全 文 ：《中国药典》２００５年版第一部对丹参药材中丹参酮
ⅡＡ和丹酚酸Ｂ的含量要求是按干燥品计算不少于
０２％和３０％。而有文献报道［５］，河北安国地产丹
参药材和河北行唐的丹参药材丹参酮ⅡＡ质量分数
分别为００４％和００５％，而丹酚酸 Ｂ为２８９％和
３７４％。本实验的材料，无论是毛状根还是原药材，
其丹参酮ⅡＡ的含量都达不到药典要求。而水溶性
的丹酚酸Ｂ的含量相对较高，而且，毛状根中比药
材的含量还要高，可作为丹参水溶性制剂的原料，以
扩大药用资源。
为保证实验的可控性，本实验对培养基的量和接
种毛状根的量都有控制，尽量将误差减少到最低。在
实际生产中，有报道可以用一些气升试反应器［２］，增
长倍数远远高于实验室培养。根据本实验的结果，在
固体培养基中培养的毛状根，收获时应选择６周比较
合适，此时毛状根的增长倍数大，而有效成分相对来
说也比较高。这些结果对进一步研究丹参毛状根的
生产、药理、药效等提供了科学的参考依据。从而为
系统的研究丹参毛状根的性状打下了基础。
［参考文献］
［１］ 张荫麟，宋经元，吕桂兰，等．丹参毛状根培养的建立和丹参酮
的产生［Ｊ］．中国中药杂志，１９９５，２０（５）：２６９．
［２］ 邱德有，宋经元，马小军，等．丹参毛状根生物反应器大规模培
养的研究［Ｊ］．分子植物育种，２００４，２（５）：７０２．
［３］ 黄炼栋，胡之璧，刘 涤．丹参毛状根中水溶性酚酸类化合物
的产生简报［Ｊ］．植物生理学报，１９９７，３３（４）：２６０．
［４］ 中国药典［Ｓ］．一部．２００５：５２．
［５］ 金樟照，祝 明，张文婷，等．不同产地丹参水溶性成分和脂溶
性成分指纹图谱测定及相关性研究［Ｊ］．中草药，２００４，３５
（１０）：１１７６．
［责任编辑 张宁宁］
［收稿日期］ ２００７０２２８
［基金 项 目］ 国 家 “十 五”、“十 一 五”科 技 项 目
（２００４ＢＡ７２１Ａ２５，２００６ＢＡＩ０６Ａ１５３）
［通讯作者］ 董诚明，Ｔｅｌ：（０３７１）６５６８００４１，Ｅｍａｉｌ：ｄｃｍ３７１
＠ｈａｃｔｃｍ．ｅｄｕ．ｃｎ
冬凌草组织培养物中主要次生代谢产物积累动态的研究
苏秀红，董诚明，王伟丽，冯卫生
（河南中医学院 中药学院，河南 郑州 ４５０００８）
冬凌草Ｒａｂｄｏｓｉａｒｕｂｅｓｃｅｎｓ（Ｈｅｎｍｓｌ．）Ｈａｒａ为唇
形科香茶菜属多年生植物。许多学者对冬凌草化学
成分、药理作用及临床疗效进行了研究，发现其中主
要抗癌、抗菌活性成分为二萜类化合物（冬凌草甲
素、冬凌草乙素）和多酚类化合物迷迭香酸，并对其
作了较深入的研究［１３］。萜类物质积累与分布不仅
具有较强的组织特异性，而且与植株的生长发育存
在着一定的相关性。迷迭香酸作为冬凌草水溶性部
分中主要的有效成分，具有较好的抗菌、消炎、止痛
的功效［３］。对彩色紫苏 ＣｏｌｅｕｓｂｌｕｍｅｉＢｅｎｔｈ．和洋苏
草ＳａｌｖｉａｏｆｉｃｉｎａｌｉｓＬ．等一些植物的研究表明培养细
胞中迷迭香酸含量远远超过原植物，因此，利用生物
技术生产迷迭香酸的研究越来越受到人们的关
注［４］。有关冬凌草组织培养的研究虽然已有相关
报道［５，６］，但对其培养物中主要次生代谢产物及其
积累规律的报道甚少。为此本实验在对冬凌草组织
培养过程系统研究的基础上，探讨了冬凌草培养物
中主要次生代谢产物冬凌草甲素、迷迭香酸的积累
规律，为进一步利用生物技术生产冬凌草次生代谢
产物的研究提供一些必要的基础资料，同时亦为其
大规模的生产提供科学依据。
１ 材料
冬凌草叶片２００６年８月中旬采集于河南中医
