全 文 ：45 卷　5 期
2005 年 10月
微 生 物 学 报
Acta Microbiologica Sinica
Vol.45
October
　No.5
2005
基金项目:四川师范大学校级科研基金“团队项目”
＊通讯作者。 Tel:86_28_84766411;E_mail:wangyiding63@hotmail.com
作者简介:赵　明(1979-),男 ,四川绵阳人 ,硕士 ,研究方向为微生物资源学。 E_mail:myzm1010@hotmail.com
其他作者:张小洁 ,冯定胜
收稿日期:2004_12_27 ,修回日期:2005_04_27
产甾体皂甙华重楼内生菌的筛选与鉴定
赵 　明 　贺声蓉 　陈小静 　黄春萍 　王一丁＊
(四川师范大学生命科学学院　成都　610068)
摘　要:从华重楼(Paris polyphylla var.chinensis Franch)的地下块茎中分离筛选得到 2 株可能产生甾体皂甙的内生
菌(SS01 和 SS02),薄层层析检测菌株SS01、SS02的发酵产物分别有 3 条和 2 条层析带与重楼总皂甙的层析带迁移
率相当。形态和生理生化特征初步表明 SS01 和 SS02 分属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)和芽孢杆菌属(Bacillus
sp.)细菌。扩增 、测序得到 SS01和 SS02的部分 16S rDNA 序列 , GenBank 接收号分别为 AY842143 和 AY842144。用
Blastn调出与菌株 16S rDNA同源的序列 ,用 ClustalW 进行多重序列对比 , 用软件 Phylip 按 Neighbor_Joining方法构建
16S rDNA系统发育树。菌株 SS01和 SS02分别与 Cedecea davisae DSM 4568 、Paenibacillus daejeonensis处于同一分支 ,相
似性分别为 98.9%和 97.7%,将它们鉴定为 Cedecea davisae SS 01和 Paenibacillus daejeonensis SS02。
关键词:华重楼 , 内生菌 ,甾体皂甙 , 16S rDNA 序列分析
中图分类号:Q939.91　　文献标识码:A　　文章编号:0001-6209(2005)05-0776-04
　　1993 年 Stierle 等[1]首先从短叶红豆杉的韧皮部中分离
到一株能产紫杉醇的内生真菌。随后研究者在多种植物中
分离到能产生与宿主相同或相似生理活性代谢产物的内生
菌 ,如产长春碱的长春花内生菌等[ 2] 。
重楼主要药用成分为甾体皂甙 , 具有止血 、止痛 、抗肿
瘤 、免疫调节和抗生孕等多种生理活性 , 是云南白药 、宫血宁
等多种药物的主要原料 ,其需求量很大[ 3] 。由于重楼的引种
驯化和组织培养没有取得突破性进展 , 重楼原料供不应求 ,
寻找新的 、可再生的重楼替代资源成为必然[ 4] 。 周立刚等[ 5]
从滇重楼中分离得到发酵培养物含甾体化合物的内生真菌。
本文从华重楼(Paris polyphylla var.chinensis Franch)中分离得
到2 株可能发酵产生重楼甾体皂甙的细菌 ,并通过形态 、生
理生化特征和 16S rDNA 序列分析对菌株进行了鉴定。
1　材料和方法
1.1　材料
1.1.1　材料:新鲜野生华重楼 、华重楼粉 , 由四川光大制药
提供。
1.1.2　试剂:细菌基因组DNA提取试剂盒 、胶回收试剂盒为
上海华舜生物工程公司产品;Ex Taq 酶和 PCR相关试剂购
自大连 TaKaRa公司;其余试剂为国产分析纯。
1.1.3　培养基:分离培养基为固体马铃薯培养基 , 发酵培养
基为液体马铃薯培养基 ,按文献[ 6]配制。
1.2　重楼内生菌的分离
将鲜重楼块茎 ,用自来水洗净泥土 , 无菌水冲洗 2 次 , 无
菌滤纸吸干水分。常规无菌操作下 , 75%乙醇浸泡 1min , 水
冲洗 3 次 , 滤纸吸干水分;0.2%的砷汞浸泡 5min , 水冲洗
10次 , 滤纸吸干水分。用无菌解剖刀将已表面消毒的重楼
