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Effect of olive Antihyperlipidemia capsule on low and high density lipoprotein receptor in rat liver gene expression in hyperlipmia rat liver

橄榄降脂胶囊对高脂血症大鼠肝脏脂蛋白受体基因表达的影响



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[ Κεψ ωορδσ] ≥ °¨ ±¨ ≤¤¶¶¬¤~ ³µ²·¨¬±~ ¤±·«µ¤´ ∏¬±²±¨ª¯∏¦²¶¬§¨ ¶~ ¤±·¬2¤ª¬±ª
≈责任编辑 刘  
橄榄降脂胶囊对高脂血症大鼠肝脏脂蛋白
受体基因表达的影响
张金生
k河南中医学院 第一附属医院 o河南 郑州 wxssssl
≈摘要   目的 }在基因水平上探讨中药橄榄降脂胶囊的降脂作用机制 o为中药新药开发提供科学依据 ∀方法 }
w{只雄性 ≥⁄大鼠 o根据血中总胆固醇水平随机分为正常组 o模型组 o血脂康组 o橄榄降脂胶囊低 !中 !高剂量组 o每
组 {只 ∀采用 • ×2°≤• 测定高脂血症大鼠肝脏高 !低密度脂蛋白受体基因表达 ∀结果 }模型组大鼠肝 ⁄• r≥• 2…t
°• ‘„表达降低 o与正常组比较有显著性差异 kΠ  s1sxl∀经橄榄降脂胶囊治疗后肝 ⁄• r≥• 2…t °• ‘„表达升
高 o与模型组比较有显著性差异 kΠ  s1sxlo与正常组无显著性差异 ∀结论 :橄榄降脂胶囊可调节脂质代谢紊乱治
疗高脂血症 o其机制与上调肝 ⁄• r≥• 2…t°• ‘„表达有关 ∀
≈关键词   橄榄降脂胶囊 ~高脂血症大鼠模型 ~肝脏高 !低密度脂蛋白受体 ~基因表达
≈中图分类号   • u{xqx ≈文献标识码   „ ≈文章编号   tsst2xvsukusszlsy2sxt|2sw
≈收稿日期   ussy2s|2uz
≈基金项目   河南省科技攻关 k国际合作 l项目 ksywyyvsssul
≈通讯作者   3 张金生 oר¯}kstslo∞2°¤¬¯}
分子生物学 !免疫和遗传学研究表明 o脂质代谢
不仅与脂质代谢酶有关 o还取决于肝细胞摄取 ⁄
k ²¯º §¨ ±¶¬·¼ ¬¯³²³µ²·¨¬±l和 ‹⁄k«¬ª«§¨ ±¶¬·¼ ¬¯³²³µ²2
·¨¬±l的胆固醇逆向转运的平衡 ∀血液循环中约
zxh ⁄在肝脏中被清除 o其中 |sh是通过 ⁄•
k ²¯º §¨ ±¶¬·¼ ¬¯³²³µ²·¨¬±2µ¨¦¨³·²µl途径清除的 ≈t  ~清
道夫受体 ≥• 2…tk≥¦¤√ ±¨ª¨ µµ¨¦¨³·²µ…tl是主要分布
在肝脏的功能性 ‹⁄受体 o通过介导对血浆 ‹⁄2≤
的选择性摄取 o使外周组织过多的胆固醇转变成胆
汁排出体外 o维持机体脂质代谢平衡 ≈u  o因此 o肝
≥• 2…t和 ⁄• 作为调控脂质代谢的关键性基因之
一 o不仅是调节脂质代谢和脂肪细胞分化的关键转
录因子 o而且其功能正常与否直接关系到体内脂质
代谢的状况 ∀在中药橄榄降脂胶囊临床治疗高脂血
症取得显著疗效的基础上 o进一步在基因水平探讨
橄榄降脂胶囊的降脂机制 o为临床用药和新药开发
提供科学依据 ∀
1 材料与方法
1q1 动物 健康雄性 ≥⁄大鼠 w{只 o清洁级 o体重
kuss ? usl ªo由河南省动物实验中心提供 o动物合
格证豫医动字第 ssstyt|∀
