全 文 :·研究论文·
生物与非生物诱导子协同作用
对丹参毛状根培养生产丹参酮的影响
晏 琼1,2,胡宗定1,吴建勇2
(1天津大学 化工学院,天津 300072;
2香港理工大学 应用生物及化学科技学系,香港)
[摘要] 目的:考察生物诱导子yeastextract和不同非生物诱导子(Ag+,Co2+,α氨基异丁酸)协同作用对丹参
毛状根培养生产丹参酮的影响。方法:在丹参毛状根培养基中添加不同诱导子及诱导子组合,利用高效液相色谱
法检测3种主要丹参酮(隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA)的含量。结果:yeastextract与各非生物诱导子在不同浓
度下的组合对丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA都发挥了较好的协同诱导作用,而对隐丹参酮的协同诱导效果不显著。其中,
yeastextract和Ag+(300μmol·L
-1)协同作用获得了最高的丹参酮Ⅰ产量,是对照组含量的139倍,诱导协同作用系
数为30。yeastextract和Co2+(100μmol·L
-1)协同作用获得了最高的丹参酮ⅡA产量,是对照组含量的145倍,协同
作用系数为21。yeastextract和α氨基异丁酸(200μmol·L
-1)的组合是唯一一个比单个诱导子更有效地提高了隐丹
参酮产量的组合,隐丹参酮的产量达到128mg·g-1,是对照组含量的303倍,诱导协同作用系数为13。结论:利
用生物诱导子yeastextract和不同的非生物诱导子进行协同作用,其诱导效果比单独使用某一种诱导子的诱导效果
更好,这种相互作用可以更有效地促进次生代谢产物的合成。
[关键词] 生物和非生物诱导子;协同作用;丹参酮;丹参毛状根
[中图分类号]S567 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2006)03018804
[收稿日期] 20050603
[通讯作者] 吴建勇,Tel:(852)27666687
丹参 SalviamiltiorhizaBunge是我国传统中药。
现代药理研究表明丹参对治疗心血管系统和血液系
统的疾病有显著的作用,临床现已广泛使用以丹参为
主的多种复方制剂治疗冠心病和脑血管疾病等。丹
参的市场需求正日益增大,但野生丹参资源有限,且
不同地区丹参药材质量差别很大。另外栽培丹参的
生长周期长且有效成分含量低,这都给临床使用和质
量控制带来一定困难。从20世纪80年代以来国内
外开展了对丹参组织与细胞培养的研究[1,2],表明通
过丹参的细胞或组织培养可以直接获得丹参的主要
生物活性成分(脂溶性的丹参酮类化合物和水溶性的
酚酸类化合物)。这其中,由发根农杆菌感染植物形
成的丹参毛状根系统,生长速度较快,遗传性稳定,成
为了生产丹参药理活性物质的良好培养系统[35]。
添加诱导子已证明是提高植物次生代谢产物的
有效方法,而能否利用诱导子之间的相互作用来发掘
更大的植物生产次生代谢产物的能力成为了新的研
究热点[6]。因此,本研究选择生物诱导子yeastextract
(酵母提取物)和几种非生物诱导子(Ag+,Co2+和α
氨基异丁酸)进行协同诱导,考察诱导子的相互作用
对提高丹参毛状根生产丹参酮的效果,为今后工业化
生产丹参活性成分提供依据和有效的方法。
1 材料与方法
11 丹参毛状根的培养 丹参毛状根是用发根农
杆菌ATCC15834感染丹参苗获得的[4],并在无激素
的MSN(不含硝酸铵;蔗糖含量30g·L-1)液体悬浮
培养基中进行继代培养。将 03g湿根(液体培养
了3~4周的嫩根)接于装有 40mLMSN液体培养
基的200mL摇瓶中作为试验材料。25℃,110~120
r·min-1,黑暗下悬浮培养。
12 生物诱导子的制备 酵母提取物(yeastex
tract)的制备参见文献[3]。yeastextract的剂量以糖
含量表示,糖含量用蒽酮比色法测定。实验中使用
的yeastextract含量为100mg·L-1。
13 非生物诱导子的准备 Ag+的准备参见文献
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February,2006
[4]。CoCl2和α氨基异丁酸(αaminoisobutyricacid)
配制成母液。所有母液均用滤膜(022μm)过滤除
菌后待用。上述化学试剂均购自Sigma公司。
14 毛状根干重和丹参酮含量的测定 将收获的
毛状根用蒸馏水清洗和过滤 3遍,然后用滤纸吸去
多余水分,放入温度为45~50℃的烘箱中干燥至恒
重,测其干重(DW)。毛状根中丹参酮的提取和含量
的测定参见文献[4]。