块茎削去表皮 ,切成 3cm 大小的正方体 , 置于分离培养基平
板内 , 28℃培养 4 ～ 8d。 待平板有菌长出后 , 平板划线纯化 ,
直至得到单菌落 , 斜面保存备用。
1.3　发酵液的初步鉴定
1.3.1　重楼总皂甙的制备:重楼粉 10g加入乙醚 60mL, 60℃
超声振荡脱脂 3h;过滤 , 滤渣用 60mL和 40mL 甲醇超声振荡
提取 2次(60℃, 各3h),合并滤液 , 回收甲醇;用 5mL 蒸馏水
溶解 ,再用 60mL和40mL水饱和正丁醇萃取 2次 , 合并 、回收
正丁醇;用 2mL甲醇溶解 ,即得重楼总皂甙。
1.3.2　菌株发酵液的 TLC 检测:将分离得到的菌株 , 分别接
入发酵培养基中 28℃、150r min 振荡培养。 培养 48h 和 96h
分别取培养液 1mL , 1000r min 离心 5min。取上清 20μL , 用微
量移液器点于薄层层析板上 , 以重楼总皂甙 、发酵培养基为
对照。层析液为氯仿_甲醇(100∶1), 显色液为 10%磷钼酸_
5%硫酸乙醇溶液 , 105℃烘 3～ 5min ,至重楼总皂甙显出清晰
蓝色斑点为止。
1.4　菌株形态和生理生化特征研究
产甾体皂甙菌株的形态学观察和生理生化实验参照文
献[ 7] 进行。
1.5　菌株 16S rDNA序列分析
按试剂盒操作说明书提取细菌基因组 DNA 为模板 , 以
27F (5′_ AGAGTTTGATCATGGCTCAG _3′)和 1540R (5′_
DOI :10.13343/j.cnki.wsxb.2005.05.025
AAGGAGGTGATCCAACCGCA_3′)为上下游引物[8] , 扩增各菌
株的 16S rDNA。 PCR 反应体系为 Ex Taq 酶 0.3μL、dNTP
4μL、DNA 模板 1μL、上游引物(17μmol L)1.3μL、下游引物
(22μmol L)1μL、10×Buffer 5μL、双蒸水 33.4μL。反应条件为
95℃5min;94℃ 1min , 55℃ 1min , 72℃ 4min , 循环 30 次;72℃
15min。用胶回收试剂盒回收片段 , 由上海生物芯片工程公
司测 序。 测 序 引 物 为 27F、 518F (5′_CAGCAGCCGCGG
TAATACGG_3′)和 1540R[ 8] 。
用 Blastn比较菌株 16S rDNA 与 GenBank 中已登录的序
列 ,调出与菌株 16S rDNA 同源并经过菌种鉴定的序列 , 用
ClustalW进行多重序列对比 , 用软件 Phylip 按 Neighbor_Joining
法构建系统发育树 ,计算菌株间同源性。
2　结果
2.1　重楼内生菌的分离
采集野生重楼 ,进行表面消毒 、分离内生菌 ,对得到的菌
落进行平板划线纯化 ,最后分离纯化到 107株菌。
2.2　发酵液的初步鉴定
经 TLC检测 , 菌株 SS01 和 SS02 的发酵液与重楼总皂甙
有显色相同 、迁移率相当的层析带(斑),凝胶成像系统扫描
结果见图 1。重楼总皂甙有 4 条蓝色层析带 , 相对迁移率 R
(f)分别为 0.90 、0.78、0.55 和 0.36;菌株 SS01 的发酵液有 4
条蓝色层析带 , 相对迁移率 R(f)分别为 0.78、0.55 、0.36 和
0.12;菌株 SS02 的发酵液有 3 条蓝色层析带斑点 , 相对迁移
率 R(f)分别为 0.91、0.56 和 0.09。其中 , 菌株 SS01 、SS02 分
别有3 条和 2 条层析带与重楼总皂甙的层析带迁移率相当 ,
初步表明菌株 SS01 和 SS02 可能发酵产生重楼甾体皂甙。
图 1　内生菌发酵液与重楼总皂甙的 TLC比较
Fig.1 　The TLC comparison of endophytesis metabolites to Paris
polyphylla var.chinensis Franch saponins
1, 2.Metabolites of SS01 and SS02;3.CK of culture medium;4.Paris
polyphylla var.chinensis Franch saponins.
