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·¬√¨¯¼ ¯¨ ¶¶¨ ±¨ §¥¼·«¨ ³µ¨·µ¨¤·° ±¨·²© × ≤≤∞qΧονχλυσιον : × ≤≤∞ «¤¶«¨ ³¤·²³µ²·¨¦·¬√¨¤¦·¬√¬·¼ ¤±§·«¨ ° ¦¨«¤±¬¶°¶∏±§¨µ¯¼¬±ª¬·¶³µ²2
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[ Κεψ ωορδσ] ¬¯√ µ¨¬±∏µ¼ ~2y ~ × ≤≤∞~≤≤ w¯ ~ °¬¦¨
≈责任编辑 方文贤
黄芪对新生鼠乏氧缺血脑损伤
海马区神经保护作用的研究
贾瑞 t o蒋 犁t o乔立兴t o陈平圣u
kt q东南大学 临床医学院 o江苏 南京 utsss| ~ u q东南大学 基础医学院 病理科 o江苏 南京 utsss|l
≈摘要 目的 }探讨新生儿乏氧缺血脑损伤k
⁄l后 o脑细胞损伤的机制和黄芪对海马区的神经保护作用 ∀
方法 }用新生大鼠建立新生儿
⁄的模型 o于缺氧后不同时间点取脑 o分别行组织病理学检查并计数海马 ≤ t区
神经细胞死亡率 !半定量逆转录2聚合酶反应k ×2°≤ l检测 ¦¤¶³¤¶¨2vk天冬氨酸半胱氨酸蛋白酶2vl° 表达 !三
等分迷宫测试成熟大鼠学习记忆能力 ∀分 ≥«¤°组 !模型组 !黄芪治疗组观察并对比上述指标 ∀结果 }模型组结扎
侧海马 ¦¤¶³¤¶¨2v ° 表达于 后 y «轻度升高 ouw «达高峰 ow{ «后下降 ox §和 z §时恢复至基础水平 ∀黄芪
组 后结扎侧海马神经细胞死亡率明显降低 !¦¤¶³¤¶¨2v ° 的表达峰值降低了 ww h ∗ wy h k° l o成熟大鼠
的学习记忆能力明显提高 ∀结论 }黄芪对未成熟脑
⁄后海马部位有明显的神经保护功能 o此功能与抑制 ¦¤¶2
³¤¶¨2v的表达有关 ∀
≈关键词 脑缺氧 ~脑缺血 ~半胱氨酸蛋白酶 ~凋亡 ~黄芪
≈中图分类号 u{x qx ≈文献标识码 ≈文章编号 tsst2xvsukussvltu2ttzv2sw
围产期缺氧缺血脑损伤k
⁄l是造成新生儿
死亡 !智力低下及长期神经系统功能紊乱的一个重
要因素 ∀大脑边缘系统特别海马部位既是缺氧缺血
的易损区≈t o又是学习记忆的关键部位≈u ∀最新的
研究显示 }凋亡在未成熟脑
⁄的病理进程中起
着重要作用≈t ov o而 ¦¤¶³¤¶¨2vk天冬氨酸特异酶切的
半胱氨酸蛋白酶2vl是凋亡级链反应中的关键效应
子 o应用 ¦¤¶³¤¶¨ 抑制剂对
⁄具有神经保护功
能≈w ∀本研究将黄芪用于未成熟脑
⁄的治疗 o
一方面检测其对海马 后¦¤¶³¤¶¨2v ° 表达水
平的影响 o另一方面通过迷宫观察黄芪对
⁄的
成熟鼠学习记忆能力的影响 ∀此两方面将同时探讨
黄芪对未成熟脑
⁄近期 !远期的神经保护功能
≈收稿日期 ussv2sz2sz
≈基金项目 江苏省科委社会发展基金资助项目k
≥2|{sx{l
≈通讯作者 ר¯ }ksuxlvwtzs|y ∞2°¤¬¯}µ½¬¤|x|| ¼¤«²²q
¦²° q¦±
及保护机制 o为临床探索新生儿
⁄的治疗提供
实验依据 ∀
1 材料与方法
1 q1 材料
出生 z §的同窝 ≥ ⁄大鼠 o雌雄不限 o体重 tu ∗
tw ªo由复旦大学提供鼠种 o东南大学医学院实验动
物中心繁殖 ∀共 tu|只k造模过程中死亡 tx只l o随
机分成 v组 }假手术k≥«¤°l组 t{只 o模型组 w{只 o
黄芪治疗组 w{只 ∀按照 ¬¦¨≈x 方法制备
⁄模
型 }将新生鼠乙醚吸入麻醉后仰卧位固定 ∀颈正中
切口 o游离左侧颈总动脉 ow2s号线结扎 o恢复 u ∗ v
«后置于 u sss °密闭容器中 ovz ε 恒温 ∀以 u
#°¬±p t的速度输入 { h u o|u h u 混合气体 u «o
取出后置于原饲养环境中 ∀ ≥«¤°组仅游离左颈总
动脉但不结扎 ∀所有新生鼠均由母鼠代养 ∀
黄芪注射液由成都地奥九泓制药厂生产k批号
susvs|zl o规格为每支 ts °o含生药 us ª∀治疗组
幼鼠于造模后即刻及每日同一时间腹腔注射此药
#wztt#