1q2 药物与试剂 橄榄降脂胶囊 k橄榄果 tx ªo神
曲 tu ªo山楂 vs ªo莪术 tu ªo柴胡 ts ªo泽泻 tu ªo
大黄 | ª组成 o河南中医学院一附院制剂室制备 o
s1y ªr粒 o相当于含生药 y1s ªo成人用量 | ª# §pt ∀
血脂康胶囊 k北京北大维信生物科技有限公司 o批
号 sxtsstos1v ªr粒 o成人用量 t1u ª# §pt l∀ ×µ¬½²¯
核酸提取液 !⁄‘„  ¤µ®¨ µ!焦碳酸二乙酯 k⁄∞°≤ l
k大连宝生物有限公司 o批号分别为 ussxsusyto
#|tx#
第 vu卷第 y期
ussz年 v月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλοφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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ussxswsxz|usoussxsusvusl~• ×2°≤• 反应试剂盒
k上 海 生 工 生 物 技 术 服 务 有 限 公 司 o批 号
ussxsxzuysl∀
1q3 仪器 Š’≥zxss型凝胶成像分析系统 !基因扩
增仪 k美国 ˜∂ °公司 lo超速离心机 !超低温冰箱
k日本日立公司 lo电泳系统 k美国 …¬²2µ¤§公司 l∀
1q4 方法
1q4q1 高脂饲料的制备 根据预实验结果并参考
文献 ≈v 加以改进 ∀高脂饲料配方 }tsh 猪油 !
t1xh胆固醇 !s1uh胆盐 !x1sh蛋黄粉 os1uh甲基
硫氧嘧啶 !{v1th基础饲料 ∀
1q4q2 模型 !标本制备与给药 ≈v  ≥⁄大鼠适应性
喂养 t周 o禁食 tu «后 o用戊巴比妥钠 kws °ª#
®ªpt l溶液腹腔麻醉 o颈静脉取血检测血脂 ∀根据血
中总胆固醇水平 o随机分为正常组 o模型组 o血脂康
组 o及橄榄降脂胶囊低 !中 !高剂量组 o每组 {只 ∀正
常组普通饲料喂养 o其余各组予高脂饲料 o自由饮
水 ∀模型组灌胃生理盐水 o血脂康组灌胃血脂康胶
囊 s1s| ª# ®ªpt o橄榄降脂胶囊低 !中 !高剂量组分
别灌胃橄榄降脂胶囊 s1yzxot1vxou1z ª# ®ªpt ∀ t
次 r§ots °# ®ªpt o连续给药 y周 ∀每周称重 t次 o
根据体重调整用药量 ∀用药治疗 y周后 o禁食 tu «
后 !称重 o用戊巴比妥钠 kws °ª# ®ªpt l溶液腹腔麻
醉 o腹主动脉取血 x °o轻轻混匀 ov sss µ# °¬±pt
离心 tx °¬±o分离血清 o液氮保存待测 ~同时在肝左
叶取约 tss °ª肝组织 t块 o生理盐水冲洗后 o将肝
组织放入预先经焦碳酸二乙酯水处理的冷冻管中 o
液氮转移 o p zs ε 冰箱保存备用 ∀
1q5 检测方法 采用 • ×2°≤• 技术检测肝 ≥• 2
…t°• ‘„的表达 o按文献 ≈w 方法进行实验 ∀
1q5q1 总 • ‘„提取 取 p zs ε 冻存肝组织约 tss
°ª置于匀浆器中 o按 tΒts比例加入 ×µ¬½²¯核酸提取
液 o在液氮中将 tss °ª肝组织碾磨成粉末 o制成匀
浆 ∀取 xss ˏ匀浆液转移到 t1x °∞°管中 ∀加入
uss ˏ氯仿 o剧烈震荡混匀 vs ¶∀在台式离心机上 o
tu sss µ# °¬±pt ow ε 离心 x °¬±∀将上清液 uss °
小心转移到 • ‘¤¶¨2©µ¨ t¨1x °离心管里 o加入等体积