学院药用植物种植园内，经董诚明教授鉴定为 Ｒ
ｒｕｂｅｓｃｅｎｓ。冬凌草甲素、迷迭香酸对照品均为河南中
医学院冯卫生教授所赠，纯度为９９８％。
２ 方法
２．１ 愈伤组织的诱导
取冬凌草幼嫩叶片，自来水冲洗，于超净台上用
７５％乙醇中消毒３０ｓ，之后用０１％升汞溶液消毒
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第３３卷第９期
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７～８ｍｉｎ，用无菌水冲洗５～６次后将叶片切成０５
ｃｍ２小块。接种于 ＭＳ＋６ＢＡ２０ｍｇ·Ｌ－１＋ＮＡＡ
１０ｍｇ·Ｌ－１培养基中，诱导愈伤组织的产生。其中
含蔗糖３％，ｐＨ５８，培养条件为（２５±１）℃ ，光照
１２ｈ·ｄ－１。
２．２ 丛生芽的诱导、生长、生根及快繁培养
将冬凌草愈伤组织切成０３ｃｍ２的小块，接种到
ＭＳ＋６ＢＡ２０ｍｇ·Ｌ－１（蔗糖３％，ｐＨ５８）芽诱导培
养基中。之后接种于ＭＳ＋６ＢＡ０５ｍｇ·Ｌ－１＋ＮＡＡ
００５ｍｇ·Ｌ－１（蔗糖３％，ｐＨ５８）芽生长培养基中。
待丛生芽约２ｃｍ高时，接种到 ＭＳ＋６ＢＡ２０ｍｇ·
Ｌ－１＋ＮＡＡ０１ｍｇ·Ｌ－１（蔗糖３％，ｐＨ５８）培养基上
培养３０ｄ后，植株约５～６ｃｍ高。培养条件同上。
２．３ 组织培养过程中冬凌草甲素、迷迭香酸含量的
测定
２．３．１ 取样时期 分别于外植体接种前（培养 ０
ｄ）、愈伤组织启动时（培养２～３ｄ）、愈伤组织形成
时（培养７ｄ）、细胞分化初期（接种到分化培养基上
１０ｄ）、芽分化初期（接种到分化培养基上 １２～１３
ｄ）、芽分化期（接种到分化培养基上１５ｄ）、丛生芽
（接种到分化培养基上２０ｄ）、再生植株等几个代表
性的时期取样测定冬凌草组培物中冬凌草甲素、迷
迭香酸的含量。
２．３．２ 冬凌草甲素、迷迭香酸的ＨＰＬＣ条件 样品
液的制备：样品置于６０℃恒温干燥箱中干燥至恒
重，用研钵研成粉末，精密称取 ０２５ｇ样品，加 ２０
ｍＬ甲醇，超声提取２次，每次３０ｍｉｎ，合并２次滤
液，水浴蒸干，用甲醇溶解剩余物并定溶于５ｍＬ量
瓶中，作为供试样品。
色谱条件：岛津２０－Ａ高效液相色谱仪，ＳＰＡ－
２０检测器。Ｓｐｈｅｒｍａｇｅ８０色谱柱（４ｍｍ×２５０ｍｍ）
反相柱。冬凌草甲素检测波长２３８ｎｍ，流速为０５
ｍＬ·ｍｉｎ－１。流动相为甲醇水溶液（５０∶５０），柱温
为２５℃，对照品溶液１０１ｍｇ·ｍＬ－１。每个样品测
定３次，进样量为１０μＬ。样品中的冬凌草甲素含
量均为３次进样的平均值。迷迭香酸检测波长３３５
ｎｍ，流速为 ０８ｍＬ·ｍｉｎ－１。流动相为甲醇０５％
的磷酸水溶液（４５∶５５），柱温为３０℃，对照品溶液
０５８ｍｇ·ｍＬ－１。每个样品测定３次，进样量为１０
μＬ。
方法学考察：冬凌草甲素：Ｙ＝８７６１４Ｘ＋
１０１２２，ｒ＝０９９９８，线性范围在０１５２～１５２μｇ·
ｍＬ－１，精密度 ＲＳＤ０５８％，平均回收率为 ９９１％，
ＲＳＤ０４％ ；迷迭香酸 Ｙ＝１４４８７５Ｘ＋５５４５４，ｒ＝
０９９９２，在 ０３～３μｇ·ｍＬ－１，精密度 ＲＳＤ为
０８２％，平均回收率为９８７％，ＲＳＤ０６％。
３ 结果与分析
３．１ 冬凌草组织培养过程
冬凌草叶片接种到 ＭＳ＋６ＢＡ２０ｍｇ·Ｌ－１＋
ＮＡＡ１０ｍｇ·Ｌ－１愈伤组织诱导培养基上 ２～３ｄ
后，叶片逐渐皱缩、变厚，并从中部隆起，预示着愈伤
组织诱导启动的开始，约１周后，从叶缘切口长出淡
