全 文 :山茱萸道地产区有效成分变异与性状相关研究
喻卫武,符庆功,戴文圣,黎章矩
(浙江林学院 浙江省现代森林培育技术重点实验室,浙江 临安311300)
[摘要] 目的:通过对道地产区山茱萸果实有效成分变异、有效成分间及有效成分与外形、营养指标之间的相
关研究,为山茱萸基于有效成分的良种选择提供理论基础。方法:采集山茱萸道地产区浙江省淳安县、临安市实生
单株完熟果实,运用HPLC测定单株果实的马钱素、熊果酸、齐墩果酸含量,同时测定山茱萸果实的纵径/横径、可
溶性固形物、出皮率等性状。结果:①道地产区内熊果酸、齐墩果酸、马钱素变异幅度分别为01010% ~0478
6%,00149%~01274%,059%~230%,RSD分别为3433%,4048%,2850%;②有效成分间及有效成分与
外形、营养指标之间的相关关系如下:熊果酸、齐墩果酸相关极显著,相关系数为09796;熊果酸、齐墩果酸与可溶
性固形物成极显著负相关,相关系数分别为-05544,-05118;马钱素与可溶性固形物成显著相关,相关系数为
02412;熊果酸、齐墩果酸、马钱素与出皮率成显著负相关,相关系数分别 -02507,-02443,-02406;3种有
效成分与纵径/横径相关不明显。结论:山茱萸单株间有效成分变异明显,选种潜力巨大;利用有效成分间及有效
成分与外形、营养指标之间的相关关系,进行以有效成分为指标的选育种时,应以单株选种为主,可将熊果酸与齐
墩果酸合并作为1个指标,并可用可溶性固形物做粗步筛选。
[关键词] 山茱萸;有效成分;变异;性状相关
[中图分类号]S567 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)23275105
[收稿日期] 20080124
[基金项目] 浙江省重中之重学科浙江林学院森林培育学科
开放基金(200511);浙江省教育厅项目(2451001066)
[通讯作者] 喻卫武,Tel:(0571)63743865,Email:yww888
@zjfc.edu.cn
中药现代化的源头是良种,只有在种源优良的
基础上建立规范化的栽培技术,才能保证生药品质
优良且稳定一致。山茱萸 Cornusoficinalis是山茱
萸科山茱萸属的一种传统珍贵中药材,临床用于内
热消渴、眩晕耳鸣、腰膝酸痛、阳痿遗精、大汗虚脱
等[1],为六味地黄丸等多个汉方的主要用药原料,
是25种用量最多的也是19个国家要求大力发展的
中药材之一[2]。山茱萸有效成分复杂,1995,2005
年版药典分别以熊果酸和马钱素作为山茱萸的质量
控制指标。
小样本试验也表明,同一区域山茱萸单株间在
熊果酸、马钱素等有效成分含量上也存在显著差
异[3]。因此在种源内有效成分变异研究基础上,建
立种质主要形态、营养指标与有效成分相关关系,可
形成以有效成分含量为主,兼顾果实特性和营养成
分的多性状综合选择指标体系,既可筛选、保存优良
单株,又能提高定向选育效率,对促进相关药用产业
的发展有积极意义。
本研究通过对山茱萸道地产区内单株果实药用
有效成分马钱素、熊果酸和齐墩果酸含量的分析,对
果实外形和营养指标的测定,确定了产区内药用有
效成分的变异范围,建立了有效成分间及有效成分
与外形、营养指标之间的相关关系,为进一步开展良
种选择提供了理论基础,收集和保存了部分有利用
潜力的种质。
1 样品采集区概况
试验样品全部采集自浙江省临安市、淳安县交
界的山茱萸集中分布区(北纬29°11′~30°02′,东经
118°20′~119°20′),该地年平均气温178℃。年极
端最低气温-151℃,年极端最高气温407℃,总
降水量14257mm,海拔550~800m,是传统上的
山茱萸道地产区。
2 材料与方法
2.1 仪器与试剂
WatersTM600二元泵(沃特斯公司),手动进样,
WatersTM486紫外检测器,HS2000液相色谱工作站
(英谱公司),Mili-Q超纯水装置。马钱素、熊果
酸、齐墩果酸对照品由上海君创生物科技有限公司
提供,含量不低于98%;水为超纯水;甲醇(天津四
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友公司)为色谱纯;其他试剂均为分析纯;流动相过
045μm滤膜。
2.2 采样方法
选择浙江山茱萸集中分布的几个乡镇,按成熟
时间、外形差异,采集不同类型实生山茱萸形态完全
成熟的果实,编号后冷冻保存。样品由浙江林学院
森林培育学科戴文圣教授鉴定。
2.3 果实可溶性固形物、纵径/横径、出皮率的测定
果实可溶性固形物:取20粒完熟果实果肉,充
分混合后取样用手持折光仪直接测量3组数据,取
平均值;纵径/横径:同一株样品取3组,每组20粒
