全 文 ：·
9 20
· 中草药 C hi ne s eTr ad it io nal a nd Hr eb al Dr u g s 20 0 0年第 3一卷第 1 2期
3
.
4
.
1 19给药后 , 部分小 鼠先后出现伏下少动 , 呼
吸加深加快 ,精神萎靡 ,食欲下降 , 粪便深褐色 , 对死
亡小鼠尸 检 ,无 肉眼可见的病变器官 。结果经改 良寇
氏 统计 , L D S。 一 3 5 35 m g k/ g , 95 %的 可 信 限 为 :
3 0 8 9一 4 0 4 6 m g / k g 。
3
.
4
.
2 i p 给药后 , 部分小 鼠先后 出现扭体 , 伏下少
动 ,精神萎靡 ,食欲下降 。对死亡小 鼠尸 检 ,小 鼠腹腔
中有原花青素细小颗粒 , 无其它肉眼可见的器官病
变 。 结果经改 良寇 氏法统计 , L D S。 一 1 4 · 7 m g k/ g,
9 5%的可信限为 : 1 2 2 . 3一 1 7 1 . Z n : g /k g 。
4 讨论
小鼠皮肤二阶段诱癌试验是研究癌发生和癌变
机制的经典模型 ,它包括启动和促癌阶段 。 常用此模
型来研究致癌物和促癌物 , 也用于研究抗致癌物和
抗促癌物 。 本实验用昆用种小 鼠 , 以 D M B A 和巴豆
油分别作 为启动剂和促癌 剂 ,诱发 出小 鼠皮肤乳头
状瘤 ,观察到原花青素有 明显的抑制乳头状瘤生成
作用 ,其抑瘤作用主要在促癌阶段 。
8 0 年代末发现 , 内皮细胞舒张 因子 ( E D R F ) 就
是 N O 后 , 有关 N O 的研究蓬勃兴起 。 作为一种介
质 ,在形成有致癌作用 的亚硝酸盐 、 D N A 损伤和与
慢性感染及 炎症有关的基因突变方面具有重要作
用 。 若 N O 持续 高浓 度她存在于细胞中 , 则可损伤
D N A 并导致基因突变 ,最终形成肿瘤川 。 本研究结
果显示小 鼠皮肤乳头状瘤 N O 含量显著增高 , 提示
N O 可能在乳头状瘤的形成过程中起一定作用 。 原
花青素能显著性降低促癌阶段小鼠皮肤中 N O 的含
量 , 而对启动阶段小 鼠皮肤 中 N O 的含量未见显著
性影响 , 这也与原花青素能对抗促癌阶段小鼠皮肤
乳头状瘤 的形成实验结果一致 ,进一步表 明 N O 可
能参与小 鼠皮肤乳头状瘤的形成 。
皮肤组织受 巴豆油或佛波酷类促癌剂处理后 ,
引起的最明显的反应之一是炎症反应圈 。 佛波醋类
促癌剂引起细胞产生和释放一些炎性 物质 (包括前
列腺素 、 花生四烯酸等 ) ,并使吞噬细胞渗出 ,产生大
量活性氧 自由基 , 它们在促癌过程中起着重要作用 。
由于几乎所有的佛波酷诱发小鼠耳廓肿胀的抑制剂
均极可能是有效 的抗促癌剂 , 因此这一体内实验已
成为 目前抗促癌剂的常用筛选模型之一图 。 小鼠耳
廓肿胀实验证实 ,原花青素对巴豆油引起的炎症反
应有 明显的抑制作用 , 提示原花青素具有较强的抗
促癌效果 。
参 考 文 献
1 C l a r k e E
,
H e e k e r E
.
N a t u r w i s
s e n s e h a f t e n
, 1 9 6 5 , 5 2 ( 1 5 )
: 4 4 6
2 G s e h w e n d t M
,
K i t t
s t e i n W
,
F r s t e n b
e r g e r G
, e t a l
.
C a n e e r
I e t t , 1 9 8 4 , 2 5 ( 2 )
: 1 7 7
3 N i
s
h n o H
,
Y o s h i o k a K
,
I w a
s
h im a A
, ` t a l
.
J P n J C a n
e e r R e
s ,
19 8 6 , 7 7 ( 1 )
:
3 3
4 O h s h im a H
,
B a r t s e h H
.
M u t a t R e
s ,
1 9 9 4
, 3 0 5 ( 2 )
: 2 5 3
5 M a r k s F
.
T u m o
r
P r o m o r i o n i n s k
孟n : A r e A e t万v e ( ) x y g e n s p e e i e s
I n v o l v o e d ? In
:
S i e s H
, e
d
.
( ) x id a t i v e S t r e s
s .
