全 文 ：#资源与鉴定#
香港市售蒲公英及其混淆品土公英
的 ⁄指纹鉴别研究
曹晖 3 毕培曦 香港中文大学生物系及中药研究中心
邵鹏柱 香港中文大学生物化学系及中药研究中心
摘要 采用分子生物技术包括任意引物聚合酶链式反应°2°≤  和随意引物扩增的多态性 ⁄
 °⁄方法扩增蒲公英及其 种土公英混淆品的基因组 ⁄ 获得清晰可靠的 ⁄ 指纹图谱 ∀根据
琼脂糖凝胶上显示的 ⁄带型差异可鉴别蒲公英和土公英混淆品 ∀
关键词 药材鉴定 蒲公英 聚合酶链式反应 ⁄指纹图谱
蒲公英性味甘 !苦 !寒 具有清热解毒 !消痈
散结 !利尿通淋的功效 用于治疗乳痈肿痛 !疔
疮热毒 ∀但是全国各地所用蒲公英品种除5中
国药典6年版规定的菊科蒲公英属植物蒲
公英 Ταραξαχυ µ µονγολιχυ µ 2 碱
地蒲公英 Τ . σινιχυ µ 外≈ 尚有 种同
科不同属的植物在我国南方部分省区以/土公
英0之名当作蒲公英使用≈  其中毛大丁草
Πιλοσελλοιδεσ ηιρσυτα混作蒲公英使用系作者在
香港调查土公英时首次发现≈ ∀从收集到的部
分土公英药材样品看均属未抽花葶的幼苗 外
观性状上颇为相似 但是与蒲公英是完全不同
基原的一类药材 应视为蒲公英的混淆品种 ∀
传统的中药鉴别方法主要依据外观性状特
征 这需要经验的积累 但具有主观性 ∀现代生
药学方法则从生物分类学 !细胞组织学 !化学角
度建立了比较客观 !准确的中药鉴别标准 ∀随
着 年代初 ⁄ 分析技术的发展 分子生物
技术如聚合酶链式反应°≤  已经用到了生物
亲缘关系的研究领域≈  ∀在 ⁄ 分子水平 
任意引物聚合酶链式反应°2°≤  和随意引
物扩增的多态性 ⁄ °⁄的 ⁄ 指纹方
法在中药材人参和西洋参≈  !甘草≈ !龟板和
鳖甲≈ !苦地胆≈ !淫羊藿≈的鉴定方面已获
得成功 ∀
本文报道由 °2°≤  和  °⁄技术产生的
⁄指纹图谱鉴别蒲公英及其混淆品土公英 
供同道参考 ∀
1 材料与方法
111 植物样品
蒲公英及其 种混淆品土公英植物的新
鲜或腊叶标本以及药材标本系在香港收集 均
经作者鉴定 学名见表  ∀
表  香港市售蒲公英及其混淆品土公英的基原
样品 基原 使用地区 收集时间 备注
蒲公英 蒲公英 Ταραξαχυ µ µ ονγολιχυ µ 全国  )  商品药材 ≤ 
土公英  地胆草 Ελεπηαντοπυσσχαβερ 广东 !香港  )  商品药材 ≤ 
土公英  一点红 Ε µιλια σονχηιφολια 福建 !广东 !云南  )  商品药材 ≤ 
土公英  苦荬菜 Παραιξερισ δεντιχυλατα 福建  )  新鲜标本  ≤ 
土公英  毛大丁草 Πιλοσελλοιδεσ ηιρσυτα 湖南 !广西 !香港  )  腊叶标本 ≥≠ ∏
土公英 ∏ 山莴苣 Πτεροχψπσελα ινδιχα 福建 !台湾  )  新鲜标本  ≤ 
土公英 √ 苦苣菜 Σονχηυσ αρϖενσισ 云南 !广西  )  商品药材 ≤  
3 现址 中国中医研究院中药研究所 北京 
## 中国中药杂志 年第 卷第 期
植物凭证标本存香港中文大学生物系标本
馆 商品药材标本存香港中文大学中药研究中
心博物馆 ∀
112 试剂
¬ ≤ × 提取缓冲液  ×2≤
1 1 ≤  ∞⁄×  
 十六烷基三甲基溴化铵≤ ×  1  2
巯基乙醇 ∀
¬ ≤ × 沉淀缓冲液   ×
≤   ∞⁄×    ≤ × ∀
  ≤ ×  溶液   ≤ × 1
≤∀
×∞缓冲液  ×2≤1 
 ∞⁄×  ∀
¬ ×∞ 电泳缓冲液    ×2硼
酸盐   硼 酸   ∞⁄× 
1 ∀
¬Ταθ缓冲液  ×2≤ 
    ≤ 1  ≤ 
1  明胶 ∀
113 仪器
德国 水浴槽 日立 2型分光光
度计 ∏ 2型离心机法国 ≥∏
公司 2 电泳仪⁄ ≥∏ ≤× 电泳槽
和 °° 电源 ƒ×≥2型 °≤  仪
美国 ≤ 公司 ∀
114 总基因组 ⁄提取与纯化
