全 文 :
A空白对照;B赖氨酸对照品;C供试品;1赖氨酸
图1 胚宝胶囊色谱图
RSD26%(n=4)。
26 精密度试验 精密吸取上述对照品溶液,连续
进样6次(10μL),测定峰面积,结果积分值的 RSD
029%(n=6)。
27 重复性实验 取胶束内容物 7份(批号
051201),分别按条件测定含量,结果7次测定的平
均含量为631mg·g-1,RSD21%(n=7),表明重
复性良好。
28 回收率实验 取已知含量的样品7份(批号
051201),精密加入赖氨酸对照品适量,按方法测定
并计算回收率,平均回收率 996%,RSD048%
(n=7),表明本法具有良好的回收率。
29 样品测定 按方法测定3批胚宝胶囊,结果见
表1。
表1 胚宝胶囊样品中赖氨酸含量(n=7)
批号 含量/mg/粒 RSD/%
051201 189 210
060301 179 054
060701 187 033
3 讨论
31 供试品中经用2,4二硝基氟苯衍生化后的赖
氨酸成分能与其他成分达到较好分离,由于氨基酸
本身紫外吸收较弱,因此采用较简单的2,4二硝基
氟苯柱前衍生的方法测定,可以明显改善氨基酸分
析的灵敏度。
32 试验中选择不同的提取溶媒(水,10%甲醇,
30%甲醇,50%甲醇),根据测定结果,以10%甲醇
溶液作提取溶剂时测定的含量最高,故选择采用。
[参考文献]
[1] 徐静娟,邓力犀,朱 明羊胎盘保健食品的研制及功效研究
[J]中国食品与营养,2003(6):38
[2] 陆 晖,闫晓梅,张双全羊胎盘活细胞素微量元素和氨基酸
组成的分析[J]南京师大学报:自然科学版,2001,24
(1):79
[责任编辑 李 禾]
滇重楼皂苷对10种肿瘤细胞株的细胞毒谱及构效关系研究
颜璐璐1,张艳军2,高文远1,满淑丽1
(1.天津大学 药物科学与技术学院,天津 300072;2.天津中医药大学 中药学院,天津 300193)
[收稿日期] 20071210
[基金项目] 天津市自然科学基金重点项目(07Jczdjc05400)
[通讯作者] 高文远,Tel/Fax:(022)87401895,Email:pharmgao
@tju.edu.cn
滇重楼 ParispolyphylaSmithvar.yunnanensis
(Franch.)Hand.Mazz.为百合科重楼属植物的干燥
根茎。重楼味苦,性微寒,有小毒,归肝经,具有清热
解毒、消肿止痛、凉肝定惊之功效,用于痈疮、咽喉肿
痛、毒蛇咬伤、跌打伤痛、惊风抽搐等。已有研究表
明,重楼的水、甲醇和乙醇提取物对A549(人肺癌)、
MCF7(人乳腺癌)、HT29(人结肠腺癌)、A498(人肾
腺癌)、PACA2(人胰腺癌)、PC3(人前列腺癌)等多
种人体肿瘤细胞均有抑制作用,甾体皂苷类是其主要
活性成分[1]。本实验将从滇重楼分离纯化得到的6
种皂苷采用MTT检测方法,针对10种不同类型的肿
瘤细胞株的细胞毒活性、构效关系进行了比较研究;
·7502·
第33卷第16期
2008年8月
中 国 中 药 杂 志
ChinaJournalofChineseMateriaMedica
Vol.33,Issue 16
August,2008
并采用AnnexinVFITC/PI双染法对皂苷诱导LA795
细胞凋亡情况进行了流式细胞检测,为滇重楼皂苷成
分作为抗癌药物的开发研究提供实验依据。
1 材料
1.1 药材及药物 滇重楼药材购自云南丽江,经天
津大学药物科学与技术学院高文远教授鉴定为滇重
楼 P.polyphylaSmithvar.yunnanensis(Franch.)
