全 文 ：骨碎补提取物促小鼠成骨细胞株
≤v×v2∞t细胞增殖 !分化和钙化作用的研究
唐 琪t o陈莉丽t o严 杰u 3
kt q浙江大学 医学院 附属第二医院口腔科 o浙江 杭州 vtsss| ~
u q浙江大学 医学院 病原生物学教研室 o浙江 杭州 vtsssyl
≈摘要  目的 }探讨中药骨碎补有无促进成骨细胞增殖 !分化和钙化的作用 ∀方法 }制备骨碎补的水 !醇提取液 ∀
小鼠成骨细胞株 ≤v×v2∞t作为药物筛选的细胞模型 ~用 ××法和流式细胞术测定不同浓度的骨碎补水 !醇提取液的
促细胞增殖作用 ~采用 „°活性和骨钙素定量检测分别观察上述药物提取液的促细胞分化作用 ~以 ∂²± ®²¶¶¤钙化染
色法了解上述药物提取液的促细胞钙化作用 ∀结果 }s qst ot °ª#pt骨碎补水提液能促进 ≤v×v2∞t 细胞数量增加k Π
s qsxl ~s qst ot °ª#pt骨碎补水提液和醇提液能使 ≥期细胞百分率升高 !Št期细胞百分率减少 ~t otss °ª#pt骨碎补醇
提液能使细胞 „°的活性升高k Π s qsxl ~tss °ª#pt骨碎补醇提液能明显促进细胞骨钙素合成和分泌k Π s qsstl ~t
°ª#pt骨碎补水提液及 s qst °ª#pt骨碎补醇提液均可促进细胞钙化k Π s qsxl ∀结论 }骨碎补水相和醇相提取物中
分别存在有较高活性的促成骨细胞增殖 !分化和钙化的物质 ∀
≈关键词  骨碎补 ~成骨细胞 ~增殖 ~分化 ~钙化
≈中图分类号  • u{x qx ≈文献标识码  „ ≈文章编号  tsst2xvsukusswlsu2styw2sx
骨代谢是成骨细胞和破骨细胞的动态平衡过
程 o该平衡的失调将引发骨代谢性疾病≈t  ∀牙周炎
是各国人群中最为常见的口腔疾病之一 o我国约有
zs h的人群患有各种牙周炎≈u  ∀牙周炎主要的病理
改变是牙周袋形成和牙槽骨吸收 o导致牙松动甚至
脱落≈u  ∀牙槽骨是人体骨骼中代谢最活跃的组织 ∀
正常生理情况下 o成骨细胞和破骨细胞的平衡维持
着牙槽骨代谢的稳定≈v  ∀牙周感染时细菌内毒素及
多种炎性因子诱导破骨细胞活化 !增殖 o抑制成骨细
胞活性 o牙槽骨代谢平衡失调 o出现病理性牙槽骨吸
收≈w  ∀至今临床上不能根治牙周炎的主要原因之一
是无效果良好的阻断牙槽骨吸收或促进牙槽骨再生
的药物≈x  ∀中药骨碎补是中医骨伤科方剂中常用的
主药 o具有促进骨折愈合 !强骨补肾的功效 o但其作
用机制不明≈y  ∀本文以小鼠成骨细胞株 ≤v×v2∞t
为细胞模型 o研究了骨碎补水提液和骨碎补醇提液
对成骨细胞增殖 !分化 !钙化的影响 ∀
1 材料与方法
≈收稿日期  ussv2sy2uz
≈基金项目  浙江省科技厅资助项目k||ttsvttxl
≈通讯作者  3严杰 oר¯ }ksxztl{zutzv{x oƒ¤¬}ksxztl{zutzsww{ o
∞2°¤¬¯}¼¤±¦«¨ ±ƒ °¤¬¯q«½q½­q¦±
1 q1 细胞株及培养
小鼠成骨细胞株 ≤v×v2∞t由本校医学院病原
生物学教研室提供 o培养液为含 ts h k ςrςl 胎牛
血清的 Α2∞k‹¼¦¯²±¨ l ∀
1 q2 实验药品
粉碎的骨碎补k产自安徽 o本校药学院生药学教
研室李士敏副教授鉴定符合药典规定l和蒸馏水或
|x h乙醇 tΒts混合 o沸水回流 x «∀收集提取液 o粗
滤后残渣再次沸水回流 v «∀合并两次提取液 o旋转
蒸发浓缩 o所得骨碎补水提液和骨碎补醇提液浓度
均为 v ®ª#pt ∀x ª#pt ××液k„°µ¨¶¦²l ∀含 s qx h
‘°2wsk„°µ¨¶¦²l的 xs °°²¯#pt ×µ¬¶2‹≤¯ k³‹ z qwl的
细胞裂解液 ∀ts h胎牛血清的 Α2∞ 培养基中含
有 xs °ª#pt抗坏血酸和 u °°²¯#ptΒ2甘油磷酸钠
的 ∂²± ®²¶¶¤钙化液 ∀含 x h硫酸铝和 s qt h核固红
的 ∂²± ®²¶¶¤染液 ∀tuxŒ2骨钙素放射免疫检测试剂盒
购自北京中国原子能科学研究院同位素研究所 ∀
1 q3 实验分组和处理
