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Effect of Gualou Xiebai (GLXB) decoction on platelet derived growth
factor BB (PDGF BB) expression in lungs from bleomycin A5 induced
pulmonary fibrosis in rats

瓜蒌薤白汤对平阳霉素所致大鼠肺纤维化肺组织中细胞因子PDGF BB表达的影响



全 文 :mg·kg-1,thevaluesofdistributionhalflife(t1/2α)were4582,5097,4727min,respectively.Andthevaluesofelimination
halflife(t1/2β)were23945,26508and25396min,respectively.Thevolumeofdistributionfromthesethreediferentdoseswere
0036,0035,0035L,respectively.TheAUC0→t(areaundertheconcentrationtimecurve)increasewasproportionaltotheadmin
istrateddose.Conclusion:Intherangeofthedosesexamined,thepharmacokineticsofhelicidinratsisbasedonlineardynamics.
[Keywords] helicid;RPHPLC;pharmacokinetics
[责任编辑 古云侠]
[收稿日期] 20080403
[基金项目] 河南省教育厅自然科学基金项目(2003360193)
[通讯作者] 李瑞琴,Tel:(0371)65934070,Email:lrqin_5@
yahoo.com.cn
[作者简介] 李瑞琴,副教授,河南中医学院基础医学院。研
究方向:中西医结合防治肺纤维化
瓜蒌薤白汤对平阳霉素所致大鼠肺纤维化肺组织中
细胞因子 PDGFBB表达的影响
李瑞琴1,肖 红2,张 瑞1,李 伟1,宋建平1
(1.河南中医学院,河南 郑州 450008;
2.河南职工医学院,河南 郑州 450008)
[摘要] 目的:探讨瓜蒌薤白汤防治肺纤维化的作用机制。方法:大鼠随机分为正常组,模型组,瓜蒌薤白汤
组,阳性药氢化可的松组。用平阳霉素(3mg·kg-1)复制大鼠肺纤维化模型后,用药组每天灌胃瓜蒌薤白汤002
mL·kg-1,氢化可的松组腹腔注射5mg·kg-1。用药28d后处死,观察、比较各组大鼠肺组织中血小板源生长因
子BB(PDGFBB)的表达。结果:模型组大鼠肺组织中PDGFBB表达均明显高于正常组及用药组(P<005)。结
论:瓜蒌薤白汤能明显抑制肺组织中PDGFBB过度表达。
[关键词] 肺纤维化;血小板源生长因子BB;瓜蒌薤白汤
[中图分类号]R285.5 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)22266605
  肺间质纤维化(肺纤维化)是多种间质性肺疾
病的转归,其发病率逐年上升,预后不良。近年越来
越多的学者认为细胞因子在间质性肺疾病的发生、
发展中起着重要作用,由肺泡巨噬细胞等炎症细胞
及肺泡上皮细胞等肺结构细胞释放的多种细胞因子
如:血小板源生长因子(PDGF)、转化生长因子
(TGFβ)、肿瘤坏死因子(TNFα)、白细胞介素1
(IL1)、胰岛素生长因子1(IGF1)等与肺纤维化关
系密切[12]。
肺间质纤维化目前尚无治疗良策。笔者曾观察
到金匮肾气丸能明显减轻平阳霉素所致的大鼠肺泡
炎及纤维化程度[34]。本实验进一步观察瓜蒌薤白
汤对平阳霉素所致的大鼠肺纤维化程度及肺组织中
血小板源生长因子 BB(PDGFBB)表达的影响,以
探讨其防治肺纤维化的作用机制。
1 材料
1.1 动物
普通级健康SD雌性大鼠,体重180~210g,由
河南省动物实验中心提供,饲养于河南省中医药研
究院动物观察室,室温(22±2)℃,相对湿度60%,
常规饲料喂养,饮水量不限。合格证号410117。
1.2 主要药物、试剂
平阳霉素,天津太河制药有限公司,批号
PBW020501,使用时用生理盐水配制成3g·L-1;瓜
蒌薤白汤:全瓜蒌、薤白(比例为2∶1),药材均购自
河南中医学院第三附属医院,经鉴定为正品药材,加
水8倍水煎、过滤、浓缩为含生药135g·mL-1药
液备用;氢化可的松针剂:南阳普康制药有限公司,
批号020820,按 5mg·kg-1体重进行给药。兔抗
人、鼠 PDGFB多克隆抗体,批号 BA0519;即用型
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SABC免疫组化试剂盒,批号 SA1022。DAB显色试
剂盒,批号ED1022。以上试剂盒均为武汉博士德生
物工程有限公司产品。
1.3 仪器
PM-10AD光学显微镜 OlympusOpticalCo.
