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Studies on anti-hyperglycemic effect and its mechanism of Clinopodium chinense

风轮菜乙醇提取物的降血糖作用及其机制研究



全 文 :风轮菜乙醇提取物的降血糖作用及其机制研究
田冬娜,吴斐华,马世超,黎 丹,戴 岳
(中国药科大学 中药药理教研室,江苏 南京 210038)
[摘要] 目的:研究风轮菜醇提物(EJCT)的降血糖作用及其机制。方法:观察EJCT150,300,600mg·kg-1对
正常小鼠空腹血糖(FSG)的影响;对肾上腺素性高血糖小鼠血糖及肝糖原、四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖及胰岛损伤
程度的影响。观察EJCT对Fe2+/Cys激发的小鼠肝匀浆过氧化产物丙二醛(MDA)的影响。结果:EJCT对正常小
鼠血糖无明显影响。但是,EJCT300,600mg·kg-1可显著降低肾上腺素所致的小鼠血糖升高,并使低下的肝糖原
回升。EJCT150,300,600mg·kg-1明显降低四氧嘧啶糖尿病小鼠的血糖及减轻四氧嘧啶对胰岛细胞的损伤。另
外,EJCT30,60,90,120mg·L-1能明显降低Fe2+/Cys激发的小鼠肝匀浆中MDA的含量。结论:EJCT具有显著的
降血糖作用,其作用机制可能与增加肝糖原合成、减少肝糖原分解、提高机体抗脂质过氧化能力,从而减轻胰岛细
胞的损伤有关。
[关键词] 风轮菜;降血糖;糖原;四氧嘧啶;丙二醛
[中图分类号]R285.5 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)11131304
[收稿日期] 20070810
[通讯作者] 吴斐华,(025)85322009,Email:fhwu2000@ya
hoo.com.cn
  糖尿病(diabetesmelitus,DM)及其并发症是威
胁人类健康的主要疾病之一,死亡率在各种疾病中
居第3位,而在糖尿病引起的死亡中,糖尿病并发症
引起的病人死亡占70%以上[1]。唇形科风轮菜属
植物主要的化学成分为黄酮类、皂苷类、有机酸类、
芳香族类、三萜类、甾体类等。目前的研究发现风轮
菜属植物主要的药理作用为止血、抗菌、抗炎及免疫
作用、抗辐射、抗肿瘤等[2]。唇形科风轮菜属植物
风轮菜在福建民间用于治疗糖尿病。因此本研究进
行了风轮菜降血糖及其机制的研究。
1 材料
1.1 药材与试剂
风轮菜全草采集于福建省莆田县芦镇,经中国
药科大学中药资源学研究室秦民坚教授鉴定为 Cli
nopodiumchinense(Benth.)O.Kuntze。风轮菜全草
的80%乙醇提取物(EJCT,中国药科大学中药药理教
研室提供,得率18%);格列齐特(南京瑞尔医药有限
公司生产,批号050602);盐酸二甲双胍片(昆山双鹤
药业有限责任公司,批号0604193);盐酸肾上腺素注
射液(武汉远大制药集团股份有限公司,批号
20050527);四甲氧基丙烷、四氧嘧啶(aloxan)(Sigma
公司;葡萄糖试剂盒(南京建成生物工程研究所,批号
20060310);糖原试剂盒(南京建成生物工程研究所,
批号20061031);考马斯亮蓝(南京建成生物工程研
究所,批号20070405)。其他试剂均为市售分析纯。
1.2 仪器
BS110S电子天平,北京赛多利斯天平有限公
司;酶标仪MultiskanSpectrumMSS1500-320,Ther
moElectronCorporation;低温离心机,型号1-15K,
SigmaCorporation;冷冻离心机,型号KUBOTA5800,
KubotaCoporation。
1.3 动物
雄性ICR小鼠,体重18~22g,由南京江宁青龙
山动物繁殖场提供,动物合格证号 SCXK(苏)2002
0018。动物分笼饲养,保持昼夜节律,室温(22±2)
℃中,自由摄食和饮水。
2 方法
2.1 EJCT对正常小鼠血糖的影响
取雄性小鼠50只,随机分为5组,其中4组分
别按10mL·kg-1体重灌胃给予EJCT150,300,600
mg·kg-1和格列齐特50mg·kg-1,正常组给予等
体积05%CMCNa。EJCT用 05%CMCNa配制,
格列齐特的溶媒为水。每天灌胃给药1次,连续给
药5d。末次给药时,每组禁食35h后给药,再禁
食15h后眼眶取血,分离血清测定血糖。
2.2 EJCT对肾上腺素性高血糖小鼠血糖及肝糖原
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的影响[3]