第 u{卷第 tu期
ussv年 tu月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯ qu{ o¶¶∏¨ tu
⁄¨ ¦¨ °¥¨µoussv
s qs{ °≈y oz §后停药 ∀模型组于同时间腹腔注射
等量生理盐水 ∀ ≥«¤°组不给药 ∀
×µ¬°∏µ¨ ¶²¯¤·¬²± ¤¨ª¨ ±·购自冷泉港生物公司
k ²¦«¨ ⁄¬¤ª±²¶·¬¦¶ ≤²µ³q产品l ∀ פ¤ ¤
°≤ ¬·k ∂ l∂ µ¨qu qt为宝生物工程k大连l有限
公司产品 ∀ ≤¤¶³¤¶¨2v及 Β2¤¦·¬± ¦⁄ 引物由上海
申友生物技术公司合成 ∀其他试剂均为分析纯 ∀
1 q2 方法
1 q2 q1 组织病理检查 于 后 uw «ox §及假手
术后 uw «o将各组幼鼠断头取脑 o甲醛溶液固定后 o
沿丘脑中 trv平面行冠状位切块 o常规石蜡包埋 !切
片 o厚度 w Λ° o行苏木素2伊红k∞l染色 ∀每张切
片在结扎侧海马 ≤ t区取 v个不同视野k ≅ wssl o
计数每视野的存活神经细胞数≈w o并计算神经细胞
死亡率 ∀
神经细胞死亡率k h l tss h ≅ k≥«¤°组细胞数 p模型
组或治疗组存活细胞数lr≥«¤°组细胞数
1 q2 q2 ≤¤¶³¤¶¨2v ° 表达检测 于 后 y o
uw ow{ «ox oz §和假手术后 uw «o将各组幼鼠断头取
脑 o快速游离结扎侧海马 o用 ×µ¬°∏µ¨ ¶²¯¤·¬²±
¤¨ª¨ ±·提取其总 ∀测 ⁄值 Αuysr Αu{s均在
t qz 以上 ∀取 t Λª总 用 פ¤ ¤ °≤
¬·进行逆转录 o ¬¯ª² §× 为引物 o ∂ 为逆转录
酶 o体系 us Λowu ε 反应 vs °¬±合成 ¦⁄ 第 t
条链 ∀取逆转录产物 ts Λ为模板进行 °≤ 扩增 o
Β2¤¦·¬±作为内参照同时扩增 ∀ ≤¤¶³¤¶¨2v引物序列
为 x . 2× ≤ × ≤ × ≤≤ 2v . o x . 2
≤ × ≤ × × × × ≤ × × × ≤ ×2v. oΒ2¤¦·¬±引物序
列为 x. 2≤ × × ≤≤ × ≤ × × × ≤2v. ox. 2
≤≤ ≤ ≤ × ≤ × × ≤ ≤ × ≤2v. ∀循环条件 }
|w ε vs ¶oys ε vs ¶ozu ε t qx °¬±o共 u{个循环 ∀
扩增产物进行 t qz h琼脂糖凝胶电泳 o结果用 °¤ª¨
¤¶·¨µ∂ ⁄≥凝胶成像系统k美国 °«¤µ°¤¦¬¤
¬²·¨¦«
公司l对条带扫描和分析 ∀以 Β2¤¦·¬±为内参分别计
算¦¤¶³¤¶¨2v产物与 Β2¤¦·¬±产物吸光度积分的比值 ∀
1 q2 q3 三等分迷宫测试 大鼠至 |s日龄左右进行
实验 ∀三等分迷宫系改良的/ ≠0臂迷宫 ∀由 v支长
度相等的臂组成 o底部为可通电的铜棒 o臂的末端装
有小灯 ∀训练大鼠由暗臂k通电l跑向亮臂k断电l以
逃避电击k即为正确l ∀每次随机点亮一臂 ∀凡通电
时动物直接跑向安全区为正确反应 o反之为错误 ∀
达到学会标准为连续 ts次训练中有 |次正确 o记录
每一动物达标前所需测试数 o以此作为学习快慢的
客观指标 ∀uw «以后检测记忆保存情况 o即在连续
ts次测试中正确反应保持多少 o以记忆保持的百分
数表示 ∀
1 q2 q4 统计学处理 结果均用 ξ ? σ表示 o多个样
本均数间比较采用方差分析 o两两之间用 θ 检验 ~
两样本均数比较用 τ检验 ∀k≥≥ y qtu统计软件l
2 结果
2 q1 组织病理学检测脑损伤
≥«¤°组 }双侧海马区组织无水肿 !坏死 ~神经细
胞形态正常 o计数神经细胞数为k{z qz ? s qylr高倍
视野k°l ∀模型组 }uw «时结扎侧海马区水肿 o细
胞周围间隙增宽 o神经细胞数减少 oky{ q{ ? v qslr
° o与 ≥«¤°组比较差异有显著性k Π s qstl ∀退
变的神经细胞多数显示出凋亡的形态学特征 }胞浆
浓缩 o核质凝集 !分离包裹成多个圆形 !规则的蓝紫
色染色质块 o形成凋亡小体 ∀x §时结扎侧海马体
积缩小 o锥状细胞层紊乱 o神经细胞稀少 okw{ qz ?