LTD,日本。HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文
分析系统,同济医科大学千屏影像工程公司。
2 方法
2.1 动物分组
将动物按随机数字表法随机分为正常组、模型
组、瓜蒌薤白汤组、阳性药氢化可的松组,除正常组
动物为10只外,其余各组动物均为12只。
2.2 动物造模与用药
正常组正常饲养不作任何处理;模型组及各用
药组大鼠按文献方法造模[5],以氯胺酮腹腔麻醉大
鼠,取仰卧固定位,常规消毒,行颈正中切口,钝型分
离暴露气管,经气管软骨环间隙向心端穿刺一次性
注入平阳霉素生理盐水溶液02~03mL(平阳霉
素3mg·kg-1体重),立即将动物直立并行旋转,使
药液在肺内分布充分、均匀,缝合皮肤,待动物自然
清醒后置笼内常规饲养。造模后第2天开始用药,
中药组灌胃瓜蒌薤白汤002mL·g-1体重,阳性药
组腹腔注射氢化可的松5mg·kg-1;模型组灌胃等
量去离子水,每天给药1次,每周复查动物体重以调
整给药量,共用药28d。
2.3 取材、检测指标与方法
2.3.1 一般情况 观察动物的体重、饮食、毛发、活
动状况等。
2.3.2 肺部形态学观察 实验结束时腹主动脉取
血后处死动物,取肺脏,肉眼观察肺部病变情况,然
后取左肺外侧矢状面用4%多聚甲醛固定液固定,
常规脱水石蜡包埋、切片,分别进行免疫组织化学、
HE染色。
光镜下观察肺病理改变,参照文献将肺泡炎或
肺纤维化程度分为(-~)级[6]:①无肺泡炎或无
纤维化(-);②轻度肺泡炎或纤维化(+),受累面
积少于 20%;③中度肺泡炎或纤维化(),占
20%~50%;④重度肺泡炎或纤维化(),受累面
积>50%。为比较各组间的差异,进行半定量分析,
计算病理积分均值(平均积分)。病理积分标准:0
为(-),1为(+),2为(),3为(),平均积分=
每组病理总积分/每组例数。
免疫组化法检测肺组织中血小板源生长因子
BB(PDGFBB)的表达,并用 HPIAS1000计算机图
象分析系统对染色后的切片进行定量分析,计算每
张切片阳性细胞染色程度。免疫组化切片以细胞胞
浆中呈清晰棕黄色为阳性。按染色程度不同分为5
级:胞浆深棕黄色(4分);棕黄色(3分);淡黄色(2
分);微染色(1分),无着色(0分)。高倍镜(×
400)下观察,随机选上、下,左、右,中央5个视野,以
病灶边缘正好进入检测光栏为准,测定测量光栏中
阳性区域百分比、积分吸光度。积分吸光度可相对
定量反映免疫组化阳性强弱的变化,积分吸光度与
免疫组化染色程度呈正相关。
2.4 统计学处理
数据采用SPSS100统计软件处理。等级资料
采用Ridit法分析,对服从正态分布的组间计量资料
数据以 珋x±s表示,组间差异性判断采用单因素方差
分析,方差齐时用LSD法,方差不齐时用DunnetT3
检验。
3 结果
3.1 一般情况
正常组大鼠皮毛光滑,身体健壮,饮食、活动、体
重增长正常,至实验结束时无动物死亡;模型组大鼠
皮毛干枯稀疏,精神不振,反应迟钝,身体消瘦,进
食、排便、活动均减少,喘鸣明显,呼吸急促,死亡4
只,体重较造模前略有增加,个别体重下降;瓜蒌薤
白汤组大鼠皮毛尚可,身体较壮,饮食、活动、体重增
长基本正常,无死亡;阳性药组大鼠开始尚可,后期
皮毛干枯,活动及饮食均减少,出现喘息、咳嗽,死亡
6只。
3.2 病理组织学检查
3.2.1 整体形态观察 正常组肺外观无明显异常,
呈粉红色,表面光滑;模型组两肺呈暗红色,部分肺
叶呈灰白色,弹性明显降低,可见散在的大小不等的
点片状灰白色斑块,大部分动物肺脏体积缩小,硬度
增加;瓜蒌薤白汤组和阳性药氢化可的松治疗组两
肺外观病变明显轻于模型组,两肺颜色略暗红,大部
分动物肺脏弹性尚可,部分肺叶偶尔可见散在的点
状灰白色斑块。
3.2.2 光学显微镜观察 正常组肺组织正常,无炎
