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The effect of four kinds of traditional Chinese herbal compound on the experimental acute stress behaviors and the hypothalamus pituitary-adrenal gland axis

4种中药复方对大鼠实验性急性应激行为及下丘脑-垂体-肾上腺轴的影响



全 文 :4种中药复方对大鼠实验性急性应激行为及
下丘脑垂体肾上腺轴的影响
童 瑶1,邹 军2,倪力强3,梁尚华2,曹碧茵2,陈慧娟2
(1香港大学 中医药学院,香港;2上海中医药大学 基础医学院,上海 201203;
3上海市食品药品监督管理局 科技情报研究所,上海 200040)
[摘要] 目的:观察四逆散、半夏厚朴汤、甘麦大枣汤、桂枝甘草龙骨牡蛎汤4种中药复方对大鼠实验性急性
应激行为及下丘脑垂体肾上腺轴(HPA)的影响。方法:将大鼠分为7组:正常组、模型组、四逆散组、半夏厚朴汤
组、甘麦大枣汤组、桂枝甘草龙骨牡蛎汤组,测试各组大鼠应激行为、放射免疫法测定大鼠下丘脑促肾上腺皮质激
素释放激素(CRH)、血浆促肾上腺皮质激素(ACTH)及血清皮质酮(CORT)。结果:四逆散减少旷场实验的爬格次数
(P<001),降低CRH,CORT的含量(P<001,P<005);半夏厚朴汤延长尾悬挂试验静止时间(P<005),降低
CRH含量(P<005);甘麦大枣汤延长尾悬挂试验静止时间(P<005),减少挣扎次数(P<001),降低 CRH,ACTH,
CORT的含量(P<001,P<005);桂枝甘草龙骨牡蛎汤减少旷场实验的爬格次数(P<001),延长尾悬挂试验静止
时间(P<005),减少尾悬挂试验挣扎次数(P<001),降低 CRH,ACTH,CORT的含量(P<001,P<005)。结论:
4种中药复方分别通过理气、化痰、补气、温阳等作用于HPA轴不同环节,改变应激行为方式,从而增强机体应对急
性应激的能力。
[关键词] 急性应激;旷场试验;尾悬挂试验;下丘脑垂体肾上腺轴;四逆散;半夏厚朴汤;甘麦大枣汤;桂枝
甘草龙骨牡蛎汤
[中图分类号]R2855 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2005)23186304
[收稿日期] 20050705
[基金项目] 上海市科学技术委员会基础研究重点项目
(02JC14024)
[通讯作者] 邹军,Tel:(021)51322151,Email:zoujun777@126.
com
应激与病毒感染、消化性溃疡、心血管系统、神
经精神系统、肿瘤等多种疾病的发展过程密切相关,
应激作为人类多种疾病的重要病因或诱因,日益受
到医学界的广泛关注和深入研究[1]。中医药对现代
应激理论的研究主要集中在应激对相关脏腑功能的
影响,如“怒伤肝”[2]、“恐伤肾”[3],并观察相应中药
复方对其影响,且报道以对慢性应激的作用为主。
四逆散、半夏厚朴汤、甘麦大枣汤、桂枝甘草龙骨牡
蛎汤分别是疏肝理气、燥湿化痰、补气养心、温阳定
惊的经典代表方,本研究着重观察 4种中药复方对
急性应激的调节作用。
1 材料
11 动物和分组
清洁级SD大鼠,雌雄各半,体重180~220g,中
国科学院实验动物中心提供。大鼠正常饮食,在光
暗周期各12h,温度(20±2)℃,相对湿度40%的环
境中适应6d后,按体重随机分为6组,每组动物13
只:正常组、模型组、四逆散组、半夏厚朴汤组、甘麦
大枣汤组、桂枝甘草龙骨牡蛎汤组。
12 药物
四逆散组成及剂量:柴胡 6g,白芍 6g,枳实 6
g,甘草6g;半夏厚朴汤组成及剂量:半夏 8g,厚朴
45g,生姜75g,苏叶3g,茯苓6g;甘麦大枣汤组
成及剂量:甘草9g,小麦20g,大枣 5枚;桂枝甘草
龙骨牡蛎汤的组成及剂量:桂枝3g,甘草6g,龙骨6
g,牡蛎6g。全部中药均购自上海虹桥饮片厂,药剂
科鉴定均为正品中药材,水煎浓缩至含生药 1g·
mL-1(用药剂量为成年人每 1kg体重剂量的 10
倍),高压灭菌,4℃冰箱保存备用。
13 试剂和仪器
急性应激动物模型采用第二军医大学神经生物
学教研室自研制的高压恒流光电刺激仪进行造模,
大鼠CRH,ACTH放免试剂盒由第二军医大学神经
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中 国 中 药 杂 志
ChinaJournalofChineseMateriaMedica