Hand.Mazz.,药材标本储存在天津大学药学院标本
室。滇重楼皂苷Ⅰ ~Ⅵ皆由本实验室提取分离得
到,纯度>95%。结构式及名称见图1~6。
薯蓣皂苷元3OαL阿拉伯糖基(1→4)αL鼠李糖基
(1→2)βD葡萄糖苷
图1 滇重楼皂苷Ⅰ结构式
薯蓣皂苷元3OαL鼠李糖基(1→4)αL鼠李糖基
(1→4)[αL鼠李糖基(1→2)]βD葡萄糖苷
图2 滇重楼皂苷Ⅱ结构式
薯蓣皂苷元3OαL鼠李糖基(1→4)[αL鼠李糖基
(1→2)]βD葡萄糖苷
图3 滇重楼皂苷Ⅲ结构式
1.2 仪器 TECANA-5002Spectra型酶标仪(奥
地利);CoulterEpicsAltra型流式细胞仪(Beckman
Coulter,美国)。
1.3 试剂 RPMI1640培养基、DMEM培养基、
偏诺皂苷元3OαL阿拉伯糖基(1→4)[αL
鼠李糖基(1→2)]βD葡萄糖苷
图4 滇重楼皂苷Ⅳ结构式
偏诺皂苷元3OαL阿拉伯糖基(1→4)βD葡萄糖苷
图5 滇重楼皂苷Ⅴ结构式
薯蓣皂苷元3OαL阿拉伯糖基(1→4)βD葡萄糖苷
图6 滇重楼皂苷Ⅵ
IMDM培养基、MEM/NEAA培养基(Gibco公司);胎
牛血清(天津市庆星科技有限公司);噻唑蓝(MTT,
Sigma公司);二甲基亚砜(DMSO,Sigma公司);An
nexinVFITC/PI试剂盒(晶美生物工程有限公司)。
1.4 细胞株 小鼠肺腺癌细胞株LA795,人肺癌细
胞株A549,人结肠癌细胞株 CaCo2,人肝癌细胞株
BEL7402,HepG2,人宫颈癌细胞 Hela,人表皮癌
A431,人急性髓性白血病细胞株HL60,人口腔上皮
癌细胞株KB,人肾腺癌细胞株A498,皆由中国协和
医科大学基础医学研究所提供。
2 方法
2.1 细胞培养 细胞培养于含 10%灭活胎牛血
清,100U·mL-1青霉素,100mg·L-1链霉素的培
养基中(HL60,LA795,BEL7402的培养基为 RPMI
1640,A549,CaCo2,HepG2,Hela,A431的培养基为
DMEM,KB的培养基为 IMDM,A498的培养基为
MEM/NEAA),37℃,5%CO2培养箱及饱和湿度条
件下培养。每3~4天传代一次。
2.2 MTT法检测细胞毒活性 将对数生长期细胞
用胰酶消化后配制成一定密度的细胞悬液(LA795
·8502·
第33卷第16期
2008年8月
中 国 中 药 杂 志
ChinaJournalofChineseMateriaMedica
Vol.33,Issue 16
August,2008
为3×104个/mL,A549为2×104个/mL,CaCo2为
5×104个/mL,BEL7402为2×103个/mL,HepG2为
1×105个/mL,Hela为5×104个/mL,A431为1×105
个/mL,HL60为 2×105个/mL,KB为 1×105个/
mL,A498为1×104个/mL),接种于96孔酶标板,每
孔加200μL。24h后换不含血清的培养液使细胞
同步化生长,每孔200μL。24h后(第3天)加含不
同浓度的滇重楼皂苷及溶剂对照的新鲜培养液,每
孔200μL。各给药组根据预试验结果分别在半数
抑制浓度可能的浓度范围附近设置6个给药浓度,
以2倍递增,每个剂量设8个平行孔,并设空白孔凋
零。培养24h后,每孔加无血清培养液新鲜配制的
05g·L-1MTT100μL,继续培养4h,然后每孔加
100μLDMSO,用微型振荡器振荡混匀后,于酶标仪
上测定吸光度(A),实验重复3次,取平均值。以溶
剂处理肿瘤细胞为对照组,由 A计算抑制率,并由
此求得半数抑制浓度(IC50)。
细胞生长抑制率(%)=(1-A样品/A对照)×100%
2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡 以 AnnexinV
FITC/PI标记法定量检测滇重楼皂苷诱导LA795细
胞凋亡的变化。取对数生长期的LA795细胞以3×
104个/mL接种于6孔板,实验组分别加入终浓度为
1/3IC50的皂苷,并设立正常对照组。作用24h后
025%胰蛋白酶消化收集细胞,用4℃预冷的 PBS
洗细胞2次,用250μL结合缓冲液重新悬浮细胞,
调节其密度为1×106个/mL;取100μL的细胞悬液
于5mL流式管中,加5μLAnnexinVFITC和10μL
20mg·L-1的 PI溶液;混匀后于室温避光孵育15
min;在反应管中加 400μLPBS,上流式细胞仪分
析。实验重复3次,凋亡率取均值。
2.4 统计学处理 各组数据均以 珋x±s表示,采用
SPSS100统计软件进行分析,进行单因素方差分
析,两组间比较采用t检验。
3 结果
3.1 滇重楼皂苷对肿瘤细胞的细胞毒作用及构效
关系 细胞毒活性检测结果显示,滇重楼皂苷对10
