全 文 ：的作用机制主要涉及两个方面 [6 ] ,一是促进胰岛素
的分泌和释放或是抑制胰高血糖素的分泌 ;二是影
响胰岛素受体后代谢的某些环节 ,主要是抑制肝脏
的糖异生作用 ,其目的均是降低并控制血糖。本研究
从胰岛素水平、 C肽、胰岛素受体后效应探讨了百草
降糖片降低血糖的作用机制。
四氧嘧啶是一种特异性的 β细胞毒剂 ,能选择
性地破坏胰岛 β细胞 ,引起实验性糖尿病 [7 ]。结果显
示百草降糖片对四氧嘧啶所致的血糖升高有明显的
抑制作用 ,这表明百草降糖片可减弱四氧嘧啶对胰
岛 β细胞的损伤或改善受损伤的 β细胞的功能。
胰高血糖素能促进糖异生作用而使肝糖原输出
增多 ,百草降糖片能对抗这种作用。百草降糖片能增
加肝糖原、肌糖原的含量 ,另外降糖的同时 ,也能促
进正常小鼠和糖尿病大鼠胰岛素的分泌和增加 C
肽的含量。由此可说明百草降糖片降血糖作用机制
可能是一方面通过防止葡萄糖在肠道吸收 ,另一方
面通过改善胰岛功能 ,促进胰岛素分泌来降低血
糖的。
糖尿病对机体氧化应急增加 ,自由基及其产物
的产生和清除障碍与糖尿病 ,尤其是大血管、微血
管、神经并发症的发病有关 ,受自由基的作用 ,体内
生物膜中的多价不饱和脂肪酸发生过氧化反应 ,生
成 LPO,糖尿病患者中 LPO明显增高 ,测定 LPO
含量可反映机体脂质过氧化的速率和强度 [8 ]。 SOD
是机体清除氧自由基的一种重要酶 ,其活力的高低
与衰老、肿瘤及血液、心血管、内分泌系统等疾病有
着十分密切的关系 ,也可反映机体清除自由基能力
的高低。 已有较多资料表明 ,糖尿病模型及临床 Ⅰ
型、Ⅱ 型糖尿病 ,均存在着氧自由基代谢紊乱 , SO D
活性降低 , LPO增高 [9 ]。本实验结果表明 ,百草降糖
片能显著升高 SO D水平 ,降低 LPO含量 ,从而说
明百草降糖片具有明显的抗氧化作用和清除氧自由
基的能力 ,故百草降糖片对糖尿病并发症的发生也
可起到一定的预防和治疗作用。
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蟾蜍灵诱导白血病 HL-60细胞分化及相关基因表达
徐瑞成 1 ,陈小义 1 ,陈　莉 1 ,呼文亮 1 ,钱　进 2⒇
( 1. 武警医学院 ,天津　 300162; 2. 天津药物研究院 ,天津　 300193)
摘　要:目的　研究中药蟾酥中蟾毒成分蟾蜍灵 ( bufalin)的抗癌机制。方法　以早幼粒白血病 HL-60细胞为靶细
胞 ,应用电镜技术观察 bufalin诱导的细胞分化 ,免疫组化方法检测增殖细胞核抗原 ( PCN A)和细胞周期素依赖性
蛋白激酶抑制因子 p21WAF1的表达。 结果　 0. 001μmo l / L bufalin作用 HL-60细胞 ,细胞向粒细胞方向分化 ,
p21WAF1表达显著升高 ,而 PCN A表达显著下降 ,二者呈显著负相关 (P < 0. 01)。结论　 bufalin诱导 HL-60细胞分
化 ,与其上调 p21W AF1的表达、下调 PCNA表达有关。
关键词: 蟾蜍灵 ; HL-60细胞 ;细胞分化 ; p21WAF1;增殖细胞核抗原 ;基因表达
中图分类号: R286. 91　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2002) 02 0151 03
·151·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2002年第 33卷第 2期
⒇ 收稿日期: 2001-08-18基金项目:天津市自然科学基金重点项目资助　项目号: 013804311作者简介:徐瑞成 , 32岁 ,副教授 ,硕士。 主要从事细胞周期和细胞凋亡的研究 ,发表论文 10余篇。
HL-60 cell differentiation induced by bufalin and its relative gene expression