A e a d e m i e P r e
s s
I n e
( I
_ o n d o n ) L t d
. , 1 9 8 5
: 4 3
( 2 0 0 0
一
0 5
一
2 2 收稿 )
蟾蛤灵对人胃癌细胞系 M G c 一 8 0 3 的细胞毒作用
中国人 民武装警察部队医学院 (天津 3 0 0 1 6 2)
天津药物研究院
陈 小义 ’ 徐瑞成 陈 莉
钱 进
摘 要 蟾蛤灵 (b uf ial n) 是我国传统中药蟾酥中蟾毒的主要成分之一 ,研究其抑癌作用及机制具有重要意义 。 采
用 台盼蓝染色法 、 唾哇蓝还原法和光镜观察 b uf ial n 对人低分化胃腺癌细胞系 M G。 一 803 的生长抑制作用 。 结果显
示 , 0 . 0 1 拼m o l / I矛 及 以上浓度 b u f a l in 对 M G e 一 8 0 3 细胞具有显著的抑制作用 , IC S。值约为 0 . 1 拌m o l / L 。 b u f a li n 抑制
M G
c 一
80 3 生长 的机制是致使细胞核染色质凝缩 、 碎裂 , D N A 损伤 , 胞浆 R N A 含量下降 , 导致细胞死亡 。
关键词 蟾蛛灵 细胞毒作用 胃癌细胞系
S t u d i e s o n t h e C y t o t o x i e i t y o f B u f a l i n o n H u m a n G a s t r i c C a n e e r C e l l M G
c 一 8 0 3 in v i t or
M
e
d i
e a
l C
o l le g e o f C h i n e s e P e o p l e
’ 5 A r m e d P o l ic e F o r e e s ( T ia n jin 3 0 0 1 6 2 ) C h
e n X ia o y i
,
X u R
u ie h e n g
,
C h
e n L i
T i a n i in I
n s t i t u t e o f P h a r m a e e u t ie a l R e s e a r e h Q i
a n Ji n
A b s t r a c t T o s t u d y t h e e y t o t o x ie a e t iv i t y o f b u f a l i n
, o n e o f t h e e o m p o n e n t s o f b u f a d i e n o l id e s i n t h e
A d d r e s s
:
C h e n X 一a o y i , M e d i e a l C o l le g e o f C P A P F
,
T i a n j i n
陈小义 37 岁 , 副教授 ,第 三军医大学分子生物学研究生毕业 , 主要从事细胞与分子遗传学 的教学 与科研 , 曾于 A m er i c an Jou rn al of M de -
ic al G e n et ic
s 等国内外期刊上发表论文 10 余篇 。 获得军队科技进步二等奖等 4 项 。
中草药 C hi s n e eTa r di tio na la n d H r eba l D ru g s 2 0 0 0年第 3 1 卷第 1 2期 9 1 2
TC M
“
C ha ns u
” , a n d i t s m e e h a n i s m o f a e t i o n
.
H u m a n g a s t r i e e a n e e r e e l l l i n e M G e
一
8 0 3 w a s u s e d a s t a r g e t
e e l l s
.
I n h ib i t i o n o f t u m o r e e l l g r o w t h w a s a s s e s s e d b y t r y p a n b l u e e x e l u s i o n a n d t h i a z o l e b l u e a b s o r b a n e e
a n d l ig h t m ie r o s e o p e e x a m i n a t i o n
·
R e s u l t s h o w e d t h a t b u f a l i n a t e o n e e n t r a t i o n s o f 0
.
0 1 拼 m o l / L a n d a b o v e
e o u ld r e m a r k a b l y i n h ib it t h e g r o w t h o f M G e
一
8 0 3 t u m o r e e l l
,
w i t h IC
S。 o f a b o u t o
·
1 俘 m o l / L . F u r t h e r
s t u d y s h o w e d t h a t i t s m e e h a n i s m o f a e t i o n i n v o l v e d n e e r o t i e e h a n g e s o f n u e l e a r e h r o m a t i n a n d f r a g m e n t a
-
t io n o f e h r o m o s o m a l D N A l e a d i n g t o e e l l d e a t h
.
K e y w o r d s b u f a l i n e y t o t o x ie i t y h u m a n g a s t r i e M G e
一
8 0 3 e a n e e r e e l l
蟾酥是具有多种功效的传统 中药 , 近年来蟾 酥
细 胞 毒 成 分 的 研 究 日益 受 到 重 视川 , 蟾 蛛 灵
( b uf al in )是从蟾酥 中提取 的蟾毒的主要成分之一 ,
分子式为 C 2 4H 3 4 0 ` ,相对分子量为 3 8 6 . 5 ,我们发现
b u fa h n 作用于体外培养的胃癌细胞 , 可显著抑制肿
瘤细胞生长 ,报道如下 。
1 材料
1
.
1 药物 : b uf al in (纯度大于 9 % ) 由天津药物 研
究 院从 中华大蟾蛛 B 别`fo 占从局 g a 嗒 a r i z a n : e a n t o r
中提取 , 用无水乙醇配成储备液 , 过滤除菌 , 分装保
存 。 实验时 ,用 D 一ha n k’ s 稀释到终浓度的 10 倍 , 再
按 1 , 10 (工作液 , 培养基 ) 的比例加人培养基 中 ,
乙 醇终浓度小于 0 . 1% , 预实验证实 , 0 . 1%的乙 醇
对细胞几乎没有毒害作用 。
1
.