取雄性小鼠 60只,随机分为 6组,分别按 10
mL·kg-1体重给药组灌胃给予 EJCT150,300,600
mg·kg-1和二甲双胍200mg·kg-1,正常组和模型
组给予等体积的 05%CMCNa。EJCT用 05%
CMCNa配制,二甲双胍的溶媒为水。每天给药 1
次,连续给药5d。末次给药时,每组禁食5h后给
药,再禁食1h后按02mg·kg-1腹腔注射肾上腺
素,注射后05h摘眼球取血、取肝脏,测定空腹血
糖及肝糖原。
2.3 EJCT对四氧嘧啶糖尿病小鼠的影响
取雄性小鼠若干(约90只),随机取出小鼠10
只作为正常组,其余小鼠禁食14~17h后,尾静脉
注射四氧嘧啶65mg·kg-1,注射后72h眼眶后静
脉丛取血,分离血清,预测血糖,选空腹血糖>1112
mmol·L-1的小鼠50只,随机分为5组,每组10只。
各组禁食3h后,分别按10mL·kg-1体重灌胃给予
EJCT150,300,600mg·kg-1和格列齐特 50mg·
kg-1,正常组和模型组给予等体积的 05%CMC
Na。EJCT用05%CMCNa配制,格列齐特的溶媒
为水。每日给药1次,连续12d。分别于第6,12天
末次给药后15h(禁食5h),小鼠眼眶后静脉丛取
血,分离血清,以葡萄糖氧化酶法测定空腹血糖。第
12天取血后,分离小鼠胰腺,将胰腺浸泡在10%福
尔马林中固定、石蜡包埋,制片,HE染色,作组织病
理学检查[4]。
2.4 EJCT对 Fe2+/Cys激发的小鼠肝匀浆过氧化
作用的影响
雄性小鼠断头放血处死后,迅速取出肝脏,置4
℃生理盐水中洗净其表面,滤纸吸干水分,用4℃生
理盐水在冰浴条件下制成质量分数为 5%的肝匀
浆。5%肝匀浆09mL,加入01mL的药物(终浓
度分别为10,30,60,90,120mg·L-1)和维生素 E
(终浓度为40mg·L-1),模型组和正常组加蒸馏水
01mL。随后分别加001mol·L-1半胱氨酸溶液
10μL,1μmol·L-1FeSO4溶液20μL,正常组加蒸
馏水30μL,混匀后置37℃水浴温孵1h,冰浴,终
止反应。然后加入20%三氯乙酸1mL,067%硫代
巴比妥酸1mL,混匀后沸水浴15min,以2000r·
min-1离心20min,取上清液在532nm处测定吸光
度,并用考马斯亮蓝法测定05%肝匀浆的蛋白含
量,根据四甲氧基丙烷的标准曲线,计算反应终产物
中MDA含量(nmol·mg-1)[5,6]。
脂质过氧化抑制率(%)=(模型组 MDA含量 -样品组
MDA含量)/(模型组 MDA含量 -正常组 MDA含量)×
100%
2.5 统计学处理
实验结果采用 SPSS115进行统计分析,数据
以 珋x±s表示,并用t检验表示组间差异。
3 结果
3.1 EJCT对正常小鼠血糖的影响
EJCT150,300,600mg·kg-1组对正常小鼠空
腹血糖水平有降低趋势,而格列齐特50mg·kg-1
组明显地降低正常小鼠的空腹血糖(P<005)。见
表1。
表1 风轮菜醇提物对正常小鼠空腹血糖的影响
(珋x±s,n=10)
组别 剂量/mg·kg-1 血糖/mmol·L-1
正常 - 750±097
EJCT 150 638±062
  300 632±084
  600 621±061
格列齐特 50 584±0911)
  注:与正常组比1)P<005
3.2 EJCT对肾上腺素性高血糖小鼠血糖及肝糖原
的影响
与正常组相比,模型组小鼠血糖明显升高(P<
001)、肝糖原含量显著降低(P<001)。与模型组
小鼠比较,EJCT600mg·kg-1组和二甲双胍200mg
·kg-1组小鼠血糖均极显著降低(P<001)、肝糖
原含量极明显升高(P<001)。EJCT300mg·
kg-1可显著降低小鼠血糖(P<005),显著增加小
鼠肝糖原含量(P<005)。EJCT150mg·kg-1组
小鼠血糖有下降趋势,肝糖原含量有升高趋势。见
表2。
表2 风轮菜醇提物对肾上腺素性高血糖小鼠空腹血糖
及肝糖原含量的影响(珋x±s,n=10)
组别
剂量
/mg·kg-1
血糖
/mmol·L-1
肝糖原
/mg·g-1
正常 - 544±150 618±184
模型 - 953±1793) 382±1513)
EJCT 150 903±103 492±183
  300 732±1761) 579±1601)
  600 689±1602) 657±1822)
二甲双胍 200 576±1012) 717±1672)
  注:与模型组比1)P<005,2)P<001;与正常组比3)P<001
3.3 EJCT对四氧嘧啶糖尿病小鼠的影响
