全 文 ：疏血通注射液抗栓 !溶栓作用机制的研究
张 璇u 3 o肖 兵t o胡长林t
kt1 重庆医科大学 附属第二医院 o重庆 wsssts ~u1济宁市第一人民医院 o山东 济宁 uzusttl
≈摘要  目的 }探讨疏血通注射液对在体和体外培养的脑组织微血管内皮细胞k¥µ¤¬± °¬¦µ²√¤¶¦∏¯¤µ ±¨§²·«¨ ¬¯¤¯
¦¨¯¯ o…∞≤l分泌组织型纤溶酶原激活物k·¬¶¶∏¨ ³¯¤¶°¬±²ª¨²± ¤¦·¬√¤·²µo·°„l的影响 ∀方法 }≠在体实验中大鼠随机分为
v组 }假手术组 !局灶脑缺血组 !疏血通注射液治疗组 ∀治疗 x §后取脑组织标本 o用 • ×2°≤• 测脑组织·°„ °• ‘„的
表达 o发色底物法测脑组织·°„的活性 ~ 体外实验 }培养鼠脑微血管内皮细胞 o分实验组和对照组 o试验终点 o收集
细胞及细胞上清液 o用 • ×2°≤• 方法检测培养细胞中·°„ °• ‘„ 的表达 o发色底物法测细胞上清液中·°„ 的活性 ∀
结果 }疏血通治疗组脑组织和疏血通干预组细胞·°„ °• ‘„的表达及·°„的活性均明显高于对照组 ∀结论 }疏血通
注射液可促进脑组织及 …∞≤ 分泌·°„ o增强纤溶活性 ∀
≈关键词  疏血通注射液 ~脑缺血 ~脑微血管内皮细胞 ~组织型纤溶酶原激活剂
≈中图分类号  • u{x1x ≈文献标识码  „ ≈文章编号  tsst2xvsukussxluw2t|xs2sv
≈收稿日期  ussw2s|2uu
≈基金项目  重庆市医学科学研究资助项目ksv2u2tyyl
≈通讯作者  3张璇 oר ¯ }ksxvzluuxvwyxo∞2°¤¬¯}¶§­±½¬{{tƒ·²°1¦²°
疏血通注射液是动物类中药复方制剂 o以水蛭 !
地龙组方 o经低温提取 !膜分离等先进工艺精制而
成 o临床用于治疗血栓性心 !脑血管疾病有较好的疗
效 ∀本实验通过体内 !外实验对疏血通注射液促进
脑微血管内皮细胞分泌组织型纤溶酶原激活剂的影
响进行了探讨 o以阐明其抗栓 !溶栓的作用机制 ∀
1 材料
111 动物与分组 ≥⁄大鼠 o体重 uvs ∗ vss ªo雌雄
不拘 o≥°ƒ级 o由重庆医科大学实验动物中心提供 o
合格证号 ≥≤÷Žk渝lussusssv ∀体内实验随机分 v
组 }假手术组 !局灶脑缺血对照组 !脑缺血疏血通治
疗组 o每组 tw只大鼠 ∀体外实验中所用新生 t ∗ x §
的 ≥⁄大鼠 ∀培养细胞分对照组及疏血通干预组 ∀
112 药物与试剂 疏血通注射液原液由牡丹江友
博药业研制 o实验中所用的系原液经采用低温冷冻
抽干技术制备的 ts 倍的浓缩液k含生药 vus °ª#
°ptl ∀一步法 • ×2°≤• k ∂l试剂盒由上海生物
工程公司提供 ~华舜 • ‘„ 提取试剂盒 o引物由上海
捷倍思公司合成 ∀组织型纤溶酶原激活剂 k·°„l活
性测定试剂盒 o上海太阳生物技术公司 ∀
2 方法
211 局灶性脑缺血模型制作及处理方法 采用自
体血栓大脑中动脉闭塞模型 o制作方法详见文献
≈t  ∀动物苏醒后按 …¨ §¨µ¶²±评分标准≈u 立即进行
神经功能缺失评分 o有体征者入选 ∀疏血通治疗组
于造模后 v «内经尾静脉注入疏血通注射液浓缩液
s1ux °#®ªpt o以后每天 t次连续用 x §~假手术组
及局灶脑缺血对照组给予等量生理盐水治疗 ∀实验
终点 o迅速断头取脑 o取病灶周围脑组织 tss °ª用
于提取总 °• ‘„ ∀剩余的用于·°„ 活性的检测 o按
ׅ≥与脑组织的比例为 t °Βvss °ªo加入含有 t h
的 ×µ¬·²±÷2tss的 s1sx °²¯#pt的 ׅ≥ o迅速匀浆 o匀