根据 ⁄和 ≥的植物 ⁄ 提取方
法≈加以改进 ∀种植物叶片经蒸馏水洗净后
剪碎 在乳钵中用液氮冷却粉碎成细粉 ∀取
细粉加入  倍预热至  ε 的 ¬ ≤ × 
提取缓冲液 于  ε 水浴中保温反应 加
入等量氯仿 异戊醇Β于离心机上以  
离心 取上清液加 1倍   ≤ × 
溶液 室温下放置 再用氯仿2异戊醇提取
一次 ∀取上清液加等量¬ ≤ × 沉淀缓冲液于
室温下过夜 以  离心 ∀倾去上
清液 粗 ⁄ 沉淀用  和  乙醇各洗两
次 然后于  ε 烤箱中干燥 加入 Λ
×∞缓冲液溶解 ⁄ 存于  ε 备用 ∀
粗 ⁄采用乙醇沉淀法纯化≈ ∀
115 ⁄定性定量检测
11511 ⁄分子长度
取 Λ提取的 ⁄ 溶液于  琼脂糖凝
胶上 用 ¬ ×∞电泳缓冲液在 ∂ 电泳 
小时 琼脂胶上 ⁄谱带通过溴化乙锭染色后
在紫外光下观察并采用 °
型≥ 胶片照相 ∀ ⁄ 分子长度与 Κ
Ηιν 标记物公司比较 ∀
11512 ⁄溶液纯度及得率
取一定量 ⁄ 溶液稀释后于日立 2
型分光光度计测定 及 值 ∀ ⁄ 纯度
按 之比值判断 得率按浓度  ¬
Λ值计算求得表  ∀
表  蒲公英及土公英的基因组 ⁄测定数据
样品 纯度 得率 
蒲公英 1 1
土公英  1 1
土公英  1 1
土公英  1 1
土公英  1 1
土公英 ∏ 1 1
土公英 √ 1 1
116 ⁄扩增
11611 °2°≤  ≈
取  ∗ 样品的基因组 ⁄ 作模板
⁄ 加入 ×°× ° × ° × ≤° × ×°
各 1   Λ引物   ƒχ2
≤ ≤≤ × × × × ≤≤≤ × ≤ ≤ ≤2χ和 
 χ2× ≤ × ≤ ≤ ≤ ≤ 2χ 
1 Ταθ ⁄ 聚合酶°2∞≤∏公
司及 ¬ Ταθ 缓冲液使最终反应体积为 Λ
置于 ƒ×≥2型 °≤  仪 先按下述参数进行 
个 °≤  循环  ε  ε  ε 
∀然后按下述参数进行 个 °≤  循环 
 ε  ε  ε ∀最后下述
参数进行  个 °≤  循环  ε  ε 
 ε ∀
11612  °⁄≈
取  样品 ⁄ 加入 1 
×° 1Λ引物°≤2Βχ2≤ 2
## 中国中药杂志 年第 卷第 期
≤ × ≤2χ  ×公司 1 
Ταθ ∆ΝΑ聚合酶及λξ Ταθ缓冲液使最终反应
体积为 Λ置于 ƒ×≥2型 °≤  仪 按下述
参数进行  个 °≤  循环  ε  ε 
 ε ∀
117 °≤  扩增产物检测
取 °≤  反应液 Λ于 1  琼脂糖凝胶
上用¬ ×∞电泳缓冲液电泳 °≤  扩增产物长
度与  ⁄ 标记物°公
司比较 ∀
118 数据分析
电泳照片经扫描存于计算机 ×ƒ 文件中 
采用  ±∏× 程序 ∏⁄
公司进行 ⁄指纹的图象处理 并采用 ⁄
≥ ⁄∞÷ 程序≈计算求得其相似度指数≥2
 ¬ ∀
2 结果与讨论
211 在本研究中 除苦荬菜和山莴苣新鲜材料
可提取到大量的基因组 ⁄外 腊叶标本的干
叶材料亦可用 ≤ × 法提取到少量 ⁄图 
中第 带为贮藏 年之久的毛大丁草腊叶标
本材料 其 ⁄ 分子长度约 1∀在小分
子区尚存在许多  分子 通过加ΛΛ
图  蒲公英及其混淆品土公英的基因组
⁄琼脂糖凝胶电泳图谱
1 地胆草 1 一点红 1 苦荬菜 1 毛大丁草
1 山莴苣 1 苦苣菜 1 蒲公英
 ΚΗιν  ⁄ 分子标记物⁄分子带长度自上而下
为     和 
图  蒲公英和土公英的 °  °≤  指纹图谱
   ƒ 
1 地胆草 1 一点红 1 苦荬菜 1 毛大丁草
1 山莴苣 1 苦苣菜 1 蒲公英
  ⁄ 分子标记物⁄分子带长度
自下而上为   ,
图  蒲公英和土公英的  °⁄指纹图谱
1 地胆草 1 一点红 1 苦荬菜 1 毛大丁草
1 山莴苣 1 苦苣菜 1 阴性对照 1 蒲公英
  ⁄ 
  酶于  ε 保温 分解 不影响 °≤  扩
增 ∀对于中药材来讲 器官组织多经过干燥处
理 且储藏时间较长 ⁄ 分子易降解和受到
污染 故我们在提取商品药材蒲公英 !地胆草 !