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3.3.1 对四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖的影响 与正
常组比较,模型组小鼠血糖极显著升高(P<001)。
与模型组比较,阳性药格列齐特50mg·kg-1组在
第6天可极显著降低小鼠血糖(P<001),可显著
地降低第 12天小鼠的血糖(P<005)。而 EJCT
150mg·kg-1组可明显对抗第6,12天小鼠的血糖
(P<005)。EJCT300mg·kg-1组在第6天可极显
著降低小鼠血糖(P<001),可显著地降低第12天
小鼠的血糖(P<005)。而 EJCT600mg·kg-1组
可极明显对抗第 6,12天小鼠的血糖(P<001)。
见表3。
表3 风轮菜醇提物对四氧嘧啶糖尿病小鼠空腹血糖
的影响(珋x±s)
组别
剂量
/mg·kg-1

血糖/mmol·L-1
第6天4) 第12天
正常 - 10 689±077 649±087
模型 - 8 2604±6163) 2457±8143)
EJCT 150 8 1701±10321) 1590±5071)
  300 9 1781±8222) 1649±8441)
  600 8 1055±7642) 1018±3732)
格列齐特 50 8 1313±8462) 1674±3711)
  注:与模型组比1)P<005,2)P<001;与正常组比3)P<
001;4)第6天时各组n=10
3.3.2 对四氧嘧啶糖尿病小鼠胰岛细胞的保护作
用 本研究结果显示,正常组胰岛分布于腺泡之间,
染色细胞着色浅、排列呈团索状,四氧嘧啶糖尿病小
鼠胰岛数量较正常减少,体积缩小,胰岛内细胞数量
明显减少。EJCT150,300,600mg·kg-1和格列齐
特50mg·kg-1组的胰岛数量增多、体积增大,每个
胰岛内细胞数量明显增加,提示药物能改善四氧嘧
啶所致的胰岛病变。见图1。
3.4 EJCT对 Fe2+/Cys激发的小鼠肝匀浆过氧化
作用的影响
与正常组相比,FeSO4/Cys模型组 MDA含量极
明显高于对照组(P<001),表明·OH诱导肝细胞
MDA生成增多,脂质过氧化反应加剧。与模型组相
比,EJCT30,60,90,120mg·L-1组的 MDA含量均
极明显降低(P<001),表明 EJCT对·OH诱导小
鼠肝细胞 MDA生成具有抑制作用,并且具有浓度
依赖性。见表4。
4 讨论
机体维持一定的血糖水平,是通过血中葡萄糖
的利用与转化、贮存之间的动态平衡来实现的。控
  
图1 各组小鼠胰腺细胞改变(HE,×200)
A.正常组;B.模型组;C.EJCT150mg·kg-1组;
D.EJCT300mg·kg-1组;E.EJCT600mg·kg-1组;
F.格列齐特50mg·kg-1组
表4 风轮菜醇提物对Fe2+/Cys激发的小鼠
肝匀浆中MDA含量的影响(珋x±s,n=6)
组别
剂量
/mg·L-1
MDA
/nmol·mg-1
抑制率
/%
正常 - 0224±0014
模型 - 1017±00572) -
EJCT 10 1002±0081 18
  30 0836±00401) 228
  60 0736±00551) 354
  90 0550±00361) 589
  120 0374±00281) 784
维生素E 40 0287±00111) 920
  注:与模型组比1)P<001;与正常组比2)P<001
制血糖的生成与代谢,除胰岛素等调节机体碳水化
合物的代谢以维持血糖外,肝脏糖原的分解与合成
也是血糖含量的一个重要调节点。因此,本实验选
择正常动物、四氧嘧啶糖尿病模型小鼠及肾上腺素
模型小鼠作为切入点,观察分析风轮菜醇提物降糖
作用的可能途径。实验结果表明,EJCT对正常动物
血糖水平未见明显作用,揭示其没有明显的刺激胰
岛素释放作用或胰岛素样作用。肾上腺素通过兴奋
α受体,引发胰岛α细胞分泌胰高血糖素,同时促进
肝糖原分解,升高血糖,出现糖代谢紊乱[7,8]。EJCT
可显著降低肾上腺素糖尿病小鼠血糖,并显著升高
肝脏糖原含量。四氧嘧啶是胰岛 β细胞毒素,通过
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产生超氧自由基而破坏 β细胞,使细胞内 DNA损
伤,mRNA功能受损,β细胞合成前胰岛素减少,导
致胰岛素缺乏,使机体血糖升高。EJCT150,300,
600mg·kg-1可显著降低四氧嘧啶糖尿病小鼠血
糖,组织病理学检查结果表明,EJCT可明显提高四
氧嘧啶糖尿病小鼠胰岛数目和胰岛内的细胞数,对
受损的胰岛细胞具有修复作用。