的异丙醇 ow ε 下放置 x °¬±o充分振荡 ∀ tu sss µ#
°¬±pt ow ε 离心 x °¬±∀ zsh乙醇洗涤和离心 u次 o每
次 zss ˏotu sss µ# °¬±pt ow ε 离心 u °¬±∀真空离
心干燥 v ∗ x °¬±o使乙醇完全挥发 ∀沉淀用 xs ˏ
⁄∞°≤水溶解 o得到的总 • ‘„o pzs ε 存放待用 ∀
1q5q2 • ‘„含量 !纯度检测和完整性的鉴定 在
紫外分光光度计上测定 uysou{s ±°处吸光度 o测定
Αuys rΑu{s为 s1u ∗ s1x Λª# ˏpt o证明 • ‘„完整无
降解 o可以用于其后的 • ×2°≤• 实验 k图 tl∀
图 t 各组总 • ‘„的电泳结果
„q正常组 ~…q模型组 ~≤q血脂康组 ~⁄q橄榄低组 ~
∞q橄榄中组 ~ƒq橄榄高组 k图 uov同 l
1q5q3 • ×操作流程 在冰浴的试管中加入 }模板
• ‘„ v Λªo随机六合引物 s1u Λª# ˏpt t ˏo无
• ‘„酶去离子水 k• ‘¤¶¨2©µ¨¨§§‹u ’l定容至 tt ˏ∀
离心 v ∗ x ¶∀ zs ε 水浴 x °¬±后 o冰浴 vs ¶o然后离心
v ∗ x ¶∀再加如下 }x ≅ • ¤¨¦·¬²± …∏©©¨µw °o • ‘¤¶¨
Œ±«¬¥¬·²µkus ˜ # ˏpt lt ˏo§‘×°  ¬¬kts °°²¯ #
pt l u ˏ轻混匀后离心 v ∗ x ¶ovz ε 水浴 x °¬±o加
入 u ˏ ∏∂ • ×kus ˜# ˏpt lo终体积为 us ˏo先
在 ux ε 温育 ts °¬±o然后 vz ε 水浴 ys °¬±∀ zs ε 加
热 ts °¬±结束反应 o pus ε 保存备用 ∀
1q5q4 引物设计 利用 Š ±¨…¤±®数据库中提供的
大鼠 ≥• 2…t⁄‘„全序列和 st¬ªsx1s引物设计软件
设计 ≈x  o由上海生工生物工程公司合成 ∀ ≥• 2…t上
游引物 }xχ2Š×× ≤≤≤ ××≤ ׄ≤ ×׊ ×≤≤ Š×2vχ~下游
引物 }xχ2Š„„Š≤„××׊≤ŠŠ×ŠŠ„≤Š„×2vχo扩增长
度为 vvx的 ⁄‘„片段 ∀ Β2¤¦·¬±上游引物 }xχ2×≤≤×2
Š×ŠŠ≤„×≤≤„≤Š„„„≤×2vχo下游引物 } xχ2≤≤Š××
≤≤„≤× ×„×≤≤ „≤≤„Š„×2vχo扩增长度为 xxs ¥³的
⁄‘„片段 ∀ ⁄• 上游引物 }xχ2≤≤ŠŠŠ„≤׊Š×2
≤„Š„׊„Š2vχo下游引物 }xχ2≤≤׊Š×Š×Š„ŠŠŠ×≤2
≤„׊2vχo扩增长度为 uyy ¥³的 ⁄‘„片段 ∀
1q5q5 反应体系 肝 ≥• 2…t}≥·¨µ¬¯¬½¨ §§§«‹us u|1u
ˏots ≅ °≤• ¥∏©©¨µx ˏou °°²¯ # pt §‘×° xˏo
≥• 2…Œ上游引物 u1s ˏ!下游 u1s ˏoפ³⁄‘„多聚
酶 s1v ˏoux °°²¯ # pt  ª≤ u¯ u1x ˏo模板 ⁄‘„
t1s ˏoΒ2¤¦·¬±上游引物 t1x ˏo下游 t1x ˏo加到
s1x °∞³管中 o总量为 xs ˏ∀扩增条件 }|w ε 预变
性 v °¬±o|w ε 变性 xs ¶o xy ε 退火 wx ¶ozu ε 延伸
{s ¶o经 vu个循环 o最后 zu ε 延伸 z °¬±o终止反应 w
ε 保存 k图 ul∀肝 ⁄• }≥·¨µ¬¯¬½¨ §§§«‹us vs1z ˏo
#sux#
第 vu卷第 y期