ts h胎牛血清Α2∞ 或 t h牛血清白蛋白无血
清 Α2∞k仅用于骨钙素检测l中加入骨碎补水提液
或醇提液 o使其终浓度分别为 s qst ot otss °ª#pt ∀
在不同培养容器中接种细胞后 ox h ≤’u 中 vz ε 预
#wyt#
第 u|卷第 u期
ussw年 u月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂²¯ qu| oŒ¶¶∏¨ u
ƒ ¥¨µ∏¤µ¼oussw
培养 uw «∀实验分组 }≠水提液试验组 ~醇提液试
验组 ~≈水提液对照组 ~…醇提液对照组 ∀各试验组
分别用上述含不同终浓度的骨碎补水提物或醇提物
的细胞培养液换液 o各对照组分别用含相应量蒸馏
水或无水乙醇的等量 ts h胎牛血清 Α2∞ 换液 ouw
«换液 t次 o连续 v §∀除细胞增殖周期测定外 o各试
验组不同药物浓度及相应对照组在其余检测指标中
均重复 y孔 ∀
1 q4 检测指标
1 q4 q1 细胞增殖效应检测 采用 ×× 法检测细胞
增殖效应≈z  ∀ |y 孔板中每孔接种 t ≅ tsz # pt
≤ v×v2∞t细胞 ∀终止药物作用后 o各孔细胞用
s qst °²¯#pt ³‹ z qw的 °…≥洗涤 u次 o加入 uss ˏ
无血清 Α2∞ 培养液和 us ˏ××液 ovz ε 继续培
养 w «o用 txs ˏ二甲基亚砜换液 o检测各孔 w|s ±°
波长的吸收度 ∀
1 q4 q2 细胞增殖周期测定 培养瓶中定量接种 t ≅
ts{#pt ≤v×v2∞t细胞 ∀终止药物作用后 o各孔细
胞用上述 °…≥洗涤 u次 ozs h乙醇 w ε 固定 uw «ous
°ª#pt • ±¤¶¨ vz ε 消化 vs °¬±后 xs °ª#pt碘化丙
啶室温染色 u °¬±oo然后用流式细胞仪检测细胞增
殖周期≈{  ∀
1 q4 q3 碱性磷酸酶k„°l活性测定 uw孔板每孔
接种 t ≅ tsz#pt ≤v×v2∞t细胞 ∀终止药物作用后 o
每孔加 t °细胞裂解液冰浴 vs °¬±o收集上清用全
自动生化分析仪测 „°活性 ∀
1 q4 q4 骨钙素k’≤l检测 uw孔板每孔接种 t ≅ tsz
#pt ≤v×v2∞t细胞 o预培养 uw «后更换含 t h牛血
清白蛋白的无血清 Α2∞ ∀终止药物作用后 o分别
于第 v oy o| otu 天收集培养上清 o用tuxŒ2骨钙素放射
免疫检测试剂盒检测样本中骨钙素浓度 ∀
1 q4 q5 细胞钙化程度检测 采用 ∂²± ®²¶¶¤钙化染
色法≈|  ∀y孔板每孔接种 t ≅ ts{#pt ≤v×v2∞t细
胞 ∀终止药物作用后 o各孔细胞用 ∂²± ®²¶¶¤钙化液
换液 o隔天 t次 o末次换液 u §后终止培养 o∂²± ®²¶¶¤
钙化染色法进行染色 ∀ ‹°Œ„≥2tss高清晰度彩色病
理图文报告分析系统计算各样本的钙化面积百分
比≈ts  ∀
1 q5 统计学处理
应用 ≥°≥≥软件kts qs版本l进行方差分析 ∀
2 结果
2 q1 ××法检测结果
与相应对照组比较 ot和 s qst °ª#pt骨碎补水
提液能促进 ≤v×v2∞t细胞增殖k Π s qsxl otss °ª#
pt骨碎补水提液和各浓度骨碎补醇提液均未显示
促细胞增殖效应k Ё s qsx o表 tl ∀
表 t 不同浓度骨碎补提取液作用的  ≤v×v2∞t
细胞 ××法吸收度 Αw|sk ξ ? σ, ν € yl
组别 药物浓度r°ª#pt 吸收度
水提液 s qst s qw{x{ ? s qsy{ttl
t s qxtuy ? s qsxxwtl
tss s qv||u ? s qsw{z
对照组k水l s qv{ss ? s qstwt
醇提液 s qst s qv||u ? s qsyuv
t s qwvsw ? s qs{us
tss s qwuuu ? s qsy|v
对照组k醇l s qvzuv ? s qsvxy
注 }与对照组比较 tl Π s qsxk表 v ox同l
2 q2 细胞增殖周期测定结果