绿色愈伤组织。随着培养时间的延长，叶片周围逐
渐形成大量的淡绿色的细胞团，并将外植体覆盖。
挑选生长旺盛的愈伤组织，接种到分化培养基上培
养约１０ｄ后，可见淡绿色的愈伤组织中间颜色逐渐
变浅而成为较为透明的乳白色，而周围愈伤组织颜
色越来越深。培养１２～１３ｄ后即可形成肉眼可见
的芽点。随后芽点逐渐增多，２０ｄ后愈伤周围形成
大量的丛生芽，将丛生芽转到生长培养基中约２ｃｍ
高时，将其转接到快繁及生根培养基中，随着培养时
间的延长，植株下部会形成根，并在其叶腋处萌发出
侧芽，３０ｄ后植株约５～６ｃｍ高。
３．２ 组织培养过程中冬凌草甲素积累动态
冬凌草组织培养过程中冬凌草甲素含量与其细
胞形态分化密切相关（表１）。刚从植株上采集的幼
嫩叶片的冬凌草甲素质量分数为０７７０％，诱导培
养２～３ｄ后（愈伤组织启动）时，冬凌草甲素质量分
数迅速降低为０２００％，随着培养时间的延长，当叶
片切口周围，形成大量愈伤组织时，冬凌草甲素进一
步降低为００２０％，将其接种到分化培养基上培养
１０ｄ后，冬凌草甲素进一步降低为００００％，培养１２
～１３ｄ后，愈伤周围形成肉眼可见的芽点，此时，冬
凌草甲素仍为００００％，随后芽点逐渐增多，此时，
冬凌草甲素上升为０００２％，培养２０ｄ后，愈伤周围
形成大量的丛生芽，冬凌草甲素迅速上升为
００４３％，当丛生芽经过生长、生根及快繁培养基培
养形成约 ５～６ｃｍ高植株时，冬凌草甲素上升为
０５４０％。由此可见冬凌草甲素的合成是受细胞生
长发育的严格调控。
３．３ 组织培养过程中迷迭香酸积累动态
新鲜采集的幼嫩叶片外植体，迷迭香酸质量分
数为０８１０％，诱导培养２～３ｄ后（愈伤组织启动
时），迅速上升为 １３５０％，当叶片切口周围，形成
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表１ 组培苗再生过程中冬凌草甲素的质量分数 ％
取样时期 冬凌草甲素
叶片外植体接种前 ０７７０
愈伤组织启动时 ０２００
愈伤组织形成时 ００２０
细胞分化初期 ００００
芽分化初期 ００００
芽分化期 ０００２１
丛生芽 ００４３
再生植株 ０５４０
大量愈伤组织时，迷迭香酸继续上升为２１９０％，之
后愈伤组织接种到分化培养基上培养１０ｄ后，迷迭
香酸却迅速降低为０３８０％，继续培养２～３ｄ后，愈
伤周围形成肉眼可见的芽点时，迷迭香酸又开始上
升为０４９０％，随后芽点逐渐增多，此时，迷迭香酸
继续上升为１５１０％，当愈伤周围的不定芽逐渐增
多，形成大量的丛生芽时，迷迭香酸又下降为
１１８０％，当丛生芽经过生长、生根及快繁培养基培
养形成约 ５～６ｃｍ高植株时，迷迭香酸降为
０９９０％（表２）。
表２ 组培苗再生过程中迷迭香酸的质量分数 ％
取样时期 迷迭香酸
叶片外植体接种前 ０８１０
愈伤组织启动时 １３５０
愈伤组织形成时 ２１９０
细胞分化初期 ０３８０
芽分化初期 ０４９０
芽分化期 １５１０
丛生芽 １１８０
再生植株 ０９９０
４ 讨论
萜类物质生物合成在植物发育过程中由于控制
时间和地点的不同使这一过程的调控变得较为复
杂，总的来说可分为空间调控和阶段调控［７］。其中
的阶段调控主要是指萜类化合物的产生与植物的发
育过程密切相关。大量的研究结果也证明了这一
点。如药用植物青蒿中有效成分青蒿素的形成、积
累及分布不仅具有较强的组织特异性，而且与植株
的生长发育（尤其是开花）存在着一定的相关性。
辣椒中的辣椒素只有在生殖生长的后期才能在果皮