果实,用游标卡尺测量每粒果实的纵径/横径,分别
记录结果后计算平均值,认可误差在3%以内的数
据,最后计算每个单株的纵径/横径;出皮率:称取
20g左右的果实,手工去核后称重(总重减核重作
为果肉重),以果肉重与总重比值为出皮率,双平行
试验,认可误差不超过3%的数值,计算平均出皮率
为单株出皮率。
2.4 马钱素含量测定
马钱素含量测定参照2005年版《中国药典》方
法[4]。
2.4.1 色谱条件 色谱柱 WatersSunfireC18(46
mm×250mm,5μm);流动相甲醇水(30∶70);检测
波长 231nm;柱温为室温 20℃;流速 08mL·
min-1。在此条件下,马钱素与其他组分均能达到良
好分离(分离度大于15,马钱素对照品与样品的保
留时间分别为15602,15523min,图1)。
A.马钱素对照品;B.供试样品;1.马钱素
图1 马钱素对照品及供试样品色谱图
2.4.2 对照品溶液与供试品溶液的配制 对照品
溶液配制:精密称取马钱素对照品48mg,置10mL
量瓶中,加 30%甲醇溶解定容,得到标准储备液。
供试品溶液配制:取山茱萸新鲜果实,去核,置烘箱
内60℃烘干48h,冷却后粉碎过筛(60目),精密称
量粉末05g,置锥形瓶中,加入30%的甲醇10mL,
超声震荡15min,置于50mL的量瓶中,重复4次,
用适量的30%甲醇清洗残渣,并入量瓶,稀释至刻
度,摇匀,作为供试品溶液。然后取上清液至离心管
中,12000r·min-1离心10min,取上清液过045
μm微孔滤膜后进样。
2.4.3 线性关系考察 取马钱素对照品溶液,分别
进样2,4,6,8,10μL,以对照品质量(μg)为横坐标,
峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,计算回归方程为
Y=1184×109X+1677×105,r=09995,表明马
钱素在096~48μg进样量与峰面积线性关系良
好。
2.4.4 精密度、稳定性、重复性、加样回收率试验
精密吸取上述对照品溶液10μL,连续进样5次,按
马钱素峰面积进行计算得峰面积的 RSD097%。
分别于0,1,2,4,8,12h精密吸取供试品溶液20μL
进样,按马钱素峰面积进行计算得 RSD13%。取
同一样品,5次重复制备测试,按马钱素峰面积进行
计算得峰面积的 RSD147%。精密称取马钱素对
照品20mg,加入精密称量的05g山茱萸样品粉
末中,按马钱素供试品溶液的配制方法制备样品溶
液,进样20μL,重复3次,计算平均加样回收率为
1018%。
2.5 熊果酸、齐墩果酸的含量测定
测定方法参考文献[5]。
2.5.1 色谱条件 色谱柱 WatersSunfireC18柱
(46mm×250mm,5μm),流动相甲醇04%磷酸
(85∶15),检测波长210nm,流速1mL·min-1,室温
20℃;在此条件下,熊果酸、齐墩果酸与其他组分均
能达到良好分离(分离度大于15,齐墩果酸、熊果
酸保留时间分别为25898,27632min,图2)。
2.5.2 对照品溶液与供试品溶液的配制 对照品
溶液的配制:分别精密称取齐墩果酸对照品、熊果酸
对照品48,49mg,充分溶解后用甲醇定容至 5
mL,即得到标准储备液。供试品溶液的配制:精密
称取山茱萸粉末 1g,加氯仿 50mL超声处理 30
min,取出,过滤,再加10mL氯仿洗涤残液,滤液回
收至干,10mL石油醚(30~60℃)脱脂约2min,倾
去石油醚,重复1次后残渣用甲醇溶解,定容至5mL,
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A.齐墩果酸对照品;B.熊果酸对照品;C.供试样品;
1.齐墩果酸;2.熊果酸
图2 齐墩果酸、熊果酸对照品及供试样品色谱图
用045μm微孔滤膜过滤后进样,进样量为20μL。
2.5.3 线性关系考察 取齐墩果酸和熊果酸对照
品溶液,分别进样 2,4,6,8,10μL,以对照品质量
(μg)为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,计
算熊果酸对照品回归方程为 Y=5215×108X-
2336×104,相关系数为09997,齐墩果酸对照品
回归方程为 Y=6156×109X+6952×104,r=
09997,表明熊果酸在196~98μg进样量与峰面
积线性关系良好、齐墩果酸在192~96μg进样量
与峰面积线性关系良好。
2.5.4 精密度、稳定性、重复性、加样回收率试验
分别精密吸取熊果酸、齐墩果酸对照品溶液10μL,
连续进样5次,按熊果酸、齐墩果酸峰面积进行计算