XU Rui-cheng
1 , CHEN Xiao-yi
1 , CHEN Li
1 , HU Wen-liang
1 , Q IAN Jin
2
( 1. Medical Co lleg e of Chinese People s A rmed Police For ces, Tianjin 300162, China;
2. Tianjin Institute of Pharmaceutica l Resear ch , Tianjin 300193, China)
Key words: bufalin; HL-60 cell line; cell dif ferentiation; p21
W AF1 ; prolifera ting cell nuclea r antig en;
g ene expression
　　我们既往的研究表明 ,蟾蜍灵 ( bufailn) 能有
效抑制早幼粒白血病细胞和胃癌细胞的生长 ,高浓
度 bufalin ( 0. 01μmol /L及以上浓度 )具有极强的
诱导凋亡作用 [1, 2 ] ,国外学者研究证实 , bufalin具有
诱导分化作用 [3, 4 ] ,这种双重作用机制可能与药物浓
度有关 ,本研究观察了低浓度 bufalin ( 0. 001μmo l /
L )诱导 HL-60细胞分化 ,以及对细胞周期素依赖
性蛋白激酶 ( CDK) 抑制因子 p21WAF1和增殖细胞
核抗原 ( PCN A)基因表达的调控作用。
1　材料
1. 1　药品试剂: bufalin的制备按我们以前报道的
方法进行 [ 2]。 RPM I 1640培养基为美国 Gibco公司
产品 , p21WAF1和 PCN A单克隆抗体购自美国 Santa
Cruz公司 ,二抗及检测试剂盒由武汉博士德公司提
供 ,胎牛血清由中国医学科学院血液学研究所生产 ,
其他试剂为国产分析纯。
1. 2　细胞株: HL-60细胞由中国医学科学院血液
学研究所吴克复教授惠赠 ,用 RPM I 1640培养 ,补
充 10% 胎牛血清、 100μg /mL链霉素和 100 U /mL
青霉素 ,在 37℃、 5% 体积 CO2孵育箱 (美国
Napco )中培养。每 2～ 4天传代 1次 ,在接种细胞处
于对数生长期时进行药物处理。
2　方法和结果
2. 1　 bufa lin诱导 HL-60细胞分化: 分别收集对照
组和 0. 001μmol /L bufalin处理 24 h的细胞 ,离
心 ,弃上清 ,加入 2% 戊二醛固定液 ,用吸管轻吹 ,
使细胞团块浮起 ,固定 30min,用 1% 锇酸后固定 2
h;酒精逐级脱水、渗透 ,环氧树脂包埋 ,超薄切片 ,
铀铅染色 ,在透射电镜下观察细胞形态学变化。 HL-
60细胞恢复了终末分化: 对照组 HL-60细胞呈类
圆形 ,胞核位于中央 ,胞浆有多数突起 ,乳头状或波
浪状 ,有极丰富的多聚及游离的核糖体 ,线粒体发育
不成熟 ,胞核染色质极丰富 ,常染色质高度不规则分
散 ,有大的核仁 (图 1-A) ;而药物处理组细胞呈分化
后的粒细胞样结构特征 ,出现分叶状核 ,核质比变
小 ,具备了吞噬能力 ,将凋亡小体吞噬 (图 1-B)。
2. 2　 Bufalin对 HL-60细胞 PCN A及 p21WAF1表达
A-对照组 ; B-药物处理组
图 1　 bufalin诱导 HL-60细胞分化的
形态学变化 (透射电镜 ,× 7 500)
的影响:将 0. 001μmol /L bufalin处理不同时相点
的细胞以 1× 106 cell /mL的浓度制备细胞悬液 ,均
匀涂于防脱片剂处理的玻片 ,形成直径为 0. 5 cm
细胞印迹 ,丙酮室温固定 30 min, 0. 01 mo l /L TBS
洗涤 2 min、 3次 ,滴加正常血清封闭液 ,室温 20
min甩干 ;加鼠抗人 PCN A或 p21W AF1单克隆抗体 ,