与相应对照组比较 o除 tss °ª#pt骨碎补醇提
液及水提液外 o其余浓度的骨碎补水提液和醇提液
均能使 ≥期 ≤v×v2∞t细胞百分率升高 oŠt 期细胞
百分率减少k表 ul ∀
表 u 不同浓度骨碎补提取液作用的
 ≤v×v2∞t 各增殖周期的细胞百分率
组别 药物浓度r°ª#pt ŠsrŠt ≥ Šur ≥ n Šu
水提液 s qst yt qt vv qx x qw v{ q|
t x{ qz vt qz | qy wt qv
tss yy qv uz qz y qt vv q{
对照组k水l yv qs vu qs x qs vz qs
醇提液 s qst xy qv vv qv ts qx wv q{
t x| qv vy qt w qy ws qz
tss yx qu vt qw v qx vw q|
对照组k醇l yt qx vv qw x qt v{ qx
2 q3 „°活性检测结果
t otss °ª#pt骨碎补醇提液作用 ≤v×v2∞t细
胞的 „°活性高于对照组k Π s qsxl o其余各试验
组细胞 „°活性无明显升高k Ё s qsx o表 vl ∀
表 v 不同浓度骨碎补提取液作用的
≤v×v2∞t 细胞 „°活性k ξ ? σ, ν € yl
组别 药物浓度r°ª#pt „°活性r˜#pt
水提液 s qst tw qvvv v ? s qxty w
t tw qyyy z ? s qxty w
tss tw qvvv v ? s qxty w
对照组k水l tw qxss s ? s qxwz z
醇提液 s qst tw qvvv v ? t qsvu {
t tw qyyy z ? s q{ty xtl
tss tw qyyy z ? s q{ty xtl
对照组k醇l tv qyyy z ? s qxty w
#xyt#
第 u|卷第 u期
ussw年 u月
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂²¯ qu| oŒ¶¶∏¨ u
ƒ ¥¨µ∏¤µ¼oussw
2 q4 骨钙素检测结果
tss °ª#pt骨碎补醇提液作用 ≤v×v2∞t 细
胞tu§ o其骨钙素水平明显高于对照组 k Π 
s qsstl o其余各试验组细胞上清液中骨钙素水平无
明显变化k Ё s qsx o表 wl ∀
2 q5 ∂²± ®²¶¶¤钙化染色法检测结果
表 w 不同骨碎补提取液作用的 ≤v×v2∞t 细胞培养上清中的骨钙素浓度k ξ ? σ, ν € yl
组别
药物浓度
r°ª#pt
骨钙素浓度rΛª#pt
v § y § | § tu §
水提液 s qst t qsw| ? s qtx| t quu{ ? s qyt| t qus{ ? s q{xu t qzyu ? s qvy|
t s qz{| ? s qu{z s qzxs ? s qtv{ s qzt{ ? s qtx{ t qs|{ ? s qutz
tss s q{yw ? s quyw t qtt| ? s qyyw t qyyu ? s qyzx t q|uz ? s qzz{
对照组k水l s q|tx ? s qtz| t qs{v ? s quxu t qwwt ? s quyx t qwzv ? s qyxy
醇提液 s qst s q{t| ? s quvy t qs|s ? s qtww t qwtt ? s qv|s s qysv ? s qtwv
t s q|ty ? s qvsx t qwuz ? s q{zu t qzw| ? s q|vw s qy|w ? s qtzx
tss t qszy ? s qut{ s qyy{ ? s qtww s qzt{ ? s qttz t q{vz ? s quyvtl
对照组k醇l s qz{w ? s quy| s qz|{ ? s qtzz s q{{{ ? s qt|{ s qzsu ? s qutx
注 }与对照组比较 o tl Π s qst
与相应对照组比较 os qst °ª#pt骨碎补醇提
液 !t °ª#pt骨碎补水提液可提高 ≤v×v2∞t细胞体