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生物学教研室提供,大鼠 CORT放免试剂盒由美国
DiognosticSystemsLaboratories提供。
2 方法
21 给药方法及急性应激反应模型制作
四逆散组、半夏厚朴汤组、甘麦大枣汤组、桂枝
甘草龙骨牡蛎汤组灌服相应中药 2mL,每日 1次;
正常组及模型组灌服等量的生理盐水,连续灌服19
d。在第18,19天灌胃1h后,除正常组外其余各组
的13只大鼠均给予电刺激,制作急性应激反应模
型:采用高压恒流光电刺激仪电刺激大鼠足底,波宽
2ms的电脉冲,每分钟1次,强度14mA(恒流),历
时20min。
22 大鼠行为检测
221 旷场实验(openfieldtest) 在第19天,造模
1h后,将实验动物置于高40cm、直径80cm、周壁为
黑色、底面用笔划分成面积相等的25块组成的圆柱
形敞箱内,室内隔音,记录动物行为,每次测定时间
3min。以穿越底面块数为水平活动(crossing)得分,
即三爪以上跨入邻格的次数。于实验前、实验中(第
11天)和实验结束前(第19天)各测1次。
222 尾悬挂实验 在第19天,旷场实验后,将大
鼠尾端1cm的部位固定在一水平木板上(木板距地
面1m),使动物呈现倒挂状。悬挂两侧用木板隔开
动物视线,观察指标为:①不动时间,指大鼠处于完
全放松静止不动状态的累积时间。②挣扎次数,指
大鼠由倒挂向上翻转的总次数。
23 检测项目与方法
在第20天,大鼠断头取血,制备血浆、血清,低
温保存备测;下丘脑体的采集:大鼠断头,快速剖取
脑组织后,迅速在沸生理盐水中煮5min,分离下丘
脑称重后置于玻璃匀浆管内,加入1mol·L-1HAC1
mL,匀浆后转入到试管中,室温放置100min,4℃,4
000r·min-1离心 20min,取上清,保存于 -20℃冰
箱,待测。下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素
(CRH)、血浆促肾上腺皮质激素(ACTH)、血清皮质
酮(CORT)含量放免法测定,具体步骤按试剂盒要求
操作。
24 统计学方法
所有实验结果以珋x±s表示,采用 SPSS统计软
件进行方差分析和两两比较。
3 结果
31 对急性应激大鼠旷场实验爬格次数的影响
如表1所示,实验前、灌服中药第 11d,各组爬
格次数无明显差异(P>005);在灌服中药第19天,
造模2d后,与正常组相比,模型爬格次数显著增加
(P<001);与模型组相比,四逆散组、桂枝甘草龙
骨牡蛎汤组爬格次数有显著差异(P<001)。
32 对急性应激大鼠尾悬挂实验的影响
表1 4种中药复方对急性应激大鼠旷场实验爬格次数的影响(珋x±s,n=13)
组别
剂量
/g·kg-1
爬格次数
实验前 11d 19d
正常组 - 48.54±6.53 49.69±10.18 50.69±11.86
模型组 - 47.69±10.3 53.08±10.52 68.38±7.821)
四逆散组 10 45.15±9.88 49.15±13.79 52.77±14.072)
半夏厚朴汤组 10 49.08±10.14 51.92±12.49 61.62±14.33
甘麦大枣汤组 10 46.23±11.05 48.31±9.72 59.54±10.01
桂枝甘草龙骨牡蛎汤组 10 50.23±9.95 52.62±11.22 54.15±8.752)
注:与正常组比较1)P<0.01;与模型组比较2)P<001
如表2所示,造模后,与正常组相比,模型组静
止时间显著缩短、挣扎次数显著增加(P<001);与
模型组比,半夏厚朴汤组、甘麦大枣汤组、桂枝甘草
龙骨牡蛎汤组静止时间有显著延长(P<005),甘
麦大枣汤组、桂枝甘草龙骨牡蛎汤组挣扎次数有显
著减少(P<001)。
33 对急性应激大鼠下丘脑 CRH、血浆 ACTH及
血清CORT含量的影响
如表3所示,与正常组相比,模型组大鼠下丘脑
表2 4种中药复方对急性应激大鼠尾悬挂
实验的影响(珋x±s,n=13)
组别
剂量
/g·kg-1
静止时间
/s
挣扎次数
正常组 - 206.31±38.66 90.23±16.78
模型组 - 157.69±31.51) 133.69±20.421)
四逆散组 10 167.92±39.07 121.85±20.07
半夏厚朴汤组 10 192.62±31.922)117.92±26.65
甘麦大枣汤组 10 194.23±42.442)102.85±16.593)
桂枝甘草龙骨牡蛎汤组 10 193.85±37.972) 98.23±16.653)
注:与正常组比较1)P<001;与模型组比较2)P<005,3)P<001