室温下作用 1 h, TBS洗涤 ;加生物素标记的羊抗鼠
单抗 ,室温下作用 30 min, TBS洗涤 ;加链酶亲和
素-碱性磷酸酶溶液 ( SABC-AP) ,室温下 20 min,
TBS洗涤 ,水洗 1次 ;用 BCIP /NBT 显色 10～ 30
min,水洗 ,干燥后水溶性封片剂封片 ;阴性对照以
磷酸缓冲液代替一抗 ,其余步骤相同。 显微镜 (日本
Nikon)下照相并计数 (选择 5个视野 ,计数显紫蓝
色的阳性细胞占总细胞的百分比 ,样本均值的比较
采用 t检验 )。 由图 2, 3可见 ,经 bufai ln处理后 ,
p21
WAF1表达增强 ,而 PCN A表达降低 ,二者呈显著
负相关 ( P < 0. 01)。
·152· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2002年第 33卷第 2期
与对照组比较: * P < 0. 05　* * P < 0. 01
A-对照组　 B-药物处理组
图 2　 bufalin对 HL-60细胞 p21WAF1表达的影响
与对照组比较: * P < 0. 05　* * P < 0. 01
A-对照组　 B-药物处理组
图 3　 bufalin对 HL-60细胞 PCNA表达的影响
3　讨论
实验结果显示 , bufalin处理 HL-60细胞以后 ,
电镜下可见诱导分化的细胞将凋亡小体作为异己分
子吞噬。实际上 ,在组织中是具有吞噬功能的细胞对
凋亡小体进行吞噬 [5 ] ,在本实验体系中 , HL-60细胞
被诱导分化成粒细胞样细胞 ,也具备了吞噬能力。从
而在形态学方面证明 bufalin的诱导分化作用。
bufalin诱导肿瘤细胞分化的机制还不是很清
楚。Numazaw a等应用 bufalin诱导人单核细胞白血
病 THP-1细胞分化时 ,下调 c-myb和 c-myc的表
达 ,诱导 c-fo s和 eg r-1的转录 [ 3]。c-myc和 c-fos是
细胞周期早期基因 ,与细胞周期调控密切相关。
bufalin与分化诱导剂维甲酸 ( RA)联用 ,诱导原代
培养的急性早幼粒白血病 ( APL)细胞分化 ,表现
极
强的协同作用 ,在有些病例中 , bufalin恢复了 RA
耐受的 APL细胞对 RA的敏感性 ,但机制不明 [4 ]。
p21
WAF1是细胞周期素依赖性激酶 ( CDK)的抑
制因子 ,已知 p21W AF1的表达调控与抑癌基因 p53密
切相关。 p53蛋白的积聚 ,可使细胞停滞于 G1晚
期 ,目前认为 p53蛋白的这种作用是通过调节
p21
WAF1的基因表达来实现的 , p53通过与 p21WAF1编
码区上游的 p53结合点的结合 ,以促进 p21W AF1的表
达 [6 ]。p21WAF1可抑制 CDK和 PCN A,阻断细胞周期
进程 ,在某些肿瘤细胞 , p53基因突变 , p21WAF1表达
水平极低 ,导致细胞增殖失控 [7 ]。我们用 bufalin处
理 HL-60细胞 , p21WAF1基因表达较对照组显著升
高 ,而且抑制了 PCN A的表达 ,此结果提示 bufalin
可通过促进抑癌基因 p21WAF1的表达 ,从而抑制细胞
增殖 ,促进细胞分化。
最近 , Kaw azoe等 [8 ]克隆了一个受 bufalin调节
的细胞分化和凋亡的相关基因 Tiam l,在其正义链
转染细胞中 , p21激活蛋白激酶 ( p21 activ ation
kinase, PAK)的活性显著升高 ,可见 bufalin诱导
癌细胞分化和凋亡与 CDK抑制因子的表达密切相
关 ,它们相互作用的机制有待进一步研究。
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·153·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2002年第 33卷第 2期