2 胃癌细胞系 : 人低分化 胃腺癌 细胞 系 M G c -
8 0 3 引 自北京市肿瘤防治研究所 ,培养 于含 10 %小
牛血清的 D M E M ( G ib e o 公司 )培养基 , 置于 3 7 ℃ 、
5% C O
: 培养箱 (美国 N a p e o ) ,培养基 中加双抗 。 细
胞接种后于指数生长期进行不同浓度的 b uf al in 处
理 , 相应时间后取材 ,进行各种指标的测定 。
2 方法和结果
2
·
1 b u f a li n 对 M G e 一 8 0 3 细胞 的生长抑制作用 : 台
盼蓝染色法进行活细胞计数 , 细胞接种 于 25 m L 培
养瓶 ,分用药组和对照组 ,每种处理于不同时间每次
取 3 瓶细胞分别计数 , 取平均值 。 活细胞数量变化见
表 1 。 其中大多为台盼蓝染色阳性细胞 (死细胞 ) ,细
胞增殖速度下降 , 。 . 01 拜m ol / L 及以上浓度处理组 ,
细胞在 O一 48 h 之间数 目先有小 幅增长 ,之后 ,细胞
数下降 , 直到近乎全部崩解 。
表 1 b u f a li n 作用 M G e 一 8 0 3 活细胞数 t 的变化
( 火 1 0 ` C F U /m L )
用药时间
( h )
药物浓度 (拜m ol / L )
0
.
0 0 0 0
.
0 0 1 0 0 10 0
.
10 0 1
.
0 0 0
0 1 4
0
.
3 5
0 0 0
0一J任1 00乙0 00厂J,ù只UlO白Q曰OJg一ēU01只J八勺05八了ifób门11立几乙
OQ乙0月比月`né48tl011止240248796
2
.
2 b u f a l i n 抑制 M G e 一 8 0 3 细 胞 的剂量 效应 : 将
M G c
一
8 0 3 胃癌细胞于对数生长期用 0 . 1 25 %胰蛋 白
酶消化 ,制 成单细胞悬液 ,调整细胞浓度 为 2 火 1护
C F U /m L
, 接种于 9 6 孔培养板 ,每孔加 2 0 0 拌L 细胞
悬液 , 培养 24 h 后 ,药物处理 4 组 ,分别加人不同浓
度 的 b uf al in ,并 设对 照组 (不加药 ) 和空 白组 (只有
培养 , 无细胞 ) ,每组均设 8 个复孔 ;继续培养 48 h ,
加人噬哇蓝 (M T T ) 2 0 拼L ( 1 m g /m L ) , 3 7 ` C , 孵育
4 h
,离心 , 加人 D M SO 2 0 0 拌L ,避光振荡 5 rn i n ,全
自动酶标仪 (上海三科仪器公司 )测 57 0 n m 处吸光
度 ( A 值 ) 。 抑制率按 以下公式计算 :
抑制率一 ( A 对照 一 A 实脸 ) / ( A 对 , 一 A 空白 ) 火 10 %
由表 2可见 , b u f a l i n 处理 4 8 h , O · 0 1 拼m o l / L 及
以上浓 度对 M G c 一 8 03 细胞具有显著 的抑制作用 ,
IC
S 。值在 0 . 1 拜m o l / I J 附近 。
表 2 b u r a一i n 作用 M G c 一 8 0 3 细胞的剂 . 效应
药物浓度
(拜m o l / L )
吸光度 A 值 ( x 士 , , n 一 8) 抑制率
实验组 对照组 空 白组
0
,
0 0 1
0
.
0 10
0
.
10 0
1
,
0 0 0
1
.
3 2士 0 . 14
1
.
2 3士 0 , 1 3 份
0
.
7 7士 0 . 7 0 价 肠 △
0 4 8 士 0 . 0 7 份 , ☆
1
.
4 3士 0 . 1 0 0 . 4 4士 0 , 0 6 器
2 0
.
2
6 6
.
7
9 6
.
0
与对照组比 : ` 尸< .0 01 ” 尸< .0 0 1 ; 与 .0 01 拌m ol l/ 一 组 比 : △尸 < .0 01 ; 与 0 . 1 拜m ol / L 组 比 : ☆ 尸< 0 . 0 1
2
.
3 细胞形态学观察 人 buf al in , 细胞起鼓 、 变圆 、 脱壁 ,悬浮细胞增多 (图
2
.
3
.
1 倒置光显微镜原位观察 培养细胞的形态学 1 ) 。
变化 : 倒置光显微镜下观察培养瓶中细胞生长的动 2 . 3 . 2 荧光显微镜观察细胞核染色质和胞浆 R N A
态 ,可见对照组细胞多贴壁生长 , 呈纤维细胞型 ,加 的变化 : 细胞接种于洁净盖玻片铺底的 6 孔培养板 ,