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中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλοφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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 ¤µ¦«o ussz
ts ≅ °≤• ¥∏©©¨µx ˏo u °°²¯# pt ⁄±·³x ˏo ⁄•
上游引物 t1x ˏo下游 t1x Λ×¤³⁄‘„多聚酶 s1v
ˏoux °°²¯# pt  ª≤ u¯ v ˏo模板 ⁄‘„ t1s ˏoΒ2
¤¦·¬±上游引物 t1s ˏo下游 t1s ˏo在冰上依次加到
s1x °∞³管中 o总量共为 xs ˏ∀扩增条件为 }|w ε
预变性 v °¬±o|w ε 变性 vs ¶oxz ε 退火 ys ¶ozu ε 延
伸 t °¬±o经 vs个循环 o最后 zu ε 延伸 x °¬±o终止反
应后 w ε 保存 k图 vl∀
图 u 各组大鼠肝 ≥• 2…t°• ‘„ • ×2°≤• 产物电泳
图 v 各组大鼠肝 ≥• 2…t°• ‘„ • ×2°≤• 产物电泳
1q5q6 肝 ⁄• r≥• 2…t °• ‘„检测 ≈y  取 °≤• 产
物 ts ˏo加上样缓冲液 k溴酚蓝 ls1x ˏo于 t1xh
琼脂糖胶中电泳 oxs ∂ ows °¬±∀电泳完毕后 o在凝
胶自动成像仪上进行照像 !数据分析 o经凝胶密度扫
描系统处理 o测定各电泳条带灰度值 o以目的基因的
灰度值与 Β2¤¦·¬±灰度值的比值作为目的基因的表
达强度 ∀
1q6 统计学方法
实验数据用 cξ ? σ表示 o运用 ≥°≥≥ tu1s统计软
件 o采用方差分析和 τ检验方法进行统计分析 ∀
2 结果
肝 ≥• 2…tr⁄• °• ‘„相对表达量比较分析见
表 t∀
表 t 对各组大鼠肝 ≥• 2…tr⁄• °• ‘„相对表达量
的影响 kcξ ? σ, ν € {l h
组别 剂量 rª# ®ªpt ≥• 2…t°• ‘„ ⁄• 2°• ‘„
正常 p s1xz ? s1sxz s1xw{ ? s1tuw
模型 p s1vxx ? s1syytl s1vww ? s1tsytl
血脂康 s1s| s1yxw ? s1sytul s1xyw ? s1syxul
橄榄 s1yzx s1yvv ? s1txwul s1yzu ? s1usyul
t1vx s1xvx ? s1twxul s1xsy ? s1txyul
u1z s1ysw ? s1s|zul s1xvx ? s1tzxul
注 }与正常组比 tl Π  s1sx~与模型组比 ul Π  s1sx
3 讨论
血脂谱的遗传变异与相关血脂基因在 ⁄‘„水
平上差异表达有关 o继而影响载脂蛋白合成和代谢 ∀
至少有 uss种基因可能对脂质在体内的摄取 !代谢
和排泄产生影响 oysh以上的血脂变化由遗传因素
所决定 ≈z  ∀肝脏是人体低密度脂蛋白受体较为密
集的器官 o其 ⁄• 表达的变化决定着人体胆固醇
的代谢 o人血中 zsh的胆固醇是由低密度脂蛋白和
极低密度脂蛋白携带的 o循环中约 zxh ⁄在肝脏
中被清除 o其中 |sh是通过 ⁄• 途径清除的 o研
究发现 o⁄• 的功能损伤和数量不足是家族性高
胆固醇血症和非家族性高胆固醇血症发生的原因 ~
清道夫受体 ≥• 2…t主要分布在肝脏的功能性 ‹⁄