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CRH、血浆 ACTH及血清 CORT含量均明显增高
(P<001);与模型组相比,4个中药组大鼠下丘脑
CRH含量均显著降低 (P<001,P<005);与模型
组相比,甘麦大枣汤组、桂枝甘草龙骨牡蛎汤组
ACTH差异显著(P<005);四逆散组、甘麦大枣汤
组、桂枝甘草龙骨牡蛎汤组较模型组的 CORT含量
均显著降低(P<001)。
4 讨论
表3 4种中药复方对大鼠下丘脑CRH、血浆ACTH及血清CORT含量的影响(珋x±s,n=11)
组 别 剂量/g·kg-1 CRH/pg·mg-1 ACTH/pg·mL-1 CORT/ng·mL-1
正常组 - 26.72±7.10 22.45±4.82 215.20±235.59
模型组 - 39.47±10.831) 28.92±4.141) 582.16±311.581)
四逆散组 10 30.60±11.272) 28.38±4.56 251.87±186.473)
半夏厚朴汤组 10 30.52±8.172) 29.67±4.81 383.72±280.22
甘麦大枣汤组 10 29.38±9.892) 24.54±3.842) 253.60±127.183)
桂枝甘草龙骨牡蛎汤组 10 27.18±7.613) 24.88±4.382) 296.22±263.983)
注:与正常组比较1)P<001;与模型组比较2)P<0.05,3)P<001
在应激反应中,下丘脑垂体肾上腺(HPA)轴起
到了关键性的作用,而且提供了一个将神经信息转
换成生理反应的模式[4]。目前有关应激的试验研究
以慢性应激为多,急性与慢性应激模型的区别还没
有统一的标准,但有研究表明[5],急性应激期动物行
为活动增多,而慢性应激期减少,急性应激表现为焦
虑状态,而慢性应激则为抑郁状态。本试验观察通
过旷场实验、尾悬挂实验对大鼠行为观察,在造模后
动物的行为活动增多,表明动物应激尚处于急性期。
4种中药复方对实验性急性应激行为及下丘脑垂
体肾上腺轴的影响的可能机制分析如下。
四逆散对急性应激模型大鼠旷场实验爬格次
数,CRH,CORT的干预具有统计学意义。四逆散既
有调理肝脾之功,又具调和气血之能,是调理气机的
基本方。中医认为,不良刺激首先是影响了机体正
常的气机,进而气血津液及脏腑功能失调,阴阳失
衡,机体的正气受到损害,这与现代应激学说的应激
原理有许多相似之处。四逆散对急性应激大鼠的干
预,与其疏肝解郁,调畅气机的作用有关。
半夏厚朴汤对绝望小鼠静止时间,急性应激模
型大鼠CRH的影响有统计学意义。半夏厚朴汤主
治胸闷叹息,脘腹胀满,嗳气呕逆,食少纳呆、怔忡惊
悸、嘈杂等等,与应激状态的某些表现十分类似。燥
湿化痰中药复方干预应激的机制,与对 CRH环节的
调节作用有关。
甘麦大枣汤对急性应激模型大鼠尾悬挂静止时
间,CRH,ACTH,CORT等指标的影响有统计学意义。
甘麦大枣汤具有养心安神,和中缓急等功效。中医
学认为,“心者,君主之官,神明出焉”。心的功能失
常,会出现失眠、多梦、健忘,甚至精神错乱、昏迷等
心神不宁,心的气血不足等表现,与应激状态的某些
反应十分类似。运用养心安神的方剂———甘麦大枣
汤对应激进行干预,从补益心气心血、安定神志的角
度,对应激进行良性调节。
桂枝甘草龙骨牡蛎汤对绝望小鼠静止时间,急
性应激模型大鼠旷场爬格次数,尾悬挂静止时间、尾
悬挂挣扎次数,CRH,ACTH,CORT的影响有统计学
意义。桂枝甘草龙骨牡蛎汤主治心神被扰,烦躁不
安,心悸,怔忡,心胸憋闷、气短、多汗、形寒畏冷等
证,与应激状态下的某些表现类似。桂枝甘草龙骨
牡蛎汤具有温补心阳、收敛神气的功效,为“温阳定
惊”治疗法则的代表方。“惊”,中医认为,对心神不
利,《素问·举痛论》说:“惊则心无所依,神无所归,虑
无所出,故气乱矣。”心神不宁则易惊,《小儿药证直
诀》中明确指出:“惊为心病。”
本研究表明,甘麦大枣汤、桂枝甘草龙骨牡蛎汤
对行为指标及 HPA轴都有改善作用,与四逆散、半
夏厚朴汤相比,作用环节更为广泛。二方分别为养
心安神与温阳定惊的代表方,据此作者认为,急性应
激的病理改变以惊恐扰心、心阳及心气血不足为主
要病机,为临床运用此方治疗一些反应性抑郁、更年
期综合征等提供了理论依据。
[参考文献]
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[5] RoschPJ.Nutritionalsupplementstoreducestressanditsmanifold manifestations.StresMed,1997,13:209.