得峰面积的RSD分别为124%,145%。精密量取
供试品溶液20μL,分别于0,1,2,4,8,12h时进样,
分别按熊果酸和齐墩果酸峰面积进行计算得峰面积
的RSD分别为12%,094%。取同一样品,5次重
复制备测试,按齐墩果酸、熊果酸峰面积计算得齐墩
果酸、熊果酸峰面积的RSD分别为307%,262%。
取已知含量的各样品10g左右,精密加入20mg
齐墩果酸和熊果酸对照品,重复3次,测定平均加样
回收率分别为973%,987%。
3 结果与分析
3.1 各指标测定结果
有效成分质量分数、外形、可溶性固形物、出皮
率测定结果见表1。
表1 有效成分质量分数、外形、可溶性固形物、出皮率测定
No.
熊果酸
/%
齐墩果酸
/%
马钱素
/%
纵径
/横径
可溶性固
形物/%
出皮率
/%
1 02313 00578 1453 139 966 7700
2 03829 01001 1197 164 867 7569
3 01809 00444 0769 150 966 8274
4 04786 01217 0757 151 800 7817
5 02881 00686 1714 155 1000 7498
6 01747 00395 1389 126 1133 8033
7 04591 01040 1394 153 933 7450
8 03237 00793 0918 157 967 8116
9 02411 00639 1037 138 933 8011
10 03664 00900 1619 158 1067 7439
11 02758 00677 0704 177 900 7779
12 02543 00572 1255 206 1067 8093
13 03261 00836 1703 143 633 7773
14 03250 00733 1307 177 1100 7369
15 02130 00498 1125 143 967 7763
16 04771 01305 0709 138 1000 7315
17 03015 00657 1333 150 1167 7752
18 02709 00641 1141 162 1033 6989
19 02183 00483 1559 156 1067 7455
20 02483 00591 1880 167 1133 7326
21 02586 00621 1838 148 1233 7192
22 02631 00680 1133 134 1267 7623
23 02399 00587 1004 171 1200 8176
24 01520 00334 0888 145 1167 7643
25 01749 00325 1507 154 1100 7254
26 02185 00517 1134 157 1100 7860
27 02312 00543 1547 159 1267 7734
28 01885 00375 1207 168 833 7512
29 02777 00697 0923 149 1033 7800
30 02791 00722 1389 157 1000 7067
31 02764 00705 1560 158 1033 7575
32 02452 00589 1146 152 1100 7415
33 01612 00306 1128 170 1167 8180
34 02060 00513 0683 157 1200 7910
35 02195 00572 1604 172 1100 6987
36 01890 00431 1779 144 1133 7586
37 02472 00607 1022 168 1233 7024
38 01949 00482 1383 153 1167 7607
39 03329 00849 1167 158 1000 7371
40 01858 00407 0810 164 1000 7995
41 03367 00838 1178 181 933 7912
42 02019 00425 1500 138 1300 7853
43 02477 00606 1263 173 1200 7831
44 03592 01002 1467 167 833 7944
45 03165 00825 1209 160 967 7769
46 01477 00317 1204 143 1233 8066
47 02479 00572 1362 152 1200 6716
48 03204 00816 0919 143 1167 7961
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续表1
No.
