萸出皮率与马钱素、熊果酸、齐墩果酸之间存
在明显的负相关,r分别为 -02406,-02507,-
02443,出皮率是重要的产量选种指标,所以考虑
产量与有效成分的双因子的选种难度较大;⑤山茱
萸纵径/横径与马钱素、熊果酸、齐墩果酸之间相关
不明显,r分别为00949,-00129,-00245,从
结果中可以看出,在以药用成分为主要指标的选种
体系中,果形指数非重要外形指标。
表2 有效成分间及有效成分与外形、营养指标之间的相关关系
项目 马钱素 熊果酸 齐墩果酸 纵径/横径 可溶性固形物 出皮率
马钱素  1 00369 00634 00949 024121) -024061)
熊果酸  00369 1 097962) -00129 -055442) -025071)
齐墩果酸 00634 097962) 1 -00245 -051182) -024431)
  注:1)n=78,α=005,r=02227,α=001,r=02900;2)n=77,α=005,r=02242,α=001,r=02919
4 结论与讨论
分析浙江山茱萸道地产区的山茱萸有效成分,
得出产区内山茱萸有效成分马钱素、熊果酸、齐墩果
酸平均质量分数分别为1330%,02373%,0057
2%,马钱素、熊果酸平均质量分数高于河南、陕西产
区的山茱萸,而齐墩果酸稍低于河南、陕西产区[7];
山茱萸有效成分存在很大变异,选择的3个有效成
分马钱素、熊果酸、齐墩果酸在同一个产区单株含量
最大值与最小值之间分别相差389,474,855倍,
RSD分别为 2850%,3433%,4048%,选种潜力
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第33卷第23期
2008年12月
         
    中 国 中 药 杂 志
ChinaJournalofChineseMateriaMedica
       
Vol.33,Issue 23
 December,2008
巨大。同时表明现阶段山茱萸生药在质量上存在很
大差异,急需开展进行以有效成分为主指标的选育
种工作,以保证以山茱萸为原料的中成药在质量上
一致;山茱萸果形指数与山茱萸有效成分间相关不
密切,不支持前人以果形指数为主要划分标准的类
型选种[7],今后进行以有效成分为主指标的选育种
应以单株选种为主;熊果酸与齐墩果酸相关极为显
著,以后选种中可合并为一个选种指标;果实可溶性
固形物与马钱素成显著正相关,与熊果酸、齐墩果酸
成极显著负相关,在进行以有效成分为主指标的选
育种时,可用可溶性固形物做初步筛选。
[参考文献]
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Studyoncorrelationbetweenefectiveingredientsof
DogwoodFruitfromgenuineproducingregionsandtraits
YUWeiwu,FUQinggong,DAIWenshen,LIZhangju
(ZhejiangProvincialKeyLabforModernSilviculturalTechnology,ZhejiangForestryUniversity,Lin'an311300,China)
[Abstract] Objective:Inordertoprovideatheoreticalfoundationforthemedicalyefectiveingredientbasedselectionofelite
cultivarsinCornusoficinalis,astudyhasbeenconductedonthevariationinmedicinalefectiveingredientsofthefruitfromthegenu
ineproducingareas,thecorelationamongefectivemedicinalingredientsandthecorelationbetweenefectiveingredientsandfruit
shapeaswelasnutritionalindexes.Method:ThecompletelymaturefruitwascolectedfromthegenuineproducingareasChunan
countyandLin'ancityofZhejiangprovince.Thecontentsofcolchicine,ursolicacidandoleanolicacidweredeterminedbyHPLC,and
verticaldiameter/transversaldiameterofthefruits,solublesolidmaterandpercentageoffreshfleshtothefruitwerealsomeasured.
Result:① Ursolicacid,oleanolicacid,andcolchicineinfruitsrangedfrom0.1010% to0.4786%,0.0149% to0.1274% and
0.59% to2.30%,respectively,andtheirRSDwere34.33%,40.48% and28.50%,respectively.② Thecorelationbetweenef
fectiveingredientsandthatbetweenefectiveingredientsandfruitshapeaswelasnutritionalindexeswereasfolows:thecontentofur
solicacidwassignificantlycorelatedwiththatofoleanolicacidwithacorelationcoeficientof0.9796;bothursolicacidandoleanolic
acidwereinsignificantlynegativecorelationwithsolublesolidmaterwithacorelationcoeficientof-0.5544and-0.5118,re
spectively;colchicinewassignificantlyassociatedwithsolublesolidmaterwithacorelationcoeficientof0.2412;colchicine,ursolic
acidandoleanolicacidwereinsignificantlynegativecorelationwiththepercentageoffreshfleshwithacorelationcoeficientof-0.
2507,-0.2443and-0.2406,respectively;threeefectiveingredientsshowednocorelationwiththeratioofverticaldiameterto
transversaldiameterofthefruit.Conclusion:Thereisasignificantdiferenceinefectiveingredientsamongindividualtrees,which
meansthatthereisabigpotentialforselectionofcultivars.Individualtreebasedselectionshouldbemainlyadoptedwhenefectivein
gredientsareusedasamainindexinselectiononthebasisofthecorelationamongefectiveingredientsandthatbetweenefectivein
gredientsandfruitshapeaswelasnutritionalindexes,whileursolicacidcouldbecombinedwitholeanolicacidtobeusedasanindex
andapreliminaryscreencouldbeconductedusingsolublesolidmater.
[Keywords] Cornusoficinalis;efectiveingredient;variation;corelationbetweentraits
[责任编辑 吕冬梅]
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