中合成并积累［８］。本研究对冬凌草组织培养过程
中冬凌草甲素含量的变化表明，培养过程中随着细
胞脱分化的进行冬凌草甲素含量逐渐降低，在细胞
分化初期、芽分化初期含量最低为零，随着植物器官
的再生，冬凌草甲素含量逐渐上升，这说明甲素的合
成可能与冬凌草植株内特定的组织或器官有关，而
愈伤组织细胞往往缺少特定组织或器官，使得其次
生代谢产物冬凌草甲素的合成不能够进行。而随
着植物组织、器官的逐渐形成，特别是丛生芽及再生
植株形成后，甲素含量逐渐升高，说明甲素的合成与
植物的茎、叶器官的形成有着密切的关系。而再生
植株中冬凌草甲素的含量低于其野生品，可能是由
于培养过程中，细胞内外条件的改变而导致控制次
生代谢产物合成的基因差异性表达所致。另外，生
态环境如气候、土壤、地形和生长周期等对药用植物
的有效成分的积累也有较大的影响。
研究表明蔗糖浓度对迷迭香酸的合成有很强的
促进作用［４］，而蔗糖在培养基中其作用主要是提供
碳源，由此推测迷迭香酸的积累可能与培养物中碳
源有关。本研究表明叶片培养初期（愈伤诱导启动
时、愈伤形成时），迷迭香酸含量迅速上升，这可能
是叶片外植体吸收培养基中的蔗糖，导致蔗糖进入
细胞的比例迅速上升，从而引起迷迭香酸的大量积
累。但是进入芽分化期后，由于代谢速率加快导致
植物细胞中碳源相对减少，从而使迷迭香酸含量下
降，当芽出现分化后迷迭香酸含量又开始增加，可能
是由于光合作用使细胞中的碳源增加所致，当进入
植株再生过程时由于生长发育进入转型期导致其体
内碳源下降致使迷迭香酸含量降低，但具体原因尚
值得进一步探讨。
本实验是作者在对冬凌草组织培养过程系统研
究的基础上（筛选出冬凌草愈伤组织诱导、芽分化、
芽生长的的最佳培养基），对其培养物中主要次生
代谢产物及其积累规律进行的研究。但近年来有关
药用植物组织培养中次生代谢产物生产的研究表
明，通过改变培养条件、调节培养基的组成，可大大
提高培养物中次生代谢产物的含量［９］。有关这方
面的工作，本实验室也开展了相关研究，其具体结果
将另文报道。
［参考文献］
［１］ 左海军，李 丹，吴 斌，等．冬凌草的化学成分及其抗肿瘤活
性［Ｊ］．沈阳药科大学学报，２００５，２２（４）：２５８．
［２］ 李 钦，冯卫生．冬凌草化学成分、药理作用及开发研究进展
［Ｊ］．河南中医学院学报，２００３，１８（６）：３１．
［３］ 陈随清，董诚明，郑晓珂，等．冬凌草不同采收期迷迭香酸的含
量变化［Ｊ］．河南中医学院学报，２００３，１８（６）：２９．
［４］ 黄炼栋，胡之壁，刘 涤．迷迭香酸生产的生物技术研究［Ｊ］．
国外医药·植物药分册，１９９７，１２（３）：１０４．
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［５］ 魏景芳，李冬杰，张进献，等．冬凌草的组织培养与快速繁殖
［Ｊ］．安徽农业科学，２００５，３３（７）：１２２７．
［６］ 李冬杰，魏景芳，许 宁，等．植物生长物质对冬凌草愈伤组织
生长及褐化的影响［Ｊ］．安徽农业科学，２００６，３４（６）：１１１８．
［７］ 郝宏蕾，朱旭芬，曾云中．类异戊二烯的生物合成及调控［Ｊ］．
浙江大学学报（农业与生命科学版），２００２，２８（２）：２２４．
［８］ 陈大华，叶和春，李国凤，等．植物类异戊二烯代谢途径的分子
生物学研究进展［Ｊ］．植物学报，２０００，４２（６）：５５１．
［９］ 刘春朝，王玉春，康学真，等．适于青蒿芽生长和青蒿素积累的
光、温和培养方式探讨［Ｊ］．植物生理学报，１９９９，２５（２）：１０５．
