全 文 ：产薯蓣皂甙华重楼内生菌的筛选与鉴定
任　智 , 张晓喻 , 祝　凯 , 冯定胜 , 王一丁
(四川师范大学生命科学学院 ,四川 成都　 610068)
摘　要　从华重楼(ParispolyphyllachinensisFranch)的地下块茎中分离出 107株内生菌 , 经 TLC筛选检测 ,菌
株 RZ03和 RZ07可产生薯蓣皂甙。进行了形态和生理生化鉴定并将菌株的 16SrDNA序列分别与用 BLAST
调出 GenBank+EMBL+DDBJ中的相关序列比较 , 用 ClustalW绘制系统发育树 , RZ03与 DQ019167(Exiguobac-
teriumacetylicum)同源性为 99%, 鉴定为 Exiguobacteriumacetylicum, RZ03、RZ07与 DQ207730(Bacilussubtilis)
序列同源性为 99%, 初步鉴定为 BacilussubtilisRZ07。
关键词　华重楼;内生菌;薯蓣皂甙;16SrDNA序列分析
中图分类号　R284.2　　　文献标识码　A　　　文章编号　1005-7021(2007)02-0006-04
ScreeningandIdentificationofDiosgenin-ProducingEndophytic
BacteriafromParispolyphylachinensis
RENZhi, ZHANGXiao-yu, ZHUKai, FENGDing-sheng, WANGYi-ding
(Col.ofLifeSci.SichuanNormalUniv.Chengdu610068)
Abstract　107 endophyteswereisolatedfromundergroundstemtubersofParispolyphylachinensis.RZ03andRZ07
couldproducediosgeninwerescreenedthroughTLCtesting.Theirmorphology, physiology, andbiochemistrywere
characterizedandtheir16SrDNAsequencewerecomparedwithrelatedsequencesobtainedfromGenBank+EMBL+
DDBJ, andphylogenetictreeoftheir16SrDNAsequenceweredrawnwithClustalWrespectively.Thehomologybe-
tweenRZ03andDQ019167(Exiguobacteriumacetylicum)was99%, therefore, RZ03wasidentifiedasE.acetylicum
RZ03.AndThehomologybetweenRZ07 andDQ207730(Bacilussubtilis)was99%, therefore, RZ07wasidentified
asB.subtilisRZ07.
Keywords　Parispolyphylachinensis;endophyte;diosgenin;16SrDNAsequenceanalysis
　　1993年 , Stierle[ 1] 等首先从短叶红豆杉的韧
皮部中分离到 1株能产紫杉醇的内生真菌。随后
研究者在多种植物中分离到能产生与宿主相同或
相似生理活性代谢产物的内生菌 ,如产长春碱的
长春花内生菌等 [ 2] 。重楼主要药用成分为甾体皂
甙 ,具有止血 、止痛 、抗肿瘤 、免疫调节和抗生孕等
多种生理活性 ,是云南白药 、宫血宁等多种药物的
主要原料 ,其需求量很大 [ 3] 。由于重楼的引种驯
化和组织培养没有取得突破性进展 ,重楼原料供
不应求 ,寻找新的 、可再生的重楼替代资源成为必
然 [ 4] 。周立刚 [ 5]等从滇重楼中分离得到发酵培养
物含甾体化合物的内生真菌 。本文从华重楼