2.3　菌株形态和生理生化特征
菌株 SS01、SS02 的形态特征与生理生化试验结果见表
1 ,检索文献[ 9] 初步鉴定 SS01 为肠杆菌科(Enterobacteri-
aceae)细菌 , SS02 为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)细菌。
表 1　菌株形态和生理生化特征
Table 1　The morphology , physiological and biochemical characteristi cs
of the strains
Characteri stics SS01 SS02
Shape of st rain body Shaft Long shaf t
Width of rod 0.25μm 0.5～ 0.75μm
Length of rod 0.75～ 1μm 4.5～ 5μm
Spore - +
Gram staining - +
Oxidase test - -
Catalase + -
Indole test + +
Casein hydrolysis - +
Gelatin hydrolysi s - +
Nitrate reduction + +
M.R test + +
Starch hydrolysi s - +
Glucose utilization + +
V.P + +
2.4　16S rDNA系统发育分析
分别提取菌株 SS01 、SS02 基因组 DNA , 按方法通过 PCR
得到各菌株 1.5kb 左右的 16S rDNA。委托上海生物芯片工
程公司测得 SS01 的 16S rDNA 部分序列 , 长度为 1482bp
(GenBank 接收号为 AY842143), SS02的 16S rDNA 部分序列 ,
上游为 539bp 、下游为 644bp(GenBank 接收号为 AY842144)。
Blastn 比较发现 SS01 的 16S rDNA 与多株肠杆菌科细菌的
16S rDNA相似 , 调出其中已鉴定菌株的 16S rDNA ,用 ClustalW
进行多重序列对比 , 用软件 Phylip 按 Neighbor_Joining法构建
系统发育树(图 2)。 由图 2 可知菌株 SS01 的 16S rDNA
(AY842143)与 AY493976(Cedecea davisae DSM 4568)距离最
近 ,经 ClustalW 计算 , 二者同源性为 98.9%, 由此判断菌株
SS01 与 Cedecea davisaeDSM 4568 同种 ,鉴定为 Cedecea davisae
SS 01。 Blastn 比较发现 SS02 的 16S rDNA 上下游序列分别与
多株芽孢杆菌的 16S rDNA相似 , 同上法构建系统发育树(图
3)。 由图 3 可知 SS02 的 16S rDNA 上下游序列分别与
AF391124(Paenibacillus daejeonensis)距离最近 , 用 ClustalW 计
算SS02 的部分 16S rDNA(1183bp)与 AF391124 的同源性为
97.7%, 表明 SS02 与 Paenibacillus daejeonensis 同种 , 命名为
Paenibacillus daejeonensis SS02。
3　讨论
甾体皂甙是重楼的主要药用成分 , 现已从重楼属植物中
分离得到 44 种甾体皂甙[ 10] 。本实验制备的重楼总皂甙 TLC
只有 4条层析带 ,表明制备方法和分析方法都有待改进。菌
株次生代谢物与重楼总皂甙有显色相同 、迁移率相当的层析
带 ,初步表明其可能产生重楼甾体皂甙 , 需进一步研究菌株
产生何种甾体皂甙及其是否具有重楼药用活性。若重楼内
生菌能发酵产生甾体皂甙 , 利用内生菌发酵则可能成为解决
重楼资源短缺问题的一条新途径。
777　2005 , Vol.45 No.5 赵　明等:产甾体皂甙华重楼内生菌的筛选与鉴定
图 2　SS01的 16S rDNA系统发育树
Fig.2　16S rDNA phylogenetic tree of SS01
图 3　SS02的 16S rDNA系统发育树
Fig.3　16S rDNA phylogenetic trees of SS02
参 考 文 献
[ 1 ] Stierle A , Strobel G , Stierle D.Taxol and taxane product ion by
Taxomyces andreanae , an endophytic fungus of Pacific yew.Science ,
1993, 260(5105):214-216.