受体 o参与 • ≤×的起始和终末步骤 o‹⁄通过胆固
醇逆向转运 kµ¨√ µ¨¶¨ ¦«²¯ ¶¨·¨µ²¯ ·µ¤±¶³²µ·¤·¬²±o• ≤×l
过程不断清除体内过剩的胆固醇 o减缓脂质的沉
积 ≈{  ∀因此 o肝 ≥• 2…t和 ⁄• 作为调控脂质代谢
的关键性基因 o其功能正常与否直接关系到体内脂
质代谢的状况 ∀
肝脏作为体内胆固醇平衡最重要的调节器官 o
为维持其自身的胆固醇平衡 o通过提高肝 ≥• 2…t的
表达 o一方面将胆固醇转化成胆汁排出 o另一方面将
胆固醇在细胞内酯化和储存 ≈|  o但在长期高脂状态
下会引起 ׊和 ⁄2≤升高 o减弱肝细胞膜流动性 o
影响脂蛋白受体活性 o干扰 ⁄与肝细胞膜上 ⁄2
• 的结合 o导致细胞内胆固醇增多 o⁄2• 合成减
少 o肝细胞摄取 !转变及排泄 ⁄2≤减少 o致使血中
׊!׊升高 o同时大量胆固醇由 • ≤×进入肝细胞堆
积 o严重影响肝细胞的正常代谢功能 o使肝 ≥• 2… 和¯
⁄2• 因过度表达而失代偿 o导致肝脏清除血脂的
功能下降而引发高脂血症 ≈ts  ∀
橄榄降脂胶囊是在 /从肝论治高脂血症 0中医
理论指导下 ≈tt  o结合现代医学关于肝脏脂质代谢和
中药药理的研究成果组建的方剂 o在临床已取得较
好的效果 ≈tu  ∀研究表明 o模型组大鼠肝 ≥• 2…tr⁄2
• °• ‘„表达水平明显降低 o与正常组比较 Π 
s1sx∀这可能长期处于高脂状态 o肝 ≥• 2…tr⁄•
°• ‘„的表达失代偿而导致基因表达的降低 o导致
脂质代谢紊乱 ∀经治疗后 o大鼠肝 ≥• 2…tr⁄•
°• ‘„表达明显上调 o与模型组比较 Π  s1sxo与正
常组比较差异不显著 ∀表明橄榄降脂胶囊可激发高
脂血症大鼠肝 ≥• 2…tr⁄• °• ‘„表达 o加速脂蛋
白分解 o清除血液中过多 ⁄达到降脂目的 o说明
橄榄降脂胶囊对肝 ≥• 2…tr⁄• °• ‘„基因表达有
#tux#
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Χηινα ϑουρναλοφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯qvuo Œ¶¶∏¨ y
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明显调控作用 o但这种作用是否通过多部位 !多靶点
增强肝细胞表面 ≥• 2…tr⁄• °• ‘„受体数量与活
性有关 o还有待进一步研究 ∀
≈参考文献  
≈t  • ¤±ª ÷ ⁄o ≥¤·²  ≥o…µ²º±o ·¨¤¯q ≥• ∞…°2to ¤ ° °¨¥µ¤± 2¨
¥²± §¨·µ¤±¶¦µ¬³·¬²± ©¤¦·²µµ¨¯¨ ¤¶¨§¥¼¶·¨µ²¯2µ¨³∏¯´·¨§≈ q °µ²·¨2
²¯¼¶¬¶≤¨¯ o¯ t||wozkzl}xvq
≈u  „¦·²± ≥o • ¬ª²·¬„o ¤±§¶¦«∏¯½Ž×o ·¨¤¯qŒ§¨ ±·¬©¬¦¤·¬²± ²©¶¦¤√2
±¨ª¨ µµ¨¦¨³·²µ≥• 2…t ¤¶¤«¬ª« §¨ ±¶¬·¼ ¬¯³²³µ²·¨¬± µ¨¦¨³·²µ≈ q
≥¦¬¨±¦¨o t||youzktl}xtq
≈v  张大方 q药理与中药药理实验 ≈  1上海 }上海科学技术出版
社 oussu}|q
≈w  苗明三 q高血脂及动脉粥样硬化模型 q实验动物和动物实验
技术 ≈  q北京 }中国中医药出版社 ot||z}t||q