(ParispolyphylachinensisFranch)中分离得到 2
株可发酵产生薯蓣皂甙的细菌 ,并通过形态 、生理
生化特征和 16SrDNA序列分析对菌株进行了
鉴定 。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　试剂　新鲜野生华重楼 、华重楼粉(由四
　收稿日期:2006-09-09
　作者简介:任智　男 ,在读硕士。研究方向为微生物资源及活性产物。
　基金项目:国家自然科学基金资助项目(30670218)
6 微生物学杂志　 2007年 3月第 27卷第 2期　JOURNALOFMICROBIOLOGYMar.2007 Vol.27 No.2
川光大制药提供)、薯蓣皂甙元(四川省药检所)。
细菌基因组 DNA提取试剂盒 、胶回收试剂盒
为上海华舜生物工程公司产品;EXTaq酶和 PCR
相关试剂购自宝生物(大连)公司;其余试剂为国
产分析纯。
1.1.2　培养基 　分离培养基:固体马铃薯培养
基;发酵培养基:液体马铃薯培养基。
1.2　方法
1.2.1　重楼内生菌的分离　将鲜重楼块茎 ,用自
来水洗净泥土 ,无菌水冲洗 2次 ,无菌滤纸吸干
水分。常规无菌操作下 , 75%乙醇浸泡 1 min,无
菌水冲洗 3次 ,滤纸吸干水分 , 0.2%的砷汞浸泡
5 min,无菌水冲洗 10次 ,滤纸吸干水分 。用无菌
解剖刀将已表面消毒的重楼块茎削去表皮 ,切成
3 cm大小的正方体 , 置于分离培养基平板内 ,
28 ℃培养 4 ～ 8 d。待平板有菌长出后 ,平板划
线纯化 ,直至得到单菌落 ,斜面保存备用。
1.2.2　发酵液的初步鉴定　①重楼总皂甙的制
备:重楼粉 10 g加入乙醚 60 mL, 60 ℃超声振荡
脱脂 3 h;过滤 ,滤渣用 60 mL和 40mL甲醇超声
振荡提取 2次(60 ℃,各 3 h),合并滤液 ,回收甲
醇;用 5 mL蒸馏水溶解 ,再用 60 mL和 40 mL水
饱和正丁醇萃取 2次 ,合并 、回收正丁醇;用 2 mL
甲醇溶解 ,即得重楼总皂甙;②菌株发酵液的 TLC
检测:将分离得到的菌株 ,分别接入发酵培养基中
28 ℃, 150 r/min振荡培养 。培养至 48 h和 96 h
分别取培养液 1 mL, 1 000 r/min离心 5 min。取
上清 20 μL,用微量移液器点于薄层层析板上 ,以
重楼总皂甙 、发酵培养基为对照。层析液为氯仿 -
甲醇(100∶1),显色液为 10%磷钼酸 5%硫酸乙
醇溶液 , 105 ℃烘 3 ～ 5 min,至重楼总皂甙显出
清晰蓝色斑点为止。
1.2.3　样品制备　将菌株接种于发酵培养基中 ,
培养 2 ～ 3 d, 将发酵液抽滤 , 在滤液中加入
20 mL2 mol/L的盐酸溶液水解 2 h,放冷后用石
油醚萃取 3次 ,每次 20 mL,合并萃取液水洗至中
性 。旋转蒸干石油醚。用氯仿溶解于 5 mL容量
瓶中(供 TLC鉴定用)。
1.2.4　标准液的制备　精称薯蓣皂甙元标准品
25 mg,用氯仿溶解 ,定容到 50 mL。
1.2.5　薯蓣皂甙及其甙元的 TLC鉴定 [ 6] 　以硅
胶 G-0.5%CMC(1∶5)铺板 , 自然干燥后放入
105 ℃烘箱活化 30 min;展开剂为氯仿 、甲醇 、水
(调整混合比例),显色液为 10%磷钼酸 5%硫酸
乙醇溶液 ,将样品和标准品点样 TLC鉴定 。
1.2.6　菌株生理生化特征研究　产甾体皂甙菌
株的生理生化实验参照文献 [ 7]进行 。
1.2.7　菌株 16SrDNA序列分析　按试剂盒操作
说明书提取细菌基因组 DNA为模板 ,以 27F(5′-
agagttgatcatggctcag-3′)和 1540R(5′-aaggag
gtgatccaaccgca-3′)为正反向引物 ,扩增各菌株
的 16SrDNA。 PCR反应体系为 EXTaq酶 0.5
μL、dNTP3 μL、 DNA模板 0.5 μL、正向引物
