全 文 ：中国生态农业学报 2015年 11月 第 23卷 第 11期
Chinese Journal of Eco-Agriculture, Nov. 2015, 23(11): 14291436


* 国家自然科学基金项目(31170228, 31272239)、河北省自然科学基金杰出青年基金项目(C2013503042)和荒漠与绿洲生态国家重点实验
室开放基金项目资助
** 通讯作者: 徐进, 主要研究方向为植物营养与逆境生物学。E-mail: xujin@xtbg.ac.cn
罗琼, 主要研究方向为植物营养与逆境生物学。E-mail: 576303872@qq.com
收稿日期: 20150301 接受日期: 20150908
* This work was supported by the National Natural Sciences Foundation of China (No. 31170228, 31272239), the Hebei Province Natural
Sciences Foundation for Distinguished Young Scientists (No. C2013503042), and the Key Project of State Key Laboratory of Desert and
Oasis Ecology, Xinjiang Institute of Ecology and Geography of Chinese Academy of Sciences.
** Corresponding author, E-mail: xujin@xtbg.ac.cn
Received Mar. 1, 2015; accepted Sep. 8, 2015
http://www.ecoagri.ac.cn
DOI: 10.13930/j.cnki.cjea.150245
重金属超富集植物龙葵对镉响应的蛋白组学分析*
罗 琼1 葛 青2 刘小京4 谢志霞4 张 苹1 潘响亮5 徐 进1,2,3,5**
(1. 青海师范大学生命与地理科学学院 西宁 810008; 2. 山西农业大学园艺学院 太谷 030801; 3. 中国科学院西双版纳
热带植物园 勐腊 666303; 4. 中国科学院遗传与发育生物学研究所农业资源研究中心 石家庄 050022; 5. 荒漠与绿洲生
态国家重点实验室/中国科学院新疆生态与地理研究所 乌鲁木齐 830011)
摘 要 龙葵是典型的重金属超富集植物, 但是我们对其重金属耐受和超富集的分子机理仍不完全清楚。为
了从蛋白组学层面探究重金属超富集植物龙葵如何响应金属镉, 本研究采用双向电泳和MALDI-TOF MS分析
方法, 鉴定了重金属超富集植物龙葵叶片和根中 Cd胁迫下差异表达的蛋白。双向电泳在根和叶片中分别至少
得到 927和 1 025个蛋白点, 其中 Cd胁迫下差异表达的蛋白点在根中有 45个, 叶片中有 57个。采用 MALDI-
TOF MS分析, 在根和叶片中分别鉴定了 9个和 12个蛋白点, 分别代表了 9个和 6个差异表达的蛋白。生物
信息学分析表明, 这些蛋白涉及到激素合成、防御响应、能量代谢和细胞结构等。这些结果为进一步揭示重
金属超富集植物龙葵响应 Cd胁迫的分子调节机制，以及为通过现代生物技术手段进行重金属污染的植物修复
提供了理论依据。
关键词 镉 龙葵 差异表达蛋白 双向电泳 质谱 生物信息学
中图分类号: X592 文献标识码: A 文章编号: 1671-3990(2015)11-1429-08
Proteomic analysis of Cd-responsive proteins in hyper-accumulator
Solanum nigrum*
LUO Qiong1, GE Qing2, LIU Xiaojing4, XIE Zhixia4, ZHANG Ping1, PAN Xiangliang5, XU Jin1,2,3,5**
(1. College of Life Science and Geography, Qinghai Normal University, Xining 810008, China; 2. College of Horticulture, Shanxi
Agricultural University, Taigu 030801, China; 3. Xishuangbanna Tropical Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, Mengla
666303, China; 4. Center for Agricultural Resources Research, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy
of Sciences, Shijiazhuang 050022, China; 5. State Key Laboratory of Desert and Oasis Ecology, Xinjiang Institute of Ecology and
Geography, Chinese Academy of Sciences, Urumqi 830011, China)
Abstract Solanum nigrum is a typical heavy metal-hyper-accumulator. However, the molecular mechanisms underlying the
tolerance and accumulation of heavy metal have remained largely unclear. To through light on the mechanism of Cd
accumulation in Cd hyper-accumulator S. nigrum, we investigated the response of S. nigrum to Cd toxicity at root and leaf
proteomic levels using 2-DGE technique. The root and leaf 2-DGE maps, respectively, consisted of at least 927 and 1 025
reproducible protein spots, of which 45 and 57 were classified as differentially expressed proteins. Through MALDI-TOF MS
analysis, 9 and 12 of the spots identified, representing 9 and 6 proteins in root and leaf, respectively. The proteins were
involved in phytohormone synthesis, defense responses, and energy metabolism and construction. This showed that proteomic
analysis explained Cd response mechanisms in hyper-accumulator S. nigrum. It also provided theoretical basis for
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phytoremediation of heavy metal-contaminated soils through modern biotechnology.