外钙化点面积百分比k Π s qsxl其余各试验组细胞
的百分比无明显变化k Ё s qsx o表 xl ∀
表 x 不同浓度骨碎补提取液作用的
 ≤v×v2∞t 细胞钙化面积百分比k ξ ? σ, ν € yl
组别 药物浓度r°ª#pt 钙化面积r h
骨碎补水提液 s qst s qvxv v ? s qswy s
t s qw{v v ? s qsyv xtl
tss s qwut z ? s qttx t
对照组k水l s qvys s ? s qtst w
骨碎补醇提液 s qst s qx|t z ? s qsxu ztl
t s qw{{ v ? s qsv{ z
tss s qwx{ v ? s qsv{ z
对照组k醇l s qvzu u ? s qsut v
3 讨论
成骨细胞起源于多能的骨髓基质的间质细胞 o
在骨形成过程中经历分裂增殖 !分化成熟和基质钙
化 v个阶段≈tt otu  ∀ ≤v×v2∞t是从 ≤xz…ry小鼠颅
顶骨细胞中建株的成骨细胞 o具有 „°活性 !Œ型胶
原合成和基质钙化等成骨细胞的生物学特性 o国际
上常作为骨代谢研究的细胞模型≈tv  ∀
××法检测结果表明 }s qst ot °ª#pt骨碎补水
提液能促进 ≤v×v2∞t细胞增殖k Π s qsxl otss °ª#
pt骨碎补水提液及骨碎补醇提液则不能k Π 
s qsxl ∀流式细胞术测定结果与 ××法相似 ot os qst
°ª#pt骨碎补水提液和醇提液作用的 ≤v×v2∞t的
≥期细胞百分率升高 !Št期细胞百分率减少 o表明细
胞各期时相提前 !增殖周期缩短 ~但 tss °ª#pt各提
取液均无此作用 ∀提示低浓度的骨碎补水提液和醇
提液才有细胞增殖促进作用 o这与高浓度提取液中
可能存在的细胞毒性成分含量也相对较高有关 ∀作
用于体外培养的成骨细胞的各药物没有经过胃肠道
过滤及选择性吸收等过程直接起作用 o高浓度时其
毒性成分可能抑制细胞的分裂增殖 ∀ ××和流式细
胞术法检测低浓度醇提液促细胞增殖作用的差异 o
可能与后者更为敏感 !精确所致≈tw  ∀
„°是主要分布于细胞膜的钙结合转运蛋白 o
促进细胞成熟 !钙化≈tx  ∀骨钙素是骨质钙化必需的
因子 o维持骨组织的正常矿化≈ty  ∀因此 o„°和骨钙
素分别是成骨细胞早期和中期分化的标志物≈tz ot{  ∀
„°检测结果表明 }t otss °ª#pt骨碎补醇提液可提
高 ≤v×v2∞t细胞的 „°活性k Π s qsxl os qst °ª#
pt醇提液和各浓度水提液无促进细胞 „°活性的
作用k Ё s qsxl ∀骨钙素测定结果表明 o仅有 tss °ª
#pt骨碎补醇提液作用 ≤v×v2∞t细胞 tu §时 o细
胞
合成及分泌骨钙素的能力明显高于对照组k Π 
s qsstl ∀上述结果提示 o中等或较高浓度骨碎补醇
提液分别具有促进成骨细胞 ≤v×v2∞t早 !中期分化
的作用 ∀
∂²± ®²¶¶¤钙化液中的抗坏血酸能促进成骨细胞
合成胶原并钙化≈t|  oΒ2甘油磷酸钠则能促进钙盐沉
积≈us  o利用 ∂²± ®²¶¶¤钙化染色法可检测成骨细胞钙
化骨基质的形成 o通过图象分析软件计算钙化点面
积的百分比可定量检测细胞钙化程度 ∀ ∂²± ®²¶¶¤钙
化染色法检测结果表明 os qst °ª#pt骨碎补醇提
液 !t °ª#pt骨碎补水提液作用的 ≤v×v2∞t细胞体
外钙化点面积百分比高于对照组k Π s qsxl o其余试
#yyt#
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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验组细胞的百分比无明显变化k Ё s qsxl ∀上述结
果提示 o低浓度骨碎补醇提液具有促进 ≤v×v2∞t细
胞钙化的作用 ~但仅有中等浓度骨碎补水提液能促
进细胞钙化 o其原因值得进一步探讨 ∀
体外培养的细胞正常生长要求培养液有合适的
³‹值和渗透压≈ut  ∀对大多数细胞来说 o生长的最适