(17 μmol/L)1 μL、反 向引 物 (17 μmol/L)
1 μL、10×Bufer2 μL、MgCl2 3 μL,双蒸水 39.4
μL。反应条件为 94 ℃ 4 min;94 ℃ 1 min, 50 ℃
1 min, 72 ℃ 1min, 循 环 30 次;72 ℃延 伸
10min。用胶回收试剂盒回收片段 ,委托上海生
物芯片工程公司测序 。测序引物为 27F、 518F
(5′-cagcagccgcggtaatacgg-3′)和 1540R。
用 BLAST探索比较菌株 16SrDNA与 Gen-
Bank+EMBL+DDBJ中已登录的序列 ,调出与菌
株 16SrDNA相关的菌株序列 ,用 ClustalW进行
多重序列对比 ,绘制进化树 。
2　结　果
2.1　重楼内生菌的分离
通过划线共纯化出 107株菌 。经过反复分
离 、筛选 、纯化 ,结合菌落观察和镜检结果的综合
判定 ,从新鲜重楼地下块茎中分离出 46株具典
型特征内生菌。经细胞核染色 , 初步分为 10株
内生真菌 , 16株放线菌及 20株细菌 。
2.2　发酵液的初步鉴定
TLC检测发现菌株 RZ03和 RZ07的发酵液
与重楼总皂甙有颜色相同 、迁移率相当的显色带
(斑)。
2.3　薯蓣皂甙元的 TLC鉴定结果
通过调整氯仿 ∶甲醇 ∶水的比例从 65∶
30∶5到 100∶0∶0得到最佳比例为 95∶5∶0,
TLC的结果见图 1。
2.4　菌株形态及生理生化特征
菌株 RZ03、RZ07的形态特征与生理生化试
验结果见表 2,检索 《伯杰细菌鉴定手册》初步确
定 RZ03为肠杆菌科 (Enterobacteriaceae)细菌 ,
RZ07为芽胞杆菌属(Bacilussp.)细菌 。
72期　　　　　　　　　　　　　　任智等:产薯蓣皂甙华重楼内生菌的筛选与鉴定　　　　　
图 1　RZ03和 RZ07的发酵液 TLC鉴定图
Fig.1　RZ03andRZ07fermentationliquidTLCidentifypicture
表 1　菌株生理生化特征
Table1　Themorphology, physiologicalandbiochemical
characteristicsofthestrains
RZ03 RZ07
革兰氏染色 - +
氧化酶 - -
过氧化氢酶 + -
接触酶 - +
产生吲哚 + -
酪素水解 - -
明胶水解 - +
硝酸盐还原 + +
甲基红 + +
淀粉水解 - +
从甘油产生二羟基丙酮 - -
葡萄糖发酵 发酵型产酸 发酵型产酸
V.P + +
2.5　16SrDNA系统发育分析
　　测定 RZ03的部分 16SrDNA序列 1 429 bp,
RZ07的部分 16SrDNA序列 1 420 bp。 BLAST
比较发现 RZ03与多株肠杆菌科细菌的 16SrDNA
相似 , RZ07与多株芽胞杆菌的 16SrDNA相似。
用 ClustalW进行多重序列对比 , 绘制进化树 ,
RZ03进化树见图 2a, RZ07进化树见图 2b。图 2a
显示 RZ03与 DQ019167(Exiguobacteriumacetyli-
cum)同源性为 99%, 由此判断 RZ03与 Exig-
uobacteriumacetylicum同种 ,鉴定为 Exiguobacteri-
umacetylicumRZ03。由图 2b可知 RZ07与已知
序列 DQ207730(Bacilussubtilis)的同源性为
99%,再结合形态与生理生化特征初步鉴定为
BacilussubtilisRZ07[在进化树上与 RZ07在同一
分子支上的菌种是 AB211031(pseudomonas)但
RZ07与 bacilussubtilis的同源性仍高达 99%所以
其结果是结合生理生化鉴定结果的综合结论 ] 。
3　讨　论
　　甾体皂甙是重楼的主要药用成分 ,现已从重