TheefectoffourkindsoftraditionalChineseherbalcompoundon
theexperimentalacutestressbehaviorsandthehypothalamus
pituitaryadrenalglandaxis
TONGYao1,ZOUJun2,NILiqiang3,LIANGShanghua2,CAOBiyin2,CHENHuijuan2
(1TraditionalChineseMedicineColege,HongkongUiniversity,Hongkong,China;
2BasicMedicalColege,ShangahiTraditionalChineseMedicineUniversity,Shanghai201203,China;
3ScientificandTechnologicalInformationInstitute,ShanghaiFood&MedicinesAdministrationBureau,Shanghai200040,China)
[Abstract] Objective:TostudytheefectsoffourkindsoftraditionalChineseherbalcompound,Sinipowder,Banxiahoupusoup,
GanmaidazaosoupandGuizhigancaolonggumulisoup,ontheexperimentalacutestressbehaviorsandthehypothalamuspituitaryadrenalgland
axis.Method:Ratsweredivideinto7groups:normalgroup,model1and2groups,Sinipowdergroup,Banxiahoupusoupgroup,Ganmaid
azaosoupgroup,andGuizhigancaolonggumulisoupgroup.ThebehaviorsoftheratsandtheirCRHofthehypothalamus,ACTHofplasmaand
CORTofserum(bythemeansofradioimmunity)weredetected.Result:Sinipowdercouldreducethecrossingtimesofopenfieldtest(P<
001)andthecontentsofCRHandCORT(P<001,P<005);Banxiahoupusoupcouldextentthestiltimeoftailhangingtest(P<
005)andthecontentofCRH(P<005);Ganmaidazaosoupcouldprolongthestiltime(P<005)andreducethestruggletimes(P<
001)oftailhangingtestandreducethecontentsofCRH,ACTHandCORT(P<001,P<005);Guizhigancaolonggumulisoupcouldre
ducethecrossingtimesofopenfieldtest(P<001),extentthestiltime(P<005)andreducethestruggletimes(P<001)oftailhang
ingtestoftailhangingtest,alsoreducethecontentsofCRH,ACTHandCORT(P<001,P<005)Conclusion:Thefourkindsoftradi
tionalChineseherbalcompoundcanincreasetheabilityofantistressbyafectthediferenttachesofthehypothalamuspituitaryadrenalgland
axleandchangethestressbehaviors,whicharebasedontheirrespectivefunctionsofregulatingQi,dispersingphlegm,tonifyingQiandwarm
ingYang.
[Keywords] acutestress;openfieldtest;tailhangingtest;hypothalamuspituitaryadrenalglandaxle;Sinipowder;Banxiahoupu
soup;Ganmaidazaosoup;Guizhigancaolonggumulisoup
[责任编辑 古云侠]
[收稿日期] 20050210
[基金项目] 重庆市科委应用基础课题[渝科发技字(2002)18号]
[通讯作者] 徐晓玉,Tel:(023)68447637,Email:xxy0618@sinacom
桃红四物汤Ⅱ号抑制小鼠 B16黑色素瘤生长及
VEGF,KDR/FLK1表达
王淑美,徐晓玉,陈 刚,杨丽容
(重庆医科大学 中医药学院,重庆 400050)
[摘要] 目的:观察桃红四物汤Ⅱ号对小鼠B16黑色素瘤生长、血管内皮生长因子(VEGF)和血管内皮生长因
子受体2(KDR/FLK1)表达及肿瘤微血管密度(MVD)值的影响。方法:采用 C57BL/6J小鼠皮下接种 B16黑色素瘤
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