浆液离心 ts sss ≅ γ#°¬±pt ow ε ovs °¬±o取上清液
分装存放于 p zs ε 冰箱中备用 ∀
212 鼠脑微血管内皮细胞原代和传代培养及处理
方法 参考文献≈v 方法并稍作改进 ∀取新生的
t ∗ x §的 ≥⁄大鼠大脑皮质 o小心收集毛细血管段 o
s1t ϕ的 º 型胶原酶 vz ε 水浴中振荡消化 us °¬±o
离心弃上清 ∀加入含 tx h胎牛血清 !青霉素 tss ˜#
°pt !链霉素 tss ˜#°pt的 t||完全培养液 o转入
tss °玻璃培养瓶进行细胞原代培养 o待细胞生长
z ∗ | §o呈现典型的/铺路卵石0现象时 o再用 s1ux h
的胰蛋白酶k含 s1su h的 ∞⁄ׄl消化 o按 tΒu比例进
行传代培养 ot «换液 ∀倒置显微镜下观察 o细胞呈
多边形 !三角形 o核呈圆形 ∀用八因子相关抗原抗体
作免疫细胞化学鉴定脑微血管内皮细胞k…∞≤l o第
v代细胞经过传代和纯化 |x h以上为 …∞≤ o可用于
实验 ∀按同源相同数量 o传代培养第 v代 o接种密度
#sx|t#
第 vs卷第 uw期
ussx年 tu月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂²¯1vs oŒ¶¶∏¨ uw
⁄¨ ¦¨ °¥¨µoussx
v ≅ tswr°o接种于 uw孔培养板中 o置 vz ε ox h ≤’u
培养箱孵育 o…∞≤长至第 y天基本融合时 o用 °…≤
冲洗 u次 o换成基础培养液 t||k无血清l o干预组
加入疏血通注射液k每孔 uss ˏ培养液加 us ˏtΒ
ty稀释含量的疏血通浓缩液l o而对照组加入生理
盐水 us ˏo孵育 zu «后 o将上清液分装 op zs ε 保
存用于·°„活性的检测 o收集细胞用于总 °• ‘„ 的
提取和 • ×2°≤• ∀
213 总 • ‘„提取与引物合成 取新鲜脑组织 tss
°ª及 t ≅ tsy个 …∞≤ o按照华舜柱式提取试剂说明
书分别进行脑组织及培养细胞总 • ‘„的提取 o经电
泳定性并由紫外分光光度仪定量后 p zs ε 冻存备
用 ∀·2°„和内参 Β2¤¦·¬±引物根据 Š¨ ±¨ ¥¤±®中所提
供的基因序列自行设计 o引物由上海捷倍思基因技
术公司合成 ∀·°„ 上游引物 }x. 2„„≤≤„×≤„≤Š„Š2
≤„„≤„×2v o下游引物 }x. 2„ŠŠ≤Š×„×≤××≤׊׊Š„2
v. o扩增长度为 vsx ®¥~Β2¤¦·¬±上游引物 }x. 2Š≤„≤2
≤„≤„≤≤××≤ׄ≤„„׊2v. o下游引物为 }x . 2Š≤≤„2
Š„Š≤„Š×„„×≤×≤≤××2v. o扩增长度为 zsx ®¥∀
214 ·°„及 Β2¤¦·¬²±基因表达采用逆转录2聚合酶链
式反应k• ×2°≤• l方法 按照  ∂ 说明书将 ¦⁄‘„
逆转录与 °≤• 扩增在 ¥¬²°¨ ·µ¤ ׳¨µ¶²±¤¯ °≤• 仪中一
步法进行 ∀反应液配制 }ux ˏu ≅ • ×2°≤• ¥∏©©¨µots
ˏª≤¯ u ow ˏ模板 • ‘„ o上 !下游引物各 t ˏ 2
∂ • ×rפ´ ⁄‘„聚合酶混合物 t ˏo加去除 • ‘„ 酶
的无菌双蒸水至 xs ˏ∀反应条件 }v{ ε 逆转录 ux
°¬±o|w ε u °¬±使逆转录酶失活 o|w ε 变性 us ¶oxz
ε 退火 vs ¶ozu ε 延伸 t °¬±o·°„°• ‘„ 扩增 ws循
环 o而 Β2¤¦·¬²±°• ‘„ 需扩增 x{个循环 o全部循环结
束后于 zu ε 延伸 ts °¬±∀取 • ×2°≤• 产物 y ˏk含