［责任编辑 张宁宁］
［收稿日期］ ２００７０１２３
［通讯作者］ 徐迎春，Ｔｅｌ：（０２５）８４３９６３７０，Ｅｍａｉｌ：ｘｕｙｃｈ＠
１６３．ｃｏｍ
丹皮中微量元素对药材质量的影响
郭 敏１，陈卫平２，徐迎春１，程家高３，张桂花４
（１．南京农业大学 中药材研究所，江苏 南京 ２１００９５；２南京农业大学 农学院，江苏 南京 ２１００９５；
３．安徽铜陵高科技农业示范园，安徽 铜陵 ２４４１３１；４．菏泽市农科所 高新技术研究室，山东 菏泽 ２７４０００）
丹皮来源于毛茛科植物牡丹Ｐａｅｏｎｉａｓｕｆｒｕｔｉｃｏｓａ
Ａｎｄｒ．的干燥根皮［１］，在我国应用历史悠久。生长
于安徽铜陵凤凰山一带的凤丹 Ｐ．ｏｓｔｉＴ．Ｈｏｎｇｅｔ
Ｊ．ＸＺｈａｎｇ已有近５００年的历史，是中药丹皮中的
最优品种类型，其根皮以“条粗长直、肉厚粉足、木
心细、亮心多、久贮不变色、久煎不发烂”而成为著
名的道地药材，山东、湖南、重庆及安徽亳州等地均
有大面积引种栽培。
近年来随着微量元素对人体的药理作用得到证
实，微量元素也成为药材道地性研究的热点，但是多
数研究仅从微量元素的药效方面来分析其对道地药
材质量的影响［２，３］，忽略了微量元素与有机成分的
关系。本研究通过对安徽省铜陵县凤凰山、安徽省
亳州市、山东省菏泽市、湖南省邵阳县、重庆市垫江
县５个产区的同一种质（均为凤丹品种类型）的药
材外观和化学成分的考察，比较其质量差异，揭示
“道地药材”的质优所在。采用电感耦合等离子体
原子发射光谱（ＩＣＰＡＥＳ）对药材中２２种微量元素
含量进行测定，对各微量元素含量和丹皮各质量指
标作相关性分析，探索微量元素对丹皮药材质量形
成的影响。
１ 材料与方法
１．１ 材料
于２００６年９，１０月在安徽省铜陵县凤凰山、安
徽省亳州市谯城区十九里镇、山东省菏泽市小留镇、
重庆市垫江县太平镇和湖南省邵阳县郦家坪镇５个
产地的四年生凤丹种植基地采集植株样（编号分别
为 ＡＴＤ，ＡＢＤ，ＳＨＤ，ＣＤＤ，ＨＳＤ），每地随机采集 ５
株，样品经南京农业大学园艺学院王广东副教授鉴
定，为凤丹品种类型。去掉地上部分，用清水洗净根
系表面泥土，测量主根长度、径粗和木心粗度后，以
蒸馏水、去离子水分别快速淋洗３遍，剥下根皮，６０
℃烘干，粉碎，过６０目尼龙筛。
１．２ 方法
１．２．１ 丹皮外观性状的测定 分别测其主根长度、
粗度（离根茎交接至末端的１／３处横切）、木心粗度
（与测粗度的位置对应），韧粗 ＝（粗度 －木心粗）／
２，韧木比＝韧粗／木心粗。
１．２．２ 丹皮酚提取及含量测定 参照２００５年版
《中国药典》［１］，甲醇超声提取，ＨＰＬＣ测定，ＤＩＯＮＥＸ
ＳＵＭＭＩＴＰ６８０Ａ液相色谱仪（美国戴安公司），色谱
柱ＫｒｏｍａｓｉｌＣ１８（４６ｍｍ×２５０ｍｍ，０５μｍ），流动相
甲醇水（４５∶５５），柱温２８℃，进样量２０μＬ，检测波
长２７４ｎｍ。
１．２．３ 多糖提取及含量测定 具体参照文献［４］，
苯酚硫酸法测定。
１．２．４ 微量元素测定 浓 ＨＮＯ３ＨＣｌＯ４（５∶１）消
煮，采用电感耦合等离子体原子发射光谱仪 Ｉｒｉｓ
ＡｄｖａｎｔａｇｅＩＣＰＡＥＳ（美国热电公司）测定铝（Ａｌ）、砷
（Ａｓ）、硼（Ｂ）、钙（Ｃａ）、镉（Ｃｄ）、钴（Ｃｏ）、铬（Ｃｒ）、铜
（Ｃｕ）、铁（Ｆｅ）、钾（Ｋ）、锂（Ｌｉ）、镁（Ｍｇ）、锰（Ｍｎ）、
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