楼属植物中分离得到 44种甾体皂甙[ 8] 。本实验
制备的重楼总皂甙 TLC只有 4个斑点 ,表明制备
方法和分析方法都需要改进。菌株发酵液与重楼
总皂甙有颜色相同 、迁移率相当的斑点 ,表明菌株
可产生重楼甾体皂甙 ,具体为何种甾体皂甙通过
水解法 TLC分析可以确定重楼内生菌可发酵产
生薯蓣皂甙 ,使得研究可以更进一步得到证实 ,目
的性也更强 ,这可能成为解决重楼资源短缺问题
的一条新途径。但如何使其中的薯蓣皂甙能被有
效提取以及如何提高起产量都是值得解决和探讨
的问题 。
本文从充分利用微生物资源来替代有限的植
物资源入手 ,有目的性地采用了华重楼为目标 ,从
华重楼中分离到 107株内生菌 , 经过反复分离 、
筛选 、纯化 ,结合菌落观察和镜检结果的综合判
定 ,从新鲜重楼地下块茎中分离出 46株具典型
特征内生菌。经细胞核染色 ,初步分为 10株内
生真菌 , 16 株放线菌及 20株细菌。通过 TLC初
8 　　　　　　　　　微　生　物　学　杂　志　　　　　　　　　　　　　　　　　27卷
步检测发现菌株 RZ03和 RZ07的发酵液与重楼
总皂甙有颜色相同 、迁移率相当的显色带(斑)。
再通过薯蓣皂甙元标品的检测 ,进一步证实了其
中喊有活性成分 。所以再对 RZ03和 RZ07两株
菌进行了生理生化的鉴定和分子鉴定 ,确定其种
属 ,分析其进化树 。下一步将有目的地挑选一些
在进化树中相近分支的菌种 ,检测起发酵产物是
否也会产生皂甙及其类似物 ,这将会为微生物资
源的利用提供广阔的前景 ,还将对 RZ03及 RZ07
两株菌做进一步的研究 ,通过改变发酵条件检测
其皂甙产量的变化情况 ,找出较高的产皂甙水平
条件;并将对起抗菌等生物活性做进一步研究 。
图 2　RZ03和 RZ07的 16SrDNA系统发育树
Fig.2　16SrDNAphylogenetictreesofRZ03andRZ07
a:RZ03的 16SrDNA系统发育树 , b:RZ07的 16SrDNA系统发育树
a:16SrDNAphylogenetictreesofRZ03, b:16SrDNAphylogenetictreesofRZ07
参考文献:
[ 1] 　StierleA, StrobelG, StierleD.Taxolandtaxaneproductionby
Taxomycesandreanae, anendophyticfungusofPacificyew[ J].
Science, 1993, 260(5105):214-216.
[ 2] 　文才艺 ,吴元华 ,田秀玲.植物内生菌研究进展及其存在的
问题 [ J] .生态学杂志 , 2004, 23(2):86-91.
[ 3] 　汤海峰 ,赵越平 ,蒋永培.重楼属植物的研究概况 [ J].中草
药 , 1998, 29(12):839-842.
[ 4] 　李恒 ,杨兴华 ,梁汉兴 ,等.重楼属植物 [ M] .北京:科学出版
社 , 1998, 157.
[ 5] 　ZHOULigang, CAOXiaodong, YANGChengzong, etal.Endo-
phyticfungiofParisPolyphylavar.YunNansisandsteroida-
nalysisinthefungi[ J] .NaturalProductResearchandDevel-
opment, 2004, 16(3):198-200.
[ 6] 　郑慧丽.七叶一枝花酊剂薄层层析及其薯蓣皂甙元定量
[ J] .上海医科大学学报 , 1995, 22(1):64-65.
[ 7] 　张纪忠.微生物分类学 [ M] .上海:复旦大学出版社 , 1990,
93-105.
[ 8] 　武珊珊 ,高文远 ,段宏泉 ,等.重楼化学成分和药理作用研究
进展 [ J] .中草药 , 2004, 35(3):443-447.
92期　　　　　　　　　　　　　　任智等:产薯蓣皂甙华重楼内生菌的筛选与鉴定