溴酚蓝 t ˏl在电压 {1x ∂#¦°pt下进行 u h琼脂糖
凝胶电泳 o结果在紫外灯 下观 察 !照相 o经
Š¨ 1¯⁄²¦tss 型成像仪输入计算机 o·°„ oΒ2¤¦·¬± 的
• ×2°≤• 产物经凝胶电泳分离 o均只有 t个条带 o凝
胶图象分析仪计算其分子质量分别为 vsx ¥³ozsx
¥³o与预期长度相吻合 o确认二者均为特异性条带 o
以内参 Β2¤¦·¬²±吸光度值进行标准校正 o计算·°„的
相对量 ∀
·°„相对量 €·°„产物电泳条带密度rΒ2¤¦·¬±产物电泳条
带密度
215 ·°„活性的测定采用发色底物方法 每一步
骤严格按说明书操作 o比色在 Žvt酶标仪上 wsx
±°处 o以空白对照孔调零后测定各空 Α值 o自动打
印结果 ∀分别以 Αwsx对·°„标准品含量在普通坐标
纸上作标准曲线 o待测标本的活性从标准曲线上查
出 ∀
216 统计方法 结果采用 cξ ? σ表示 o统计采用
≥°≥≥ ts1s统计学软件包分析 o三组间比较采用单因
素方差分析中 ²±¨ 2 • ¤¼2„‘’∂ ≠ 方法统计 o其中两两
比较采用 ≥·∏§¨±·2‘¨º°¤±2®¨ ∏¯¶方法 ∀
3 结果
311 ·°„ oΒ2¤¦·¬±的 • ×2°≤• 产物经凝胶电泳分离 o
均只有 t个条带 o凝胶图象分析仪计算其分子质量
分别为 vsx ozsx ¥³o与预期长度相吻合 o确认二者均
为特异性条带 ∀
312 脑组织中·°„ °• ‘„ 表达及活性k见表 tl 结
果显示局灶脑缺血对照组·°„ °• ‘„表达及·°„活
性与假手术组比较无统计学差异 oЁ s1sx ~而疏血
通治疗组脑组织中无论是·°„ °• ‘„ 表达还是·°„
活性均显著高于局灶脑缺血的对照组 oΠ s1st ∀
313 培养细胞中·°„ °• ‘„表达及活性k见表 tl
结果表明 o疏血通干预组培养细胞中·°„ °• ‘„ 的
表达明显增强 o其细胞培养液中·°„ 的活性亦明显
高于生理盐水处理的对照组k Π s1stl ∀
表 t 疏血通注射液对脑组织·°„°• ‘„表达及
活性的影响kcξ ? σ, ν € twl
分组 剂量 ·°„°• ‘„
表达r h
·°„活性
r˜#pt
体内实验
假手术组 p s qxu ? s qsx s qx| ? s qtw
局灶脑缺血组 p s qys ? s qsx s qy| ? s qtx
疏血通治疗组 {s °ª#®ªpt t qyx ? s qt{ t qyt ? s quytl
体外实验
空白对照组 p s qyx ? s qs{ t q{z ? s qtx
疏血通干预组 us °ª#°pt s qu{ ? s qsu s qw{ ? s qsuul
注 }与脑缺血对照组比较tl 1  s1st ~与空白对照组比较ul 1 
s1st
4 讨论
机体凝血 !纤溶系统功能的平衡是维持血液畅
通的基础 o凝血功能增强或r和纤溶功能下降都可导
致血栓性疾病 ∀近年来的研究表明≈w ox  o脑梗死患
者体内存在着严重的血管内皮功能损害及纤溶活性
的显著降低 o这是导致脑血栓形成的主要原因 ∀
·°„主要由血管内皮细胞分泌 o它对纤溶酶原
的精氨酸kxysl2缬氨酸kxytl肽键有特异性裂解作
用 o使纤溶酶原转化为纤溶酶 o启动纤溶系统 o促使
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第 vs卷第 uw期
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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⁄¨ ¦¨ °¥¨µoussx