熊果酸
/%
齐墩果酸
/%
马钱素
/%
纵径
/横径
可溶性固
形物/%
出皮率
/%
49 02915 00779 1531 150 1233 7884
50 01998 00444 2160 148 1300 7401
55 01890 00400 0998 169 1200 8349
56 03375 00880 1555 155 1267 7603
57 01635 00247 1749 161 1200 7866
58 02676 00621 1564 153 1333 7771
59 02845 00763 1678 150 1167 7421
60 02166 00525 1276 153 1300 8031
61 02430 00668 1783 183 1267 7684
62 01531 00323 0800 171 1100 8094
63 02570 00557 1072 152 1100 8094
64 01784 00468 1866 167 1267 7894
65 01841 00444 1255 145 1500 7636
66 01095 00229 2081 154 1767 7888
67 01213 00296 1132 151 1300 7924
68 01213 00213 0878 144 1333 8062
69 02015 00456 1183 149 1333 7420
70 01645 00365 1108 157 1200 7628
71 01448 00290 1550 151 1400 7628
72 01486 00360 1474 181 1800 7476
73 01013 00149 0592 175 1433 8050
74 01415 00403 1236 133 1633 8026
75 01010 00158 0770 161 1200 7401
76 01560 00354 1692 189 1467 7845
77 01747 00422 1326 169 1467 7761
78 01643 00309 0958 - - -
注:78号样品量过少,纵径/横径、可溶性固形物、出皮率未测定
3.2 有效成分分布与变异
从表1中数据可以得出,山茱萸道地产区单株
间有效成分含量存在差异,变异明显。①马钱素变
异幅度为0592% ~2303%,RSD2850%,平均质
量分数为 1330%,单株最大含量为最小含量的
389倍,含量集中分布在 070% ~170%的有 64
株,占总测定数的 821%;②熊果酸变异幅度为
01010% ~04786%,RSD3433%,平均质量
分数为 02373%,单株最大含量为最小含量的
474倍,含量集中分布在015%~035%有63株,
占总株数的808%;③齐墩果酸变异幅度为0014
9% ~01274%,RSD4048%,平均质量分数为
00572%,单株最大含量为最小含量的855倍,含
量集中分布在 0025% ~0085%有 66株,占总测
定数的846%。
3.3 有效成分间及有效成分与外形、营养指标之间
的相关关系
运用DPS数据分析软件对表1数据处理,得出
有效成分间及有效成分与外形、营养指标间相关关
系(表2),可以得出:①山茱萸有效成分熊果酸与齐
墩果酸之间存在极显著相关,r=09796,熊果酸与
齐墩果酸都为有机酸,而且是一对同分异构体,在形
成机制上可能较为一致,因此两者相关性极为一致;
②山茱萸药用成分马钱素与熊果酸、齐墩果酸之间
相关不明显;③山茱萸可溶性固形物与马钱素之间
存在显著相关,r=02412,而与熊果酸、齐墩果酸
存在极显著负相关,r分别为 -05544,-05118,
这一结果与陈随清等分析的在山茱萸成熟过程中,
马钱素含量不断上升,而熊果酸含量不断下降一
致[6],果实成熟过程一般都伴随着可溶性固形物的
增加,有机酸含量的不断下降。也与测定结果一致;
④山茱萸出皮率与马钱素、熊果酸、齐墩果酸之间存
在明显的负相关,r分别为 -02406,-02507,-
02443,出皮率是重要的产量选种指标,所以考虑
产量与有效成分的双因子的选种难度较大;⑤山茱
萸纵径/横径与马钱素、熊果酸、齐墩果酸之间相关
不明显,r分别为00949,-00129,-00245,从
结果中可以看出,在以药用成分为主要指标的选种
体系中,果形指数非重要外形指标。
表2 有效成分间及有效成分与外形、营养指标之间的相关关系
项目 马钱素 熊果酸 齐墩果酸 纵径/横径 可溶性固形物 出皮率
马钱素 1 00369 00634 00949 024121) -024061)
熊果酸 00369 1 097962) -00129 -055442) -025071)
齐墩果酸 00634 097962) 1 -00245 -051182) -024431)
注:1)n=78,α=005,r=02227,α=001,r=02900;2)n=77,α=005,r=02242,α=001,r=02919
4 结论与讨论
分析浙江山茱萸道地产区的山茱萸有效成分,
得出产区内山茱萸有效成分马钱素、熊果酸、齐墩果
酸平均质量分数分别为1330%,02373%,0057
2%,马钱素、熊果酸平均质量分数高于河南、陕西产
区的山茱萸,而齐墩果酸稍低于河南、陕西产区[7];
山茱萸有效成分存在很大变异,选择的3个有效成
分马钱素、熊果酸、齐墩果酸在同一个产区单株含量
最大值与最小值之间分别相差389,474,855倍,
RSD分别为 2850%,3433%,4048%,选种潜力
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巨大。同时表明现阶段山茱萸生药在质量上存在很
大差异,急需开展进行以有效成分为主指标的选育
种工作,以保证以山茱萸为原料的中成药在质量上
一致;山茱萸果形指数与山茱萸有效成分间相关不
密切,不支持前人以果形指数为主要划分标准的类
型选种[7],今后进行以有效成分为主指标的选育种
应以单株选种为主;熊果酸与齐墩果酸相关极为显
著,以后选种中可合并为一个选种指标;果实可溶性
固形物与马钱素成显著正相关,与熊果酸、齐墩果酸
成极显著负相关,在进行以有效成分为主指标的选
育种时,可用可溶性固形物做初步筛选。