u qulr° o与 ≥«¤°组及同侧 uw «时比较差异均有
显著性k Π s qstl ∀黄芪治疗组 uw «时海马区组
织水肿较模型组明显减轻 ox §时可观察到完整的
海马形态 o此两时间点神经细胞死亡率均较模型组
明显减低 o差异显著k Π s qst o图 tl ∀
图 t 模型组与黄芪治疗组 uw «ox §
结扎侧海马 ≤ t区神经细胞死亡率k ξ ? σ, ν yl
3 黄芪治疗组与模型组比较 Π s qst
2 q2 ≤¤¶³¤¶¨2v ° 的表达变化
≥«¤°组海马 ¦¤¶³¤¶¨2v ° 以低水平表达 o
为ks quus ? s qss|l ∀模型组结扎侧海马 ¦¤¶³¤¶¨2v
° 于 后逐渐升高 oy «时比 ≥«¤°组升高了
tt h o至 uw «时 ° 水平达高峰 o较 ≥«¤°组升
高了约 uys h o两者差异显著k Π s qstl o高峰持续
至 w{ «后下降 ox §和 z §时恢复基础水平 ∀黄芪治
疗组有与模型组相似的变化趋势 o但 uw «和 w{ «两
时间点使峰值降低了 ww h ∗ wy h o与模型组比较具
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第 u{卷第 tu期
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⁄¨ ¦¨ °¥¨µoussv
有统计学差异k Π s qst o图 ul ∀
2 q3 三等分迷宫试验结果
模型组新生鼠至成年时期k|s §l在三等分迷宫
中达到学会标准所需训练次数多于 ≥«¤°组 o而 uw
«后记忆保持率又低于 ≥«¤° 组 o差异均有显著性
kΠ s qstl ∀黄芪治疗组大鼠此两项指标均明显优
于模型组k Π s qstl o接近 ≥«¤° 组k Π s qsx o表
tl ∀
图 u 模型组与黄芪治疗组结扎
侧海马 ¦¤¶³¤¶¨2v ° 的表达量
q模型组
q黄芪治疗组 q⁄ ¤µ®¨ µ
t qy « u quw « v qw{ « w qx § x qz §
表 t 各组三等分迷宫中成熟鼠分辨学习能力
及记忆保持率k ξ ? σ, ν yl
组别 所需训练次数 uw«后记忆保持率r h
≥«¤°组 tw qz ? t qy {t qz ? tt qz
模型组 wx qz ? u qztl w{ qv ? tt qztl
黄芪组 ty qt ? u qxul {s qs ? | qsul
注 }与 ≥«¤°组比较 tl Π s qst 与模型组比较 ul Π s qst
3 讨论
本实验着重观察了海马 ≤ t区
⁄后的镜
下形态学改变 o发现未成熟脑海马 ≤ t区对 非
常敏感≈t o并且凋亡在其损伤过程中发挥着重要作
用 ∀ ≤ t区神经细胞在受到缺氧缺血这一较严重
的刺激时 o细胞死亡是一进行中的动态过程 o受损细
胞中仅少部分立即死亡 o而多数可能在 后推迟 u
∗ w §甚至更久才死亡 ∀此迟发性神经元死亡
k⁄⁄o§¨ ¤¯¼¨ §±¨ ∏µ²±¤¯ §¨¤·«l的现象在国内外的研
究中都有发现≈z o{ ∀ ⁄⁄的现象为挽救受损神经
元提供了治疗的时机 o更提醒应在新生儿
⁄的
治疗中 o既要重视早期及时抢救 o又不能忽视晚期海
马的 ⁄⁄∀
凋亡在未成熟脑
⁄的病理进程中起着重要
作用≈t ov o凋亡的最后过程是通过 ¦¤¶³¤¶¨¶的激活而
实现的 ∀其中¦¤¶³¤¶¨2v是参与凋亡的 ¦¤¶³¤¶¨ 级链
反应的最终效应子 o在蛋白酶级链切割过程中处于
核心位置 ∀在本研究中观察到 }
⁄时结扎侧海
马¦¤¶³¤¶¨2v ° 表达于 后 y «时轻度升高 o
uw ∗ w{ «时达峰值 ox ∗ z §时恢复基础水平 ∀与