[ 2 ] 文才艺 , 吴元华 , 田秀玲.植物内生菌研究进展及其存在的
问题.生态学杂志 ,2004 , 23(2):86-91.
[ 3 ] 汤海峰 , 赵越平 , 蒋永培.重楼属植物的研究概况.中草药 ,
1998, 29(12):839-842.
[ 4 ] 李　恒 , 杨兴华 , 梁汉兴 , 等.重楼属植物.北京:科学出版
社 , 1998 , 157.
[ 5 ] Zhou L G , Cao X D , Yang C Z , et al.Endophytic fungi of Paris
　　　
polyphylla var.yunnansis and steroid analysis in the fungi.Natural
Product Research and Development , 2004 ,16(3):198-200.
[ 6 ] 黄秀梨.微生物学实验指导.北京:高等教育出版社 , 1996 ,
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[ 7 ] 张纪忠.微生物分类学.上海:复旦大学出版社 , 1990, 93-
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[ 8 ] 刘志恒.现代微生物学.北京:科学出版社 ,2002 , 62-63.
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[ 10] 武珊珊 , 高文远 , 段宏泉 ,等.重楼化学成分和药理作用研究
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778 微生物学报　 Acta Microbiologica Sinica 2005 , Vol.45 No.5　
Screening and identification of steroidal saponins_producing endophytes from
Paris polyphylla var.chinensis Franch
ZHAO Ming　HE Sheng_rong　CHEN Xiao_jing　HUANG Chun_ping　WANG Yi_ding＊
(College of Life Sciences , Sichuan Normal University , Chengdu 610068 , China)
Abstract:Two endophytic strains SS01 and SS02 with the potential for producing steroidal saponins were isolated from
the underground stems of Paris polyphylla var.chinensis Franch.The TLC comparison indicated that there are 3 sports
with similar R(f)between the metabolites of SS01and the saponins of Paris polyphylla var.chinensis Franch.And there
are 2 sports with similar R(f)between the metabolites of SS02 and the saponins of Paris polyphylla var.chinensis
Franch.The characteristics of morphology , physiological and biochemical showed that SS01 belonged to
Enterobacteriaceae and SS02 belonged to Bacillus sp..The 16S rDNA of SS01 and SS02 were PCR and sequenced.The
accessions of GenBank are AY842143 and AY842144 , respectively.The two 16S rDNA phylogenetic trees were
constructed by comparing with the published 16S rDNA sequences of the relative bacteria species.In the first
phylogenetic tree SS01 and Cedecea davisae DSM 4568 was the closest relative with 98.9% sequence similarity , and in
the second phylogenetic tree SS02 and Paenibacillus daejeonensis was the closest relative with 97.7% sequence
similarity.According to the phylogenetic analysis they were identified as Cedecea davisae SS01 and Paenibacillus
daejeonensis SS02 , respectively .
Key words:Paris polyphylla var.chinensis Franch , Endophyte , Steroidal saponins ,16S rDNA sequence analysis
Foundat ion item:The Research Fund of Sichuan Normal Universi ty
＊Corresponding author.Tel:86_28_84766411;E_mail:wangyiding63@hotmail.com
Other authors:ZHANG Xiao_jie , FENG Ding_sheng
Received date:12_27_2004
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779　2005 , Vol.45 No.5 赵　明等:产甾体皂甙华重楼内生菌的筛选与鉴定