[参考文献]
[1] 黎章矩,钱莲芳,李泽民,等.山茱萸的药用、营养价值和开发
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Studyoncorrelationbetweenefectiveingredientsof
DogwoodFruitfromgenuineproducingregionsandtraits
YUWeiwu,FUQinggong,DAIWenshen,LIZhangju
(ZhejiangProvincialKeyLabforModernSilviculturalTechnology,ZhejiangForestryUniversity,Lin'an311300,China)
[Abstract] Objective:Inordertoprovideatheoreticalfoundationforthemedicalyefectiveingredientbasedselectionofelite
cultivarsinCornusoficinalis,astudyhasbeenconductedonthevariationinmedicinalefectiveingredientsofthefruitfromthegenu
ineproducingareas,thecorelationamongefectivemedicinalingredientsandthecorelationbetweenefectiveingredientsandfruit
shapeaswelasnutritionalindexes.Method:ThecompletelymaturefruitwascolectedfromthegenuineproducingareasChunan
countyandLin'ancityofZhejiangprovince.Thecontentsofcolchicine,ursolicacidandoleanolicacidweredeterminedbyHPLC,and
verticaldiameter/transversaldiameterofthefruits,solublesolidmaterandpercentageoffreshfleshtothefruitwerealsomeasured.
Result:① Ursolicacid,oleanolicacid,andcolchicineinfruitsrangedfrom0.1010% to0.4786%,0.0149% to0.1274% and
0.59% to2.30%,respectively,andtheirRSDwere34.33%,40.48% and28.50%,respectively.② Thecorelationbetweenef
fectiveingredientsandthatbetweenefectiveingredientsandfruitshapeaswelasnutritionalindexeswereasfolows:thecontentofur
solicacidwassignificantlycorelatedwiththatofoleanolicacidwithacorelationcoeficientof0.9796;bothursolicacidandoleanolic
acidwereinsignificantlynegativecorelationwithsolublesolidmaterwithacorelationcoeficientof-0.5544and-0.5118,re
spectively;colchicinewassignificantlyassociatedwithsolublesolidmaterwithacorelationcoeficientof0.2412;colchicine,ursolic
acidandoleanolicacidwereinsignificantlynegativecorelationwiththepercentageoffreshfleshwithacorelationcoeficientof-0.
2507,-0.2443and-0.2406,respectively;threeefectiveingredientsshowednocorelationwiththeratioofverticaldiameterto
transversaldiameterofthefruit.Conclusion:Thereisasignificantdiferenceinefectiveingredientsamongindividualtrees,which
meansthatthereisabigpotentialforselectionofcultivars.Individualtreebasedselectionshouldbemainlyadoptedwhenefectivein
gredientsareusedasamainindexinselectiononthebasisofthecorelationamongefectiveingredientsandthatbetweenefectivein
gredientsandfruitshapeaswelasnutritionalindexes,whileursolicacidcouldbecombinedwitholeanolicacidtobeusedasanindex
andapreliminaryscreencouldbeconductedusingsolublesolidmater.
[Keywords] Cornusoficinalis;efectiveingredient;variation;corelationbetweentraits
[责任编辑 吕冬梅]
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第33卷第23期
2008年12月
中 国 中 药 杂 志
ChinaJournalofChineseMateriaMedica
Vol.33,Issue 23
December,2008