一点红和苦苣菜的 ⁄ 时 采用   乙醇清
洗样本组织和用液氮粉碎 并参考  和
## 中国中药杂志 年第 卷第 期
方法≈改用 ¬ ≤ × 提取缓冲液 并
加   °∂ °分子量  以排除色素主要为
植物细胞壁中的多糖类及多酚类化合物产生的
棕色物资干扰 °≤  反应 同时在 °≤  反应中
设立阴性对照无模板 ⁄ 结果比较满意
数据另文报告 ∀
212 表 2 显示了 ⁄ 定性定量分析结果 ∀
⁄溶液的纯度为 1 ∗ 1 而理论上 1为
最纯 从而表明所提样品中的 ⁄纯度有待改
进 ∀另外一方面 从所提 ⁄ 的得率分析 干
燥药材与新鲜标本相差不太大 其中蒲公英商
品药材的 ⁄得率较大达 1而腊叶
标本毛大丁草的 ⁄得率最低为 1
与图 的结果相符 ∀
213 °≤  方法中 °2°≤  和  °⁄均可产生
⁄指纹图 前者所用引物为  ∗ 个核苷
酸而后者为 个 ∀图 和图 显示了在蒲公
英和 种土公英之间存在着明显的 ⁄ 指纹
差异 ∀利用这些 ⁄ 指纹差异可鉴别蒲公英
及其混淆品 ∀从相似度指数值亦可看出蒲公英
与 种土公英之间 ⁄ 指纹的平均相似度指
数值只有   ∗   完全是属间差异表  ∀
表  °2°≤  和  °⁄推导的蒲公英与土公英
的相似度指数
样品
引物
 ƒ   °≤  
相似度指
数平均值
蒲公英 ∂ ≥土公英  1 1 1 1
蒲公英 ∂ ≥土公英  1 1 1 1
蒲公英 ∂ ≥土公英  1 1 1 1
蒲公英 ∂ ≥土公英  1 1 1 1
蒲公英 ∂ ≥土公英 ∏ 1 1 1 1
蒲公英 ∂ ≥土公英 √ 1 1 1 1
214 前文已经报告≈  不同产地和不同时间
采集的同一植物如人参 !西洋参 !地胆草与白
花地胆草基因组 ⁄ 指纹图谱基本不变 此
证明 °≤  方法在中药鉴定上的稳定性和重现
性 ∀从本研究也可看出  °⁄方法所需样品
基因组 ⁄ 量仅为 °2°≤  的 左右 而
且  °⁄所用引物可以商品化生产 因此 
 °⁄方法更具快速 !有效 !微量 !方便的优点 
它在中药鉴定方面比其它 °≤  技术也更具有
广阔的应用范围和前景 ∀
3 参考文献
 中国药典 一部  
 谢宗万 中药材品种论述 中册 第 版 上海 上海科学技
术出版社  
 冯毓秀等 中药志 第 册 第 版 北京 人民卫生出版社 
 
 ≤  ° ≥∏ ≤ 
 / ∏ ⁄ ⁄0 °⁄ ×× ≤ √
  
 °°     
 •   ∏     
 ≥ ° ≤ °    
 ≠ ∏    
 ≠ ∏    
 王亚明等 药学学报   
 ≤  药学学报   
   ° ∏  
 ⁄°×  
∞¬   ∏
≥°∏ ≤ 
 × ⁄  ≤∏°  ∏ ∂ 
 ≠ •   ≥   
 • ∏    
 •    ∏    
 ≥⁄  ∏  
  ≥  °   
致谢 本研究得到香港政府研究资助局≤  
  资助 ∀
 )  ) 收稿
中医药现代化战略研讨会征文通知
征文内容 中医药现代化的含义 中医药现代化与中西医结合 !继承与发扬的关系 中医药临床现代化的内容
和措施 中医药教育现代化的内容和措施 中药生产的现状及实现中药现代化的措施 中医药科研的现状及如何适
应中医药现代化的要求 与中医药现代化的相关内容 ∀征文要求 每篇征稿限 字以下 字以内摘要 来稿
请尽量打印或用正楷方格纸抄写 自留底稿 恕不退稿 欢迎中医药管理部门 !中医药专家 !关心中医药的相关人士
组稿 征文截止日期 年 月 日 请在信封右上角注明/战略0字样 ∀来稿请寄 北京樱花东路甲 号
中国中医药学会学术部 ∀电话  传真  ∀ 中国中医药学会
## 中国中药杂志 年第 卷第 期