种肿瘤细胞株皆有一定的细胞生长抑制率,利用
Origin软件分别获得皂苷对细胞抑制率的半对数拟
合直线,再分别求得 IC50(表1)。根据 IC50比较,滇
重楼皂苷对各肿瘤细胞株的抑制强弱依次为
LA795,A549,Hela,CaCo2,HL60,A498,A431,
HepG2,BEL7402,KB。
表1 滇重楼皂苷对各肿瘤细胞的半数抑制浓度(珋x±s,n=8)
肿瘤细胞 皂苷Ⅰ 皂苷Ⅱ 皂苷Ⅲ 皂苷Ⅳ 皂苷Ⅴ 皂苷Ⅵ
LA795 185±011 135±019 306±033 514±029 31953±2477 3900±363
A549 217±081 116±010 476±086 703±102 45583±1623 7367±956
CaCo2 937±093 733±057 1791±265 2237±121 >1000 47641±1177
BEL7402 3798±474 2106±431 4574±649 5122±457 >1000 >1000
HepG2 3461±576 3039±344 4685±454 5396±514 >1000 >1000
Hela 403±081 319±029 565±101 963±080 67391±2910 16004±947
A431 2137±256 1793±345 5126±433 8786±653 >1000 >1000
HL60 1293±360 1173±062 2945±317 3706±252 >1000 51366±1440
KB 5368±133 4135±311 7751±379 18360±742 >1000 >1000
A498 1756±289 1047±202 3725±349 4364±158 >1000 67906±1951
根据各组的细胞毒活性检测结果,并结合各皂
苷结构,对其结构药效关系的初步分析推测,无论
是薯蓣皂苷还是偏诺皂苷都具有一定的细胞毒作
用,但在糖链相同情况下,薯蓣皂苷活性强于偏诺皂
苷,表现为对各肿瘤细胞,皂苷Ⅰ的IC50均小于皂苷
Ⅳ的IC50,皂苷Ⅵ的 IC50均小于皂苷Ⅴ的 IC50,并具
显著性差异(P<001);另外,在母核结构相同情况
下,糖链越多活性越强,表现为皂苷对各肿瘤细胞的
IC50,皂苷Ⅱ小于皂苷Ⅲ,皂苷Ⅰ小于皂苷Ⅵ,皂苷
Ⅳ小于皂苷Ⅴ,并具显著性差异(P<005)。
3.2 滇重楼皂苷诱导 LA795细胞凋亡检测 1/3
IC50浓度的滇重楼皂苷处理LA795细胞后早期细胞
凋亡率[Annexin(+)PI(-)]、晚期细胞凋亡或细
胞坏死率[Annexin(+)PI(+)]与对照组相比具显
著性差异(P<001)(表2)。
4 讨论
已有的研究表明,重楼提取物可以抑制多种肿
瘤细胞株的增殖,并已证实皂苷类为其主要活性成
分[1]。在临床中应用重楼作为抗癌辅助治疗的研
究中,如以重楼为君药的菊藻丸对脑瘤、大肠癌、食
管癌疗效较明显,肝癌无效,总缓解率为55%[2];含
重楼的益肺抗瘤饮能够抑制肺癌患者远处转移,鼻
·9502·
第33卷第16期
2008年8月
中 国 中 药 杂 志
ChinaJournalofChineseMateriaMedica
Vol.33,Issue 16
August,2008
表2 流式细胞仪检测结果(珋x±s,n=3)
组别
剂量
/μmol·L-1
早期细胞凋亡率
/%
晚期细胞凋亡率
/%
对照组 - 11±03 46±07
皂苷Ⅰ 062 129±051) 363±261)
皂苷Ⅱ 045 137±031) 411±241)
皂苷Ⅲ 102 68±021) 323±301)
皂苷Ⅳ 171 54±061) 200±101)
皂苷Ⅴ 10651 13±01 182±041)
皂苷Ⅵ 130 37±011) 135±171)
注:与对照组比较1)P<001
咽清毒颗粒为鼻咽癌放疗患者良好的辅助药物,楼
莲胶囊配合化疗治疗中晚期消化道肿瘤[3]。为进
一步证实重楼皂苷的抗肿瘤活性,确定细胞毒谱,作
者选用10种不同组织类型的肿瘤细胞为靶细胞,以
滇重楼皂苷为干预药物,进行了体外抑瘤实验。研
究结果表明,滇重楼皂苷体外对10种不同类型的肿
瘤细胞均有较为明显的抑制增殖效应,其中,对
LA795,A549,Hela,CaCo2细胞抑制效果最为显著,
HL60,A498,A431次之,HepG2,BEL7402,KB细胞
抑制较弱。结果表明滇重楼皂苷体外对多种不同类
型的肿瘤细胞并无明显的选择性毒性作用,但其抑
瘤程度存在着一定的差别,这些差别似乎可用不同
类型的肿瘤细胞具有不同生物学特征来解释。而滇
重楼皂苷能够抑制多种肿瘤细胞增殖效应也许存在
着不同的作用机制,需要今后进一步深入研究。并
且,皂苷的结构与细胞毒活性间具有一定的结构药
效关系,可为将来获得更强活性的皂苷化合物进行
结构修饰提供理论指导。