性细胞,无间质纤维组织增生。模型组大鼠的肺纤
维化比较明显,肺泡间隔增宽明显,间质中大量淋巴
细胞浸润,出现大量胶原纤维和成纤维细胞,肺泡壁
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破坏,部分肺泡实变,肺泡腔内有多少不等的炎性细
胞浸润,多呈2,3级纤维化和1级肺泡炎改变。瓜
蒌薤白汤组和阳性药治疗组大鼠的肺纤维化程度均
较模型组大鼠明显减轻,大多只有轻度肺纤维化形
成,肺泡间隔轻度增宽,部分有少量炎性细胞浸润,
多呈1级纤维化改变,肺泡炎不明显。
统计结果显示:模型组肺泡炎及肺纤维化程度
显著高于正常组(P<005),表明动物模型复制成
功;瓜蒌薤白汤组及阳性药组肺泡炎及纤维化程度
轻于模型组(P<005),阳性药组肺泡炎及纤维化
程度轻于瓜蒌薤白汤组,但无显著的统计学意义;提
示瓜蒌薤白汤与氢化可的松均有减轻平阳霉素所致
大鼠肺泡炎和肺纤维化病变的作用。各组大鼠肺泡
炎及肺纤维化程度分级结果比较见表1。
表1 各组大鼠肺泡炎及肺纤维化程度积分比较(珋x±s)
组别 n
肺泡炎
- +   平均积分
肺纤维化
- +   平均积分
正常    10 10 0 0 0 000±0002) 10 0 0 0 000±0002)
模型    8 0 6 2 0 125±0461) 0 2 3 3 213±0831)
瓜蒌薤白汤 12 8 3 1 0 042±0672) 4 8 0 0 067±0501,2)
氢化可的松 6 7 2 0 0 020±0452) 5 2 2 0 050±0552)
  注:与正常组比较1)P<005;与模型组比较2)P<005(表2,3同)
3.3 各组肺组织中PDGFBB的分布及表达
镜下观察免疫组化结果:PDGFBB蛋白质阳性
表达呈棕黄色细颗粒状,或呈棕黄色丝网状。正常
对照组大鼠肺组织切片见少许阳性棕黄色颗粒分布
于肺间质结缔组织内;模型组大鼠肺组织结缔组织
可见棕黄色颗粒状或丝网状阳性表达产物明显增
多,在肺组织小气道和小血管壁内也出现明显的棕
黄色反应产物;各用药组动物肺组织中PDGFBB蛋
白质的表达量较模型组明显减少(图1)。用药组的
阳性面积百分比与积分吸光度均低于模型组,差别
有显著的统计学意义,提示瓜蒌薤白汤和氢化可的
松均可抑制肺纤维化大鼠肺组织中 PDGFBB的过
度表达。各组数据统计结果见表2,3。
4 讨论
细胞因子在肺纤维化中的作用是目前研究热
点,大量的动物实验和临床研究表明,肺纤维化的发
病过程中,促进炎症及细胞分裂增殖的细胞因子大
量产生,包括 PDGF,TGFβ,TNFα,IL6,IL8,ET1
等。PDGF作为一种重要的促间质细胞分裂增殖的
肽类调节因子,它是成纤维细胞增殖的获能因子,能
有效促进纤维细胞的增殖,同时 PDGF还可调节
ECM的合成与降解,刺激成纤维细胞分泌胶原酶,
造成间质胶原断裂和损耗,从而导致间质胶原的排
列紊乱,因而参与了肺纤维化的发病过程。[78]。
PDGF不仅可以促进大鼠肺成纤维细胞增殖、合成
代谢旺盛和信息传递活跃,而且使其Ⅰ,Ⅲ,Ⅴ型前
胶原合成增加,其调节机制之一是在转录水平上增
  
A正常组;B模型组;C瓜萎薤白汤组;D氢化可的松组
图1 各组大鼠肺组织PDGFBB表达(免疫组化,×400)
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表2 各组大鼠肺组织中细胞因子PDGFBB分布比较(珋x±s)
组别 n 肺泡巨噬细胞
支气管或肺泡
上皮细胞
肺内间质
血管内皮及
平滑肌细胞
血管周围组织
正常    10 110±0742) 000±0002) 150±0712) 110±0572) 140±0522)
模型    8 313±0831) 225±1041) 300±1071) 250±0931) 263±0741)