血栓溶解 ∀·°„的活性变化直接影响纤溶系统的功
能 o·°„ 活性降低 o则纤溶功能下降 o可促使血栓形
成和发展 o而增强·°„的活性可促使血栓溶解 ∀脑
缺血可诱发·°„ 蛋白表达 o在脑缺血 y «左右呈高
表达 o以后逐渐下降 ot{ «即可恢复正常≈y  ∀
本研究结果发现缺血组脑组织·°„°• ‘„ 表达
和活性与假手术组比较无显著差异 o说明·°„ 基因
是一种即刻早期反应性基因 o出现时间相对较早≈z  o
在脑缺血后第 x天对·°„ 表达的诱导作用已不显
著 ∀而疏血通治疗组·°„°• ‘„ 表达和活性明显高
于缺血对照组 o同时疏血通干预组·°„°• ‘„表达和
活性亦明显高于空白对照组 o说明疏血通注射液可
促进体内 !外微血管内皮细胞分泌·°„ o促进·°„°•2
‘„的表达 o从而增强纤溶活性 ∀
疏血通注射液是传统中药水蛭与地龙的精制萃
取液 o其有效成分为水蛭素和蚓激酶样物质 ∀天然
水蛭素是从水蛭及其唾液中提取的活性成分 o是凝
血酶特异性抑制剂≈{  ~天然蚓激酶是从地龙中提取
的具有纤溶活性的多酶组分 o蚓激酶有类·°„ 的作
用 o与纤维蛋白有特殊的亲和力 o与纤维蛋白结合后
可使其迅速降解 o有很强的纤溶作用≈|  ∀疏血通注
射液自应用于临床以来 o发现其对血栓性疾病具有
明显的抗凝 !溶栓作用 o但其具体作用靶点未完全阐
明 ∀本实验发现 o疏血通注射液能显著促进体内 !外
脑血管内皮细胞分泌·°„ o通过·°„表达的增加及活
性的增强使纤溶功能得到加强 o从而促进血栓的溶
解 o这可能是其抗栓 !溶栓的主要作用机制之一 ∀
≈参考文献 
≈t  张 璇 o胡长林 q疏血通注射液对局灶脑缺血大鼠的治疗作
用 q中国新药与临床 oussx ouwkxl }vwt q
≈u  …¨ §¨µ¶²± …o°¬·¶‹ o‘¬¶«¬°∏µ¤ ¨o ετ αλ. •¤·°¬§§¯¨¦¨µ¨¥µ¤¯
¤µ·¨µ¼ ²¦¦¯∏¶¬²±} √¨¤¯∏¤·¬²±²©·«¨ °²µ§¨¯¤±§§¨ √¨ ²¯³° ±¨·²©±¨ ∏µ²¯²ª2
¬¦ ¬¨¤°¬±¤·¬²±q Στροκε , t|{y otz }wzu q
≈v  吴文斌 o胡长林 o汤为学 q大鼠脑皮质微血管内皮细胞的培
养 q重庆医科大学学报 oussu ouzkul }txt q
≈w  王元业 o王 峰 o李林文 o等 q脑梗死患者血浆·°„活性 o⁄2二
聚体含量变化和临床意义 q神经疾病和精神卫生 oussv ovktl }
zs q
≈x  姜建东 o吴惠毅 o吴芳平 o等 q急性脑梗死患者·°„ 和 °„Œ2t
水平的临床分析 q齐齐哈尔医学院学报 oussu ouvktl }y q
≈y  潘 涌 o谢 勉 o郑素秋 o等 q大鼠脑缺血后脑组织 ·°„ 和
°„Œ2t蛋白的表达 q神经解剖学杂志 ousss otykul }tut q
≈z  潘 涌 o郑素秋 o谢 勉 o等 q局灶性脑缺血后鼠脑组织·°„
基因表达及其与细胞凋亡 q解剖学报 ousss ovtktl }tx q
≈{  陈华友 o黄 静 o蒋芝君 o等 q抗凝良药水蛭素的研究进展 q
生物学通报 oussv ov{kvl }v q
≈|  ¬«¤µ¤ ‹ o≥∏°¬‹ o ≠²±¨ ·¤ × o ετ αλ. „ ±²√¨ ¯©¬¥µ¬±²¯¼·¬¦ ±¨½¼°¨ ¬¨2
·µ¤¦·¨§©µ²°·«¨ ¤¨µ·«º²µ° o Λυµβριχυσρυβελλυσq ϑπν ϑ πηψσιολ, t||t o
wt }wyt q