近年来人们认为,肿瘤是细胞增殖和死亡失衡
所致。细胞凋亡不同于细胞坏死。细胞的凋亡与肿
瘤的发生、发展和消退有密切关系,具有独特的生化
和形态特征。虽然许多化合物具有细胞毒活性,可
以抑制肿瘤细胞的增殖,并引起肿瘤细胞的死亡,但
并不是所有这些化合物都是通过诱导细胞凋亡来起
到这种作用[4]。已有研究表明重楼皂苷类通过影
响线粒体功能诱导多种肿瘤细胞株发生凋亡[57]。
本研究针对LA795细胞株,采用流式细胞检测法对
滇重楼皂苷的诱导细胞凋亡作用进行了研究,结果
显示其在极低的浓度下便可诱导肿瘤细胞的凋亡,
是其抗肿瘤作用的机制之一。
目前从中草药中寻找天然抗肿瘤活性成分是抗
癌药物研究的一个重要途径和研究热点[8]。随着
对滇重楼活性成分皂苷的深入研究,有望获得高效
低毒并具有明确抗肿瘤作用和机制的抗癌药物。
[参考文献]
[1] 武珊珊,高文远,段宏泉,等.重楼化学成分与药理作用研究进
展[J].中草药,2004,35(3):344.
[2] 肖毅良菊藻丸抗肿瘤临床应用240例[J]中国中西医结合
外科杂志,1997,3(2):132
[3] 王艳霞,李惠芬.重楼抗肿瘤作用研究[J].中草药,2005,36
(4):628.
[4] CozziP.Thediscoveryofanewpotentialanticancerdrug:Acase
history[J].Farmaco,2003,58:213.
[5] JennyYN,RoseCY,SuenYK,etal.PolyphylinDisapotent
apoptosisinducerindrugresistantHepG2cels[J].CancerLet,
2005,217:203.
[6] LeeMS,JudyChanYW,KongSK,etal.Efectsofpolyphylin
D,asteroidalsaponininParispolyphyla,ingrowthinhibitionof
humanbreastcancercelsandinxenograft[J].CancerBiolTher,
2005,4:1248.
[7] CaiJing,LIUMingjie,WANGZhao,etal.Apoptosisinducedby
dioscininHelacels[J].BiolPharmBul,2002,25(2):193.
[8] YangJY,XuJY,WuXM,etal.Researchontheantitumor
naturalproducts[J].ChinJMAP,2007,4(24):277.
[责任编辑 古云侠]
(上接第2028页)
melitusrats(T2DM).Method:WiastarratsofT2DMmodelweremadebyfeedingwithhighglucoseandfatdietandinjectingwith
smaldoseofstreptozocin(25mg·kg-1).40modelratswererandomlydividedintomodelcontrolgroupandthreepueraringroups
(40,80,160mg·kg-1),another10ratswereselectedasnormalcontrolgroup.FBGandFINSweremeasuredtocalculateIRafter
ratswereinjectedconsecutivelyfor6weeks.ThelevelofADRPgenemRNAinfatytissuewasdeterminedbyRTPCRafterratswere
injectedeightweeks.Result:Comparedwithmodelcontrolgroup,highandmiddledosageofpuerarincandecreasedADRPgenemR
NAexpressioninfatytissueobviously,FBG,IRlevelineachpueraringroupandFINSinhighandmiddledosagepueraringroupsde
creasedobviously.Conclusion:PuerarincandecreasethebloodglucoselevelofT2DMbydownregulatingADRPmRNAexpression
anddepressingtheinsulinresistance.
[Keywords] puerarin;T2DM;ADRP;geneexpression
[责任编辑 古云侠]
·0602·
第33卷第16期
2008年8月
中 国 中 药 杂 志
ChinaJournalofChineseMateriaMedica
Vol.33,Issue 16
August,2008