瓜蒌薤白汤 12 192±0671,2) 192±0791) 150±0522) 200±0741) 183±0712)
氢化可的松 6 150±0552) 150±0551) 150±0552) 117±0412) 117±0412)
表3 各组大鼠肺组织中细胞因子PDGFBB
表达比较(珋x±s)
组别 n 阳性面积比/% 积分吸光度
正常    10 4034±7012) 6538±19782)
模型    8 6712±9081) 11041±29201)
瓜蒌薤白汤 12 5536±6221,2) 8006±18342)
氢化可的松 6 4969±8821,2) 7340±10622)
强了前胶原mRNA表达的结果[9]。由此可见,在诸
多细胞因子对成纤维细胞的调控网络中,PDGF可
能是一个关键环节。过量的 PDGFBB在肺间质纤
维化的发病机制中对成纤维细胞具有重要的旁分泌
调节作用:增多的PDGFBB可以促使更多的成纤维
细胞向局部集中,并加速其分裂增殖,分泌大量胶原
纤维。在实验性肺损伤研究证实,高度纯化的
PDGFAB,PDGFBB能诱导成纤维细胞或平滑肌细
胞增生[10]。Curujayalakshmi等研究发现,博莱霉素
可导致肺组织PDGFBB的过量表达,促进肺组织纤
维化的形成;而预先应用PDGFBB表达的抑制剂可
以明显减轻博莱霉素所致的肺间质纤维化病变[11]。
本实验结果表明,瓜蒌薤白汤、氢化可的松均有
明显抑制肺纤维化大鼠肺组织中有关炎性细胞过度
产生PDGFBB,可能是其发挥抗肺间质纤维化效应
的具体机制之一。它们可能通过阻碍成纤维细胞、
巨噬细胞等合成分泌PDGFBB的过程,减少PDGF
BB刺激成纤维细胞产生胶原酶及各种炎性细胞的
浸润,从而抑制成纤维细胞的增殖、胶原沉积及肺组
织结构的改变,达到对平阳霉素致肺纤维化的防治
作用。结果也提示:虽然氢化可的松有明显抑制肺
纤维化大鼠肺组织PDGFBB过度表达的作用,然死
亡率较高,与文献报道用氢化可的松制作的肾阳虚
模型小鼠7d后死亡率达50% 结果相似,提示应充
分重视皮质激素防治肺纤维化时的不良反应。
对肺间质纤维化的治疗目前尚无良策。西医防
治多首选皮质激素,但仅部分患者有显著疗效,且使
用激素不良反应多。中医药防治肺纤维化的报道近
年逐渐增多,显示了可喜前景。本实验结果表明,瓜
蒌薤白汤有减轻平阳霉素所致的大鼠肺泡炎及纤维
化程度的作用,且瓜蒌薤白汤组肺组织中 PDGFBB
表达量较模型对照组明显减少,提示抑制肺 PDGF
BB过度表达可能是该药减轻肺间质纤维化的作用
机制之一。瓜蒌薤白汤对肺纤维化的防治作用及机
制有待进一步研究。
[参考文献]
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EfectofGualouXiebai(GLXB)decoctiononplateletderivedgrowth
factorBB(PDGFBB)expressioninlungsfrombleomycinA5induced
pulmonaryfibrosisinrats
LIRuiqin1,XIAOHong2,ZHANGRui1,LIWei1,SONGJianping
(1HenanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou450008,China;
2HenanWorkersColegeofMedicine,Zhengzhou450008,China)
[Abstract] Objective:ToinvestigatetheefectandmechanismofGualouXiebai(GLXB)decoctiononpulmonaryfibrosis.