15 诱导试验方案 向培养18d的丹参毛状根中
分别加入各种剂量的诱导子及诱导子组合,继续培
养7d后收获,测定毛状根的干重及毛状根中丹参
酮(隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA)的含量。为了
定量的表征不同诱导子之间的协同作用,引入诱导
协同作用系数,定义为:协同作用下丹参酮产量与两
种诱导子单独作用下丹参酮产量之和的比值。
2 结果
21 诱导子yeastextract和 Ag+协同作用的效果
从表 1可知,yeastextract和 Ag+的组合诱导对毛状
根的生长没有造成抑制,这和诱导子单独作用下表
现出来的结果一致。yeastextract和不同浓度 Ag+的
组合对隐丹参酮的诱导协同作用系数均小于 1,说
明这两种诱导子的组合没有发挥出有效的协同作
用,尽管诱导的隐丹参酮产量与对照组相比有提高。
yeastextract和不同浓度Ag+的组合对丹参酮Ⅰ的诱
导协同作用系数在 17~30,说明不同浓度 Ag+和
yeastextract的组合都比诱导子单独作用更好地提高
了丹参毛状根生丹参酮Ⅰ的能力。而 yeastextract
和Ag+的组合对丹参酮ⅡA的诱导协同作用与 Ag+
的浓度存在相关性,从低浓度到高浓度的 Ag+和
yeastextract组合的诱导协同作用系数分别为 10,
16,14,表明对丹参酮ⅡA的诱导作用最佳的组合
是100μmol·L
-1的Ag+和yeastextract的组合。
表1 诱导子yeastextract和Ag+协同作用对丹参毛状根生长和各丹参酮生产的影响
诱导处理
根干重
/g·L-1
含量/mg·g-1
隐丹参酮 丹参酮Ⅰ 丹参酮ⅡA
对照 3.60±0.85 0.04±0.01 0.28±0.03 0.07±0.02
Ag+301) 4.00±0.57 0.10±0.04 0.68±0.24 0.12±0.07
Ag+1001) 4.60±0.85 0.11±0.09 0.77±0.36 0.25±0.018
Ag+3001) 4.20±0.28 0.12±0.03 1.07±0.08 0.26±0.16
YE 4.64±0.76 0.95±0.21 0.25±0.06 0.31±0.06
YE+Ag+301) 3.80±0.28 0.66±0.14 1.60±0.48 0.40±0.03
YE+Ag+1001) 4.48±0.61 0.91±0.20 2.97±0.59 0.90±0.06
YE+Ag+3001) 4.30±0.28 0.63±0.08 4.00±0.73 0.80±0.06
注:YE为yeastextract简写,含量是100mg·L-1;1)单位为μmol·L
-1(表2,3同)
22 诱导子yeastextract和Co2+协同作用的效果
表2结果表明 Co2+单独作用时对毛状根的生长有
一定的影响,但yeastextract和Co2+的组合诱导也没
有对毛状根的生长造成抑制。yeastextract和不同浓
度Co2+的组合对隐丹参酮的诱导没有发挥出协同
作用,yeastextract和 Co2+组合诱导的隐丹参酮产量
比诱导子 yeastextract单独作用时诱导的产量还低,
诱导协同作用系数远小于1。而 yeastextract和不同
浓度Co2+的组合对丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA的协同诱
导效果明显,最大的诱导协同作用系数分别为 15
和21。并且可以发现,Co2+单独作用时其低浓度
对丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA的诱导效果比高浓度的诱
导效果更好,在与 yeastextract组合后,同样也存在
这样的规律。
23 诱导子 yeastextract和α氨基异丁酸协同作用
的效果 表3显示的是yeastextract和α氨基异丁酸
组合对丹参毛状根生长和丹参酮产量的影响。虽然
与对照组相比 yeastextract和α氨基异丁酸的组合
没有抑制毛状根的生长,但是与诱导子 yeastextract
或α氨基异丁酸单独作用的效果相比,明显引起了
生物量的降低。与前两种组合不同,yeastextract和
高浓度α氨基异丁酸的组合发挥了对隐丹参酮的诱
导协同作用,诱导的隐丹参酮产量比对照组提高了
303倍,诱导协同作用系数为 13。yeastextract和
不同浓度α氨基异丁酸的组合对丹参酮Ⅰ也发挥了
良好的协同诱导,最大的诱导协同作用系数为29。
不同浓度α氨基异丁酸和 yeastextract的组合对丹
参酮ⅡA也有良好的协同诱导效果,并且不同浓度组
