全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 28(4)：447— 450 2008年 7月
束花石斛种质资源的 ISSR分析
包英华1，白 音l*，田新波 ，王文全2
(1．韶关学院 英东生物工程学院 ，广东 韶关 512005；2．北京中医药大学 中药学院，北京 100102)
摘 要 ：采用 ISSR分子标记技术对 9个居群柬花石斛的遗传多样性和亲缘关系进行分析 。结果显示 ，从 6O
条 ISSR引物中共筛选出的 5条有效引物 ，每个引物的扩增位点为 9～l3个 ，共 56个位点 ，多态性位点 49个
(87．90 )。柬花石斛种内遗传多态性水平较高，遗传变异较丰富，9个居群的总扩增条带为 242个，平均每个
居群为 26．9o个，其中多态性条带占179个(72．90 oA)。野生柬花石斛种质资源减少的主要原因在于人为过度
采收和其赖以生长的环境被破坏 ，聚类分析结果表明，云南思茅和文山居群的遗传距离最近，而云南景洪居群与
其它居群之间的遗传距离相对较大 ，说明柬花石斛种内亲缘关系的远近可能与其地理分布也有一定的联系。
关键词：柬花石斛；种质资源；ISSR；遗传多样性；亲缘关系
中图分类号 ：Q943．2 文献标识码 ：A 文章编号：i000—3142(2008)04—0447—04
Studie, ’ ；ources of Dendrobiuson Rermplasm res Dt!m
chrysan thum using ISSR marker
BAO Ying-HuaI，BAI Yin1 ，TIAN Xin-BoI，WANG Wen-Quan2
(1．Yingdong College of Bioengineering，Shaoguan University，Shaoguan 512005，China；2．School
of Chinese Pharmacy，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China)
Abstract：Dendrobium chrysanthum is a traditional Chinese crude drug in China．W e analyzed the genetic diversity
and the genetic relationship of 9 population of D．chrysanthum by ISSR technique in this paper．The results showed
that we sieved 5 utility primers from 60 ISSR primers and the amplified loci of every primers was 9～ l3，the total was
56，of which 49 were polymorphic(87．90 of al amplified loci)．The level of genetic diversity in D．chrysanthum is
higher，and the genetic variation is more abundance．A total of 242 bands with an average of 26．90 bands per popula-
tion were amplified from 9 populations，in which 179 bands polymorphic(72．90 )of all amplified bands．The main
endangered reasons of wild population of D．chrysanthum were the over-collecting and the environment which D．
chrysanthum depended on was destoryed．Cluster analysis showed that the genetic distances of Yunnan Simao popu-
lation and Wenshan population is closest，and it is farther between Yunnan Jinghong population and the others．This
result indicated that the phylogenetic relationship of different population of D．chrysanthum is possibly relevant to
their geographic distribution．
Key words：Dendrobium chrysanthum ；germplasms resources；ISSR；genetic diversity；phylogenetic relationship
束花石斛 (Dendrobium chrysanthum)为兰 科
(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium)多年生草本植
物，别名为水打棒或大黄草等，分布于我国贵州、广
西和云南省等地区。束花石斛是收载于我国《药典》