Method:PulmonaryfibrosiswasinducedbybleomycinA5inSDrats.RatsintreatmentgroupwerekiledafterbeingtreatedbyGLXB
bydecoctiondailyfor28days.Thelungsofalratswereharvestedforhistopathologicalstudies.Thecontentsofplateletderivedgrowth
factorBB(PDGFBB)inlungsweremeasuredandcompared.Result:ThecontentsofPDGFBBinlungshaveincreasedsignificantly
inmodelgroupcomparedwithnormalgroupandtreatmentgroup(P<005).Conclusion:GLXBdecoctioncouldsignificantlyalevi
atetheincreasedPDGFBBexpressioninlungsofpulmonaryfibrosisrats.
[Keywords] pulmonaryfibrosis;plateletderivedgrowthfactorBB(PDGFBB);GualouXiebaidecoction
[责任编辑 古云侠]
[收稿日期] 20080410
[基金项目] 2007年国家大学生创新训练计划项目;2005年中山大学第一批学生科研基金项目(1163166);2005年中山大学实验室开放
基金项目(KF2005017)
[通讯作者] 杨惠玲,Tel:(020)87332626,Email:hlyang@gzsumseducn
小柴胡汤对鼻咽癌细胞生长的抑制作用
林子洪1,夏洪平2,傅 明1,廖威明1,林 调3,陈新桂3,
王海新3,杨惠玲2
(1.中山大学 附属第一医院 关节外科,广东 广州 510080;
2.中山大学 病理生理学教研室,广东 广州 510080;
3.中山大学 中山医学院,广东 广州 510080)
[摘要] 目的:探讨复方小柴胡汤对鼻咽癌高分化鳞癌细胞株1(nasopharyngealcarcinomacelline,CNE1)和
鼻咽癌低分化鳞癌细胞株2(CNE2)生长的抑制作用,试图为该药物的临床开发与应用提供实验数据。方法:按浓
度梯度配置复方小柴胡汤,用MTT实验检测不同浓度复方小柴胡汤对CNE1/2细胞生长的影响,同时运用软琼脂
克隆形成实验检测其对CNE1/2细胞增殖能力的影响;在BALB/cAnu裸鼠右背后皮下接种对数生长期细胞悬液
(5×105个/mL)02mL,成功复制肿瘤模型后随机分为5组,每组8只,于次日复方小柴胡汤按05,025,0125g
·mL-1高、中、低3个剂量给药,同时设阳性对照组和阴性对照组,连续给药15d后,测量肿瘤的体积和质量,计算
体积抑制率和瘤重抑制率,研究复方小柴胡汤对CNE2细胞裸鼠移植瘤的抑制作用。结果:MTT法和克隆形成实
验结果提示,与阴性对照组相比,不同浓度的复方小柴胡汤处理CNE1和CNE2细胞24,48,72h,发现对两株的细
胞生长和增殖能力均存在不同程度的抑制作用,并随药物浓度和作用时间的增加而增强,两者结果显示其半数抑
制浓度约为25g·L-1;与阴性对照组比较,裸鼠体内抑瘤实验发现给复方小柴胡汤治疗组裸鼠肿瘤生长速度明
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