合的诱导效果之间没有明显差别,诱导协同系数为
16左右。
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表2 诱导子yeastextract和Co2+协同作用对丹参毛状根生长和各丹参酮生产的影响
诱导处理
根干重
/g·L-1
含量/mg·g-1
隐丹参酮 丹参酮Ⅰ 丹参酮ⅡA
对照 3.60±0.85 0.04±0.01 0.28±0.03 0.07±0.02
Co2+501) 3.30±1.56 0.10±0.03 1.36±0.22 0.29±0.07
Co2+1001) 3.70±1.12 0.10±0.01 0.85±0.14 0.18±0.06
YE 4.64±0.76 0.95±0.21 0.25±0.06 0.31±0.06
YE+Co2+501) 4.20±0.28 0.38±0.03 2.47±0.38 1.05±0.82
YE+Co2+1001) 4.60±0.69 0.54±0.04 1.55±0.22 1.03±0.46
表3 诱导子yeastextract和α氨基异丁酸协同作用对丹参毛状根生长和各丹参酮生产的影响
诱导处理
根干重
/g·L-1
含量/mg·g-1
隐丹参酮 丹参酮Ⅰ 丹参酮ⅡA
对照 3.60±0.85 0.04±0.01 0.28±0.03 0.07±0.02
AIB1001) 4.40±1.13 0.09±0.01 0.81±0.11 0.10±0.04
AIB2001) 5.00±0.28 0.05±0.01 0.66±0.01 0.07±0.00
YE 4.64±0.76 0.95±0.21 0.25±0.06 0.31±0.06
YE+AIB1001) 3.60±0.28 0.58±0.06 1.77±0.49 0.65±0.25
YE+AIB2001) 3.80±0.28 1.28±0.35 2.64±0.85 0.62±0.31
注:AIB为α氨基异丁酸简称
3 讨论
本试验选择了生物诱导子 yeastextract和不同
的非生物诱导子(Ag+,Co2+,α氨基异丁酸)组合,不
仅可以有效地提高丹参毛状根生产各丹参酮的能
力,而且各诱导子组合表现出了对不同丹参酮的诱
导选择性。诱导子之间发生协同作用的可能原因是
由于那些非生物的成分激活了毛状根的系统性抗
性,诱发根处于易感染状态。植物的系统性抗性是
植物抗病反应中的重要组成部分,与植物激活对防
御病原侵害的响应能力相关。因此当系统性抗性被
激活、处于易感染状态的毛状根接着受到生物诱导
子的刺激时,对它的侵害刺激更加敏感,毛状根内一
系列与细胞防御反应相关的生理生化过程被强化,
次生代谢途径活化程度被提高,次生代谢产物或植
保素等防御性物质的积累增加。而不同诱导子组合
之间的诱导选择性可能是由于不同的诱导子对次生
代谢合成途径的作用位点不同而引起的。这种诱导
的选择性也值得关注,因为在不同的医药配方或者
制剂中需要不同的丹参酮做为其主要成分,这样就
能有目的地提高所需丹参酮的含量。
在其他植物体系中也有一些实验结果表明,不
同的诱导子组合能有效地促进植物次生代谢产物产
量的提高[7,8]。因此利用诱导子之间这种可能的相
互作用进行组合以提高植物生产次生代谢产物能力
的研究更值得进一步关注[6]。但是诱导子之间协同
作用的具体生理机理以及相关的信号传导途径还很
不明确,因此后续试验将进一步探索诱导子组合提
高丹参毛状根生产丹参酮的具体原因,以做到有针
对性地筛选诱导子和有选择性地进行诱导子组合,
找到一条能获得大量而又经济的有效成分的途径。
[参考文献]
[1] HuZhB,AlfermannAW.Diterpenoidproductioninhairyrootcul
tureofSalviamiltiorhiza.Phytochemistry,1993,32(3):699.
[2] 张荫麟,宋经元,吕桂兰,等.丹参毛状根培养的建立和丹参酮
的生产.中国中药杂志,1995,20(5):269.
[3] ChenH,ChenF,ChiuFCK,etal.Theefectofyeastelicitoron
thegrowthandsecondarymetabolismofhairyrootculturesofSalvia
miltiorhiza.EnzymeMicrobialTechnol,2001,28:100.
[4] ZhangCH,YanQ,CheukWK,etal.Enhancementoftanshinone
productioninSalviamiltiorhizahairyrootculturebyAg+elicitation
andnutrientfeeding.PlantaMed,2004,70:147.