(2000年版)的名贵中药材，其主要含有多糖、生物
碱、菲类和联苄类等化合物(陈晓梅等，2001；杨莉
收稿日期 ：2007—10—22 修回 日期 ：2007—12—12
基金项目：国家科技基础条件平台工作项目(2005DKA21004)；韶关学院科研项目(2007)[Supported by National Facilities and Information Infrastruc—
ture Foundation for Science and Technology(2005DKA21004)；Scientific Research Foundation of Shaoguan Oniversity(2007)]
作者简介：包荚华(1973一)，女，内蒙古通辽人，讲师，从事植物生理与分子生物学研究 ，(E-mail)byinghua(~126．com。
通讯作者(Author for correspondence)
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等，2004；李墅等，2005)，具益胃生津和滋阴清热之
功效，是“脉络宁注射液”、“石斛夜光丸”和“复方清
咽宁”等复方中药的主要原料(丁小余等，2002)。笔
者在研究当中发现不同居群束花石斛的形态特征、
生物学特性和多糖含量均有较大差异。
ISSR(Intersi．mple Sequence Repeats)是 由
Ziekienlcz根据 SSR(Simple Sequence Repeats)的
特点创建的一种简单重复区间扩增多态性的分子标
记技术，该技术具有不需预知基因组任何信息、所需
模板 DNA用量少、操作简单、成本低以及多态性丰
富等优点(Ziekienlcz等，1994)。沈洁等(2006)利用
ISSR标记技术对不同居群铁皮石斛(D．officina—
le)进行分子鉴定，结果显示在铁皮石斛种内含有丰
富的 ISSR序列，多态性水平较高(90．5 )，而且
ISSR分子标记技术能够有效鉴别不同居群铁皮石
斛。沈颖等(2005)对 9种石斛属植物进行 ISSR分
析，认为 ISSR是用于石斛属种问鉴别的一种可靠
的分子标记方法。然而，至今尚未见有束花石斛种
内遗传变异的研究报道。鉴于此，本文采用 ISSR
分子标记技术对束花石斛 9个居群的遗传多样性和
亲缘关系进行研究，为束花石斛种质资源的可持续
利用和保护提供参考。
I 拣 与贲法
1．1材 料
供试材料采自于我国贵州，广西和云南等地区，
共 9个居群 。全部材料均 由白音博士鉴定 ，凭证标
本存放于韶关学院植物标本室和石斛种质资源圃。
取新鲜叶片或嫩枝，快速干燥，置于超低温冰箱中保
存备用，每个居群均取 3～6个个体(表 1)。
1．2方法
1．2．1基 因组总 DNA 的提取 采用改 良CTAB法
(包英华等，2007)提取样品 DNA，用 Ultrospc 2000
紫外／可见分光光度计检测其 DNA纯度和浓度，
Az6o／Az8o比值为 1．7～2．3，浓度 90~600／~g／mL。
1．2．2 PCR反应体 系 总反应体积为 25 L，其中
含 2．5 L 1O×PCR buffer，2．0 mmo|·L。Mg抖，
0．3 mo1．L ISSR引物 、1． U Taq酶 、160 tLmol
· dNTP、150 ng模板 DNA。扩增前在 94℃预
变性 3 rain；每循环 94℃变 性 50 S，56℃退 火 1
rain，72℃延伸 2 rain，40循环；最后在 72℃延伸 5
rain。本试验共选用 6O条 ISSR引物(上海生工合
成)，所有反应均在 SUPER—PCR仪(日本)上进行。
1．2．3扩增产物的检测 PCR反应结束后，把扩增
产物进行 1．8 琼脂糖凝胶 电泳 ，经 EB染色后，在
Amgisham pharmacyia bictech凝 胶 成像 系 统 (瑞
士)下照相。
1．2．4数据统计与分析 在琼脂糖凝胶 上，每个材
料的每一条电泳谱带看作为一个遗传位点，在同一
个位点上如有强带者或重复出现的弱带者计为“1”，
无带者或不重复出现的弱带者计为“0”，计算其总扩
增条带和特异性扩增条带数量。利用 SPSS11．5软
件的类间平均链锁法，计算供试材料的欧氏距离，进
行聚类分析，构建其聚类图。
表 1 不 同居群束花石斛的来源及样品数量
Table 1 Origin and sampling size of nine
populations of D．chrysanthum
图 1 29号引物对束花石斛 9个居群的 ISSR扩增结果
Fig．1 The ISSR amplification result of primer
(CCCT)4(M：DNA ladder)
2 结果与分析
2．1 ISSR扩增结果
从 60(编号为 O1～60)条 ISSR引物中共筛 选
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4期 包英华等：束花石斛种质资源的 ISSR分析 449
出扩增条带多、清晰和稳定性好的 5条引物(图 1为
29号引物的扩增结果)。利用该 5条引物对束花石
斛 9个居群进行 ISSR扩增 。结果显示 ，5条 ISSR
引物的扩增位点为 9～13个之间，共 56个位点，扩
增位点的分子量多为 300～2 000 bp之间，其中多