¤®¤¬°¤≈t 和 ¤µµ¬¶²±≈| 的研究结果一致 ∀ ≤¤¶2
³¤¶¨2v参与了未成脑
⁄的病理进程 o并且其表
达的区域及时程与凋亡的发生相对应≈| o因此在其
高峰k后 uw ∗ w{ «l出现前给予适当的干预措施 o
才能尽可能多的挽救受损神经细胞 o而且此干预应
一直持续至其恢复正常表达k后 z §l ∀
学习记忆是脑的高级功能 o大脑边缘系统特别
海马是学习记忆的关键部位 ∀海马 ≤ t区是
⁄
时的易损区≈t o受损伤后将引起脑发育过程中功能
和行为的异常≈u o所以未成熟脑
⁄必然导致学
习记忆功能的改变 ∀本实验中通过三等臂辐射状 ≠
形迷宫检测
⁄的大鼠远期学习记忆能力的改
变 o结果显示模型组大鼠 |s日龄时 o仍表现出分辨
学习和记忆能力较 ≥«¤°组大鼠显著下降 o与前人
的研究结果一致≈u ∀黄芪是我国的传统中药 o最新
研究显示 }黄芪可通过减轻兴奋性氨基酸的释放及
在细胞间的堆积 o缓解 ≤¤u n超载 o抗氧化≈ts 等机制
抑制凋亡的发生 ∀本研究将黄芪用于治疗未成熟脑
⁄o从病理学检测 o¦¤¶³¤¶¨2v 转录水平的表达和
迷宫检测学习记忆能力 v个方面观察黄芪对海马区
的疗效 ∀结果显示 }海马 ≤ t区神经细胞死亡率 !
结扎侧海马¦¤¶³¤¶¨2v ° 表达峰值均明显降低 o
提示黄芪能有效的抑制未成熟脑
⁄后海马区神
经细胞的凋亡 o提高神经细胞存活率 o而且其神经保
护机制与抑制 ¦¤¶³¤¶¨2v的表达有关 ∀从远期疗效
可看出 }黄芪能明显改善未成熟脑
⁄引起的学
习记忆能力的降低 ∀
本实验表明 }黄芪对未成熟脑
⁄后海马部
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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⁄¨ ¦¨ °¥¨µoussv
位具有明显的神经保护功能 o其神经保护作用与抑
制 ¦¤¶³¤¶¨2v 的表达有关 o特别是能减少未成熟脑
⁄后 ⁄⁄所致的学习能力的降低 ∀
≈参考文献
≈t ¤®¤¬°¤ • o¶«¬§¤ o¤±ª¨ ≥ q ³²³·²¶¬¶¤¶¤ °µ²¯²±ª§¨
²¯¨¬± ·«¨ ¨ ∏µ²§¨ ª¨ ±¨ µ¤·¬²± ¤©·¨µ ¼³²¬¬¦¶¦«¨ °¬¤ ¬± ·«¨
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血两因素析因研究 q中华儿科杂志 ot||{ ovykzl }ws{ q
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Ηψποξια2ισχηεµια Βραιν ∆αµ αγειν Νεοναταλ Ρατ Ηιπποχαµ πυσ
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σιον : ¶·µ¤ª∏¯∏¶°¨°¥µ¤±¨ ¤¦¨∏¶«¤¶¤¶·µ²±ª³µ²·¨¦·¬√¨ ©¨©¨ ¦·²± ±¨ ∏µ²±¤¯ §¤°¤ª¨ ¬±·«¨ ¬°°¤·∏µ¨ µ¤·«¬³³²¦¤°³∏¶oº«¬¦«¬¶µ¤¯¤·¨§
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[ Κεψ ωορδσ] ¦¨µ¨¥µ¤¯ ¤±²¬¬¤~¦¨µ¨¥µ¤¯ ¬¶¦«¨ °¬¤~¦¤¶³¤¶¨ ~¤³²³·²¶¬¶~¤¶·µ¤ª∏¯∏¶°¨°¥µ¤±¨ ¤¦¨∏¶
≈责任编辑 方文贤
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