[5] ChenH,ChenF.Inductionofphytoalexinformationincrowngaland
hairyrootcultureofSalviamiltiorhizabymethylviologen.Biotechnol
Let,2000,22:715.
[6] 肖春桥,高 洪,池汝安.诱导子促进植物次生代谢产物生产
的研究进展.天然产物研究与开发,2004,16(5):473.
[7] DavidA,MeridaJ,LegendreL,etal.Enhancementofphytoalexin
accumulationinculturedplantcelsbyoxalate.Phytochemistry,1992,
31(5):1603.
[8] 苗志奇,未作君,元英进,等.水杨酸在紫杉醇生物合成中诱导
作用的研究.生物工程学报,2000,16(4):509.
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Synergisticefectsofbioticandabioticelicitorsontheproductionof
tanshinonesinSalviamiltiorrhizahairyrootculture
YANQiong1,2,HUZongding1,WUJianyong2
(1.ColegeofChemicalEngineering,TianjinUniversity,Tianjin300072,China;
2.DepartmentofAppliedBiology&ChemicalTechnology,theHongKongPolytechnicUniversity,HongKong,China)
[Abstract] Objective:Toinvestigatethesynergisticefectsofabioticelicitoryeastextractanddiferentabioticelicitors(Ag+,Co2+
andαaminoisobutyricacid)ontheproductionoftanshinonesinSalviamiltiorhizahairyroot.Method:Diferentelicitorsandtheircombina
tionswereaddedtoS.miltiorhizahairyrootcultureandthecontentsofthreemajortanshinones(crypotanshinone,tanshinoneIandtanshi
noneⅡA)wereanalyzedbyHPLC.Result:Thecombinationsofyeastextractwithdiferentabioticelicitorshadnotablesynergisticefectson
thetanshinoneIandtanshinoneⅡAproductionbutnotoncrypotanshinone.ThecombinationofyeastextractandAg+(300μmol·L
-1)yielded
thehighesttanshinoneIcontent,whichwasnearly14foldofthecontrol,andthesynergisticelicitationcoeficientwas30.Thecombination
ofyeastextractandCo2+(100μmol·L
-1)ledtothehighesttanshinoneIAcontent,whichwasabout145foldofthecontrol,andthesyner
gisticelicitationcoeficientwas21.Onlyyeastextractcombinedwithαaminoisobutyricacid(200μmol·L
-1)increasedthecrypotanshinone
contentmoreefectivelythansingleelicitors.Thehighestcrypotanshinonecontentwas128mg·g-1,about30foldofthecontrolwithasyner
gisticelicitationcoeficientof13.Conclusion:Theelicitationbythecombinationofabioticelicitorandanabioticelicitorcangenerateasyn
ergisticefect,whichismoreefectivethansingleelicitorstopromotesecondarymetaboliteproductioninplanttissuecultures.
[Keywords] bioticandabioticelicitors;synergisticefects;tanshinones;Salviamiltiorhizahairyroot
[责任编辑 张宁宁]
[收稿日期] 20041112
[基金项目] 国家科技部中药现代化研究与产业化开发项目
(999290103A)
[通讯作者] 杨春清,Tel:(010)62899743
中药材黄芪 GAP标准操作规程
杨春清,张丽萍,孙明舒,赵永华
(中国医学科学院 中国协和医科大学 药用植物研究所,北京 100094)
[摘要] 为了保证药材的优质、安全、可控性、无公害、无污染,提高质量,稳定可控的中药原料,作者按照我国
中药材GAP规范化生产的综合技术要求,对黄芪生产中的选地、种植、田间管理、病虫害防治、采收加工、包装贮藏、
运输、质量监测等技术要求,通过生产调查和试验研究后制定出了标准操作规程。
[关键词] 黄芪;规范化生产;操作规程
[中图分类号]S567 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2006)03019104
为了保证药材的优质、安全、可控性、无公害、无
污染,提供质量稳定可控的中药原料,国家科技部
“九五”“十五”都在积极探索中药材生产管理规范
(GoodAgriculturalPractice,GAP)实施和基地建设。
经过3年的研究实施和基地建设,本课题组已完成
黄芪规范化种植项目,并于2003年通过科技部组织
的专家组验收。现将黄芪生产管理规范(GAP)标准
操作规程(SOP)总结如下。
1 内容适用范围
本规程适用于我国黄芪分布的主要生产区,如
内蒙古、山西、陕西、河北、北京及新疆产区均可参照
执行。
2 质量及检测引用标准
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