Στυδψιν τηε µεχηανισµ οφ Σηυξυετονγ ινϕεχτιον ον αντιτηροµ βοσισ
ανδ τηροµ βολψσισ
‹„‘Š ÷∏¤±o ÷Œ„’ …¬±ªo ‹˜ ≤«¤±ª2¯¬±
( Τηε Σεχονδ Αφφιλιατεδ Ηοσπιταλ οφ Χηονγθινγ Υνιϖερσιτψ οφ Μεδιχαλ Σχιενχεσ , Χηονγθινγ wsssts , Χηινα)
[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε : ײ¶·∏§¼·«¨ ©¨©¨¦·²©≥«∏¬∏¨·²±ª¬±­¨¦·¬²± ²± ¦¨µ¨¥µ¤¯ ·¬¶¶∏¨ ¤±§¥µ¤¬± °¬¦µ²√¤¶¦∏¯¤µ ±¨§²·«¨ ¬¯¤¯ ¦¨¯¯k…∞≤l
¬± ¶¨¦µ¨·¬±ª·¬¶¶∏¨2·¼³¨ ³¯¤¶°¬±²ª¨ ± ¤¦·¬√¤·²µk·°„l q Μετηοδ : ≠ ׫¨ ¬¨³¨µ¬° ±¨·ιν ϖιϖο º¤¶§¨¶¬ª±¨ §©²µ·«µ¨¨ ªµ²∏³¶}¶«¤°2²³¨µ¤·¬²±
ªµ²∏³o©²¦¤¯ ¦¨µ¨¥µ¤¯ ¬¶¦«¨ °¬¤ °²§¨¯ªµ²∏³o≥«∏¬∏¨·²±ª¬±­¨¦·¬²±2·µ¨¤·¨§ªµ²∏³q׫¨ ª¨ ±¨ ¬¨³µ¨¶¶¬²± ¤±§·«¨ ¤¦·¬√¬·¼ ²©·°„ ²± ¥µ¤¬±¶º µ¨¨
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…∞≤ º µ¨¨ §¬√¬§¨§¬±·² ¬¨³¨µ¬° ±¨·¤¯ ªµ²∏³¤±§¦²±·µ²¯ ªµ²∏³q׫¨ ≥«∏¬∏¨·²±ª¬±­¨¦·¬²± º µ¨¨ ¤§§¨§¬±·² ¬¨³¨µ¬° ±¨·¤¯ ªµ²∏³¤±§·«¨ …∞≤¶
¬±·«¨ ¬¨³¨µ¬°¤·¤¯ ªµ²∏³¶º µ¨¨ ·µ¨¤·¨§©²µuw «q׫¨ ª¨ ±¨ ¬¨³µ¨¶¶¬²± ¤±§·«¨ ¤¦·¬√¬·¼ ²©·°„ ²± ¦∏¯·∏µ¨§…∞≤ º µ¨¨ §¨·¨¦·¨§¥¼ • ×2°≤• ¤±§
¦«µ²°²ª¨ ±¬¦¶∏¥¶·µ¤·¨ ¤±¤¯¼¶¬¶µ¨¶³¨¦·¬√¨¯¼ q Ρεσυλτ : ׫¨ ª¨ ±¨ ¬¨³µ¨¶¶¬²± ¤±§·«¨ ¦²±·¨±·²©·°„ ²± ¥²·«¦¨µ¨¥µ¤¯ ·¬¶¶∏¨ ¤±§…∞≤ ¬±·«¨ ¬¨2
³¨µ¬°¤·¤¯ ªµ²∏³¶º µ¨¨ ¶¬ª±¬©¬¦¤±·¯¼ «¬ª«¨µ·«¤±·«¤·¬±·«¨ ¦²±·µ²¯ ªµ²∏³¶qΧονχλυσιον : ≥«∏¬∏¨·²±ª¬±­¨¦·¬²±¦²∏¯§¤¦¦¨¯¨µ¤·¨ ¶¨¦µ¨·¬²± ²©·°„ o
¤±§·«¨µ¨©²µ¨ ±¨«¤±¦¨ ©¬¥µ¬±²¯¼¶¬¶q
[ Κεψ ωορδσ] ≥«∏¬∏¨·²±ª¬±­¨¦·¬²±~¦¨µ¨¥µ¤¯ ·¬¶¶∏¨ ~¥µ¤¬± °¬¦µ²√¤¶¦∏¯¤µ ±¨§²·«¨ ¬¯¤¯ ¦¨¯¯¶~·¬¶¶∏¨2·¼³¨ ³¯¤¶°¬±²ª¨ ± ¤¦·¬√¤·²µ
≈责任编辑 古云侠 
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第 vs卷第 uw期
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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