态性扩增位点为 8～11个，共 49个，多态性位点占
76．90 ～91．70 ，平均为 87．90 (表 2)。
2．2不同居群束花石斛的遗传 多样性分析
束花石斛 9个居群的ISSR总扩增条带为 18～
37个，其 中多态性扩增条带 占 11～30个 (平均
19．90个 位 点 )，多 态 性 条 带 比 率 为 61．10 ～
81．10 之间，平均 72．90 ，说明束花石斛居群间
的遗传多态性水平差异较大，遗传变异比较丰富。
广西玉林居群的多态性扩增条带最多(30个)，占
81．10 ；而云南文山居 群的最少 (11个)，仅 占
61．10％(表 3)。
表 2 五个 ISSR引物的扩增结果
Table 2 Amplification results for nine populations
of D．chrysanthum by five ISSR primers
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irPrime No．of No．of
lymorphi oly p 。
29 (CCCT)d
38 (AG)8TT
43 (GA)8CG
44 (CT)8GA
46 (CT)8GT
共计 Total
平均 Average
表 3 不 同居群束花石斛遗传多样性分析结果
Table 3 Genetic diversity in different
population of D．chrysanthum
2．3不同居群束花石斛的聚类分析
以类间平均链锁法对全部供试材料进行聚类，
通过计算遗传距离来构建其聚类分析图(图 2)。结
果显示，束花石斛 9个居群比较 自然地分为 3个分
支(A支、B支和 C支)，其中 A支由云南思茅居群
(Dchr07)、云南文山居群(Dchr08)、贵州兴义居群
(Dchr02)、贵州安龙居群(Dchr01)、贵州则戎居群
(Dchr03)和贵州贞丰居群(Dchr04)组成；B支由广
西玉林居群 (Dchr05)和广西靖西居群 (Dchr06)组
成；C支仅由云南景洪居群(Dchr09)组成。从聚类
图可见，云南思茅居群和云南文山居群、贵州安龙居
群和贵州则戎居群的遗传距离较小，说明两者之间
的亲缘关系较近，而云南景洪居群与其它居群之间
的遗传距离相对较大，其亲缘关系亦相对较远。
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图 2 不同居群束花石斛的 ISSR聚类分析图
Fig．2 Dendrogram of cluster analysis for nine
population of D．chrysanthurn based on ISSR data
3 讨论
束花石斛为我国传统名贵中药材，随着国内外
药用石斛需求量逐年增加和开发利用程度的不断深
入，我国野生束花石斛资源遭到严重破坏，有些地区
甚至面临枯竭。于 1987年出台的《国家重点保护野
生药材物种名录》中，束花石斛被列为国家三级重点
保护植物。本文结果显示，束花石斛种内具丰富的
遗传变异，其多态性扩增位点(87．90％)，介于铁皮
石斛 (91．35 )和美花石斛(85．95％)之间(Ding
等，2005；白音等，2007)。说明导致束花石斛资源不
断减少并非是其遗传变异降低所致，而人为过度采
收和赖以生存的生态环境被破坏是我国野生束花石
斛资源急剧减少的主要因素。因此保护束花石斛原
产地生态环境和禁止采收野生束花石斛资源是恢复
野生束花石斛种群数量和蕴藏量最有效的途径。
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束花石斛种质资源的标准化收集整理结果显
示，不同居群束花石斛的茎直径和长度，茎形状以及
花的颜色和形状均有所差异。来 自云南景洪的束花
石斛茎长而粗壮，茎圆柱形 ，两端一般不会变细，花
较大，唇瓣上的两个斑点呈深紫色。而采 自于广西
玉林和百色地区的束花石斛茎比较短，两端逐步狭
窄，呈纺锤形(与玫瑰石斛极为相似)，花较小，唇瓣
上的两个斑点呈浅紫色。聚类分析结果表明，云南
思茅居群和云南文山居群、贵州安龙居群和贵州则
戎居群的遗传距离较小，说明两者之间的亲缘关系
较近。从地理位置而言，云南思茅和文山，贵州安龙
县和则戎乡的地理位置都很近。相反，云南景洪居
群与其它居群的亲缘关系较远，景洪位于云南省南
部，在地理位置上与其它居群间隔较远，说明束花石
斛居群间的亲缘关系与其地理位置有一定的联系。
至于束花石斛遗传基因与其形态变异和环境因素的
相关性还有待用进一步研究。
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(何立珍等，1983；黄济明，1983；宋文昌等，1992)。多
倍化后，耐荫特征更加突出。其叶片单位面积内的气
孔器数目减少，但气孔、保卫细胞及其所组成的气孔
器明显增大，使其呼吸作用得到改善，并更利于对
Co2和水分的调节；其保卫细胞中含有比二倍体更
多、更大的叶绿体，这与其光合效率和功能的提高有
关。四倍体除能较好地利用直射光外，对环境散射光
或漫射光也有更好的利用。由此可见，其形态结构特
征具有较大的可塑性。因此，四倍体高产有其良好的
叶片结构基础。
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