³‹为 z qu ∗ z qw o最适渗透压 uys ∗ vus °’¶°#®ªpt ∀
不同浓度的药物提取液其 ³‹ 值和渗透压可能对细
胞产生不同的影响 o使提取液对细胞的作用呈现窗
口效应 o缺少量效关系 ∀
对于中药来说 o本文发现的骨碎补水提液和骨
碎补醇提液是在很低浓度ks qst °ª#ptl即能促进
成骨细胞增殖 o较低浓度kt °ª#ptl骨碎补醇提液
有促进成骨细胞分化 o较低浓度骨碎补水提液kt °ª
#ptl或很低浓度骨碎补醇提液ks qst °ª#ptl有促
进成骨细胞钙化 o提示在骨碎补水相和醇相提取物
中分别存在有较高活性的促成骨细胞增殖 !分化和
钙化的物质 o具有进一步研发成抗骨质疏松或骨质
吸收新药的前景 ∀
≈参考文献 
≈t  •¤¬¶½ Šq  ¦¨«¤±¬¶°¶¤±§µ¨ª∏¯¤·¬²± ²©¥²±¨ µ¨¶²µ³·¬²± ¥¼ ²¶·¨²¦¯¤¶2
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°¨ ·¤¥²¯¬¶° o≤²±±¨ ¦·¬¦∏·} •¤√¨ ± °µ¨¶¶ot||u qu{z q
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中 国 中 药 杂 志
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u . ∆επαρτµεντ οφ Μεδ Μιχροβιδογψ ανδ Παρυσιτολογψ, Χολλεγε οφ Μεδιχαλ Σχιενχε , Ζηεϕιανγ Υνιϖερσιτψ, Ηανγζηου vtsssy , Χηιναl
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≈责任编辑 方文贤 
蓝桉油对脂多糖引起的
大鼠慢性支气管炎及黏蛋白高分泌的影响
吕小琴 3 o唐法娣 o王 砚 o赵 婷 o卞如濂
k浙江大学 医学院 国家食品和药品监督管理局 浙江呼吸药物研究实验室 o浙江 杭州 vtssvtl
≈摘要  目的 }观察蓝桉油对脂多糖引起的大鼠慢性支气管炎及黏蛋白高分泌的影响 ∀方法 }采用一次性气管内
注入 s qu °ª脂多糖复制大鼠慢性支气管炎模型 o观察 v周后的病理学改变 !支气管肺泡灌洗液变化 !免疫组化特点以
及蓝桉油对其的影响 ∀结果 }注入脂多糖后的病理学表现符合慢支的特征 ∀各给药组经不同浓度蓝桉油灌胃后能减
少中性粒细胞及淋巴细胞的浸润 o降低炎症程度 ~尤其是蓝桉油高剂量组kvss °ª#®ªp tl o能明显减少灌洗液中黏蛋白
含量 o使气管和细支气管上皮内黏蛋白 ˜≤x¤¦表达的阳性染色区域和程度明显减轻 o通过图像分析系统测得的吸光
度值和黏蛋白面积 h均明显低于模型组 ∀结论 }蓝桉油对脂多糖引起的大鼠慢性支气管炎具有一定的抗炎作用 o并能
抑制其气道黏蛋白高分泌现象 ∀
≈关键词  蓝桉油 ~脂多糖 ~慢性支气管炎 ~黏蛋白
≈中图分类号  • u{x qx ≈文献标识码  „ ≈文章编号  tsst2xvsukusswlsu2sty{2sw
≈收稿日期  ussv2s{2sw
≈基金项目  浙江省科技计划项目kussv¦vvss{l
≈通讯作者  3吕小琴 oר¯ }ksxztl{xxuuts{ o∞2°¤¬¯ }¯√¬¬¤²´ ¬±ªuzu
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气道黏液高分泌是气道慢性炎症的一个重要病
理特征 o黏液潴留可加重感染和气道阻塞 o并使气体
交换功能障碍 ∀气道黏液的黏滞性 !黏附性和弹性
主要来自黏蛋白 o黏蛋白的高分泌不仅增加了黏液
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第 u|卷第 u期
ussw年 u月
中 国 中 药 杂 志
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