糖尿病的发生、发展与自由基的关系亦为近年
来关注的热点,糖尿病患者体内既有自由基生成增
多,又有自由基清除障碍。MDA可直接反映体内自
由基多少、脂质过氧化的程度并间接反映细胞损伤
的程度[9]。本研究发现,EJCT可以显著降低 Fe2+/
Cys激发的小鼠肝匀浆脂质过氧化产物 MDA的含
量。
综上所述,风轮菜醇提物可以降低四氧嘧啶糖
尿病小鼠的血糖、减轻四氧嘧啶对胰岛细胞的损伤,
也可以显著降低肾上腺素性糖尿病小鼠血糖、升高
肝脏糖原含量,并且显著降低Fe2+/Cys激发的小鼠
肝匀浆脂质过氧化产物 MDA含量。本研究提示风
轮菜醇提物可用于治疗糖尿病,其作用机制可能与
增加肝糖原合成、减少肝糖原分解、提高机体抗脂质
过氧化能力,从而减轻胰岛细胞的损伤有关。
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Studiesonantihyperglycemicefectanditsmechanism
ofClinopodiumchinense
TIANDongna,WUFeihua,MAShichao,LIDan,DAIYue
(DepartmentofPharmacologyforChineseMateriaMedica,ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing210038,China)
[Abstract] Objective:ToinvestigatetheantihyperglycemicefectanditsmechanismofethanolextractionfromCalamintha
chinensis(EJCT).Method:Fastingserumglucose(FSG)innormalmicewasdeterminedafteroraladministrationofEJCT.Efectsof
EJCTonhyperglycemiamiceinducedbyadrenalinewereinvestigatedbyobservingthecontentsofFSGandliverglucogen.Efectof
EJCTonthediabeticmiceinducedbyaloxanwasinvestigatedbyobservingthecontentsofFSGandtheinjureddegreeofpancreaticis
let.TheantilipidperoxidationofEJCTonliverhomogenatewasmeasuredbydeterminationofmalondiadehyde(MDA)inducedby
Fe2+/Cys.Result:EJCTshowednoobviousefectonFSGinnormalmice.However,EJCT300,600mg·kg-1couldremarkablyde
creasethecontentsofFSGandincreaseliverglucogeninhyperglycemiamiceinducedbyadrenaline.Indiabeticmiceinducedbyalox
an,EJCT150,300,600mg·kg-1couldremarkablydecreasethecontentsofFSG.Thedamageofpancreaticisletinducedbyaloxan
wasalsosignificantlyatenuatedbyEJCT.Furthermore,EJCT30,60,90,120mg·L-1inhibitedlipidperoxidationinitiatedby
Fe2+/Cysinliverhomogenate.Conclusion:TheseresultssuggestthatEJCTcansignificantlyatenuatehyperglycemiaindiabetic
mice,whichisprobablyduetodecreasingthedecompositionofliverglucogen,increasingthesynthesisofliverglucogen,antioxidation
andameliorationofdamagedpancreaticislet.
[Keywords] Clinopodiumchinense;hypoglycemicefect;glycogen;aloxan;malondiadehyde
[责任编辑 古云侠]
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