≈x  ’«ª¤°¬‘o ‘¤ª¤¬• o  ¬¼¤½¤®¬„o ·¨¤¯q ≥¦¤√ ±¨ª¨ µµ¨¦¨³·²µ¦¯¤¶¶
… ·¼³¨ Œ2° §¨¬¤·¨§ µ¨√ µ¨¶¨ ¦«²¯ ¶¨·¨µ²¯ ¶³²µ·¬¶¬±«¬¥¬·¨§ ¥¼ ¤§2
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≈ts  ‘¤√¤¥ o ‹¤°¤≥ ≠ o ≤²²®¨ ≤ o ·¨¤¯q ‘²µ°¤¯ «¬ª«§¨ ±¶¬·¼ ¬¯³²2
³µ²·¨¬± ¬±«¬¥¬·¶·«µ¨¨¶·¨³¶¬± ·«¨ ©²µ°¤·¬²± ²©°¬¯§¯¼ ²¬¬§¬½¨ § ²¯º
§¨ ±¶¬·¼ ¬¯³²³µ²·¨¬± ¶·¨³t≈ q ¬³¬§• ¶¨o usssowktl}tw{q
≈tt  彭 勃 o张金生 q试论中医理论的创新与重构 ≈ q中国医药
学报 ousswot|ktul}zttq
≈tu  彭 勃 o张金生 q橄榄降脂胶囊治疗高脂血症 xy例临床观察
≈ q河南中医 oussxouxkul}vtq
Εφφεχτ οφ ολιϖε Αντιηψπερλιπιδεµ ια χαπσυλε ον λοω ανδ ηιγη δενσιτψ λιποπροτειν
ρεχεπτορ ιν ρατ λιϖερ γενε εξπρεσσιον ιν ηψπερλιπµ ια ρατ λιϖερ
‹„‘Š ¬±2¶«¨ ±ª
(Τηε Φιρστ Αφφιλιατεδ ηοσπιταλοφ Ηεννα Χολλεγε οφ ΤραδιτιοναλΧηινεσε Μεδιχινε, Ζηενγζηου wxssss, Χηινα)
[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε: ײ ¶·∏§¼ ²± ·«¨ µ¨ª∏¯¤·²µ¼ ° ¦¨«¤±¬¶° ²© ¬¯³¬§° ·¨¤¥²¯¬¶° §¬¶²µ§¨ µ¶¬± ·«¨ ¥¯²²§©¤·²©«¼³¨ µ¯¬³¨ °¬¤µ¤·
°²§¨ ¯º¬·«’ ¬¯√¨„±·¬«¼³¨ µ¯¬³¬§¨ °¬¤¦¤³¶∏¯ o¨ ¤±§§²¶¼¶·¨°¤·¬¦²¥¶¨µ√¤·¬²± ²± ·«¨ ©∏±¦·¬²±¶²©·«¬¶° §¨¬¦¬±¨²± ²¯º „±§«¬ª« §¨ ±¶¬·¼
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Μετηοδ : ײ ¶¨¯¨ ¦·≥⁄ µ¤·¤¶¬±√ ¶¨·¬ª¤·¨§¶∏¥­¨¦·q ׫¨ «¼³¨ µ¯¬³¨ °¬¤µ¤·°²§¨ ¶¯º µ¨¨ °¤§¨ º¬·« ©¨ §¨¬±ª«¬ª«2©¤·©²µ¤ª¨ ¤±§º µ¨¨ µ¤±2
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≈责任编辑 刘  
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第 vu卷第 y期
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中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλοφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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