Keywords Cadmium; Solanum nigurm; Differentially expressed protein; 2-DGE technique; Mass spectrum; Bioinformatics
近年来, 随着人类不合理地进行农业和工业生
产, 使得土壤重金属污染日益严重[1]。镉(Cd)是土壤
主要重金属污染物之一 , 它通过植物的根系进入
植物体内 , 并在植物的可食用器官累积 , 进而被
人类取食 , 严重危害人类的健康 [2]。因此 , 清除土
壤重金属污染, 从而保证食品安全是目前面临的严
重问题。
龙葵(Solanum nigurm)是 Cd超富集植物[35], 其
叶片中含 Cd量达 125 μgg1(DW)时植株依然健康存
活 , 无明显病斑和生长受抑制的现象 , 且其生长
迅速、生物量大 , 是富有优势的 Cd 超富集植物 [6]。
因此, 龙葵被认为是研究重金属超富集作用的理想
材料 , 也是进行重金属污染土壤生物修复的先锋
植物 [78]。龙葵根部向茎叶的重金属运输能力较强,
包括 Cd、Zn、Ni、Co等[9]。前人研究表明, 龙葵的
高耐 Cd 毒害能力归因于其体内高效降解活性氧和
较高 Cd 解毒代谢机制[10]。众多试验数据证明龙葵
在 Cd 处理后, 其根部超氧化物歧化酶(SOD)和过氧
化氢酶(CAT)的活性显著增加 , 清除过剩的超氧自
由基(O2•−)和 H2O2[8,11]。此外, 为了耐受较高浓度的
重金属胁迫, 植物体内产生的金属结合分子, 如组
氨酸、其他有机酸、植物螯合肽、金属硫蛋白(MT)
等, 对重金属离子起隔离、运输和贮藏的作用, 以降
低对细胞的伤害[1214]。赵宇等[15]研究表明高浓度 Cd
处理提高了龙葵幼苗根尖细胞的死亡率和 MDA 水
平, 油菜素内酯(BR)加深这种伤害程度, 降低幼苗
抗氧化酶活性。有研究表明, 龙葵遭受 Cd毒害后其
根部的两个金属转运蛋白基因——镁转运蛋白基因
MGT 和 HMA, 和一个 ZIP 转运蛋白基因 IRT1 表达
量持续增高[5]。龙葵对 Cd的超富集作用在分子和生
理水平都有较为透彻的研究, 然而对于其蛋白组水
平的研究尚未深入。本研究采用双向电泳技术对 Cd
处理龙葵的叶片和根部蛋白进行分离和差异比较分
析, 致力于从蛋白组学层面揭示龙葵对Cd的超富集
作用, 为通过现代生物技术手段进行重金属污染的
植物修复提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与处理
龙葵种子用 15%次氯酸钠消毒 15 min, 无菌蒸
馏水洗净后, 播种在 1/2 MS(Sigma, UK)[16]培养基
(含 8% Agar)上, 光周期 16 h︰8 h( ︰白昼 黑夜), 光
强 4 000~5 000 lx, 22 ℃无菌条件下生长 10 d。选取
长势一致的幼苗移栽入 1/2 Hoagland水培营养液[17],
依照前培养条件培养 4周, 每 5 d换取新鲜营养液。
随后将龙葵幼苗进行如下处理: 1)1/2 Hoagland营养
液作为对照(CK); 2)含有 50 μmolL1 CdCl2 的 1/2
Hoagland 营养液作为处理组。处理 2 d后分别对 CK
组和处理组的叶片和根部进行取样。
1.2 总蛋白提取
1)对照和 Cd处理组叶片、根各取 1 g样品加入
10%聚乙烯吡咯烷酮(PVP), 迅速液氮研磨; 2)加入
预冷丙酮冰浴沉淀 30 min, 12 000 rmin1 4 ℃离心
30 min; 3)弃上清, 加入 10%TCA-丙酮+1%DTT, 20 ℃
沉淀 6~8 h; 4)12 000 rmin1 4 ℃离心 30 min去上清;
5)加含 0.07%DTT 和 1 mmolL1PMSF 的预冷丙酮,
冰浴沉淀 60 min, 12 000 rmin1 4 ℃离心 30 min去上
清; 6)加入 90%丙酮, 12 000 rmin1 4 ℃离心 30 min,
去上清; 7)重复步骤 6); 8)室温晾干沉淀, 加适量裂
解液和 50 μgmL1 DNase I, 12 000 rmin1 4 ℃离心
30 min, 取上清, Bradford法[18]测蛋白质浓度, 80 ℃
保存。
裂解液: 8 molL1 尿素, 2 molL1 硫脲, 0.5%
(w︰v)CHAPS, 2%(w︰v)两性电解质, 1%DTT(美国
Sigma), 1 mmolL1PMSF(美国 Sigma)。
1.3 双向电泳
第一向等点聚焦: 用溶胀缓冲液将 IPG 预制胶
条泡胀 12 h 后, 放入聚焦槽内, 加入矿物油至没过上
样杯, 上样量为 1 mg, 并用溶胀 buffer稀释至 170 L。
设置好等电聚焦程序进行聚焦。
第二向 SDS-PAGE 电泳: 将聚焦完的胶条立即
在平衡缓冲液中进行两次平衡, 结束后将胶条放到
已配好的 12%丙烯酰胺凝胶上端, 再用 0.5%的琼脂
糖将胶条和 marker 封严, 并将胶板固定于电泳槽内
进行电泳。
染色, 脱色: 将凝胶放入装有染色液的水平盘
内 , 并将水平盘置水平摇床上水平振荡过夜染色 ,
然后浸于脱色液中, 水平摇床振荡, 最后 MQ 再洗
涤 30min。
凝胶图像分析: 将脱色完成的胶条放入凝胶成
像仪, 扫描, 300 DPI透射扫描。
1.4 蛋白分离纯化
将胶块上蛋白点小心切取下来, 清洗胶块, 备用。
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1.5 质谱分析
采用 4 700 Plus MALDI TOF/TOFTM Analyzer
(Applied Biosystems, Foster City.CA)对样品进行
MALDI-TOF-TOF 质谱分析, 使用 TOF/TOF Ⅱ (Bruker)
分析得到肽指纹图谱(PMF)数据, 在 NCBInr 20110409
(13 655 082 sequences; 468 607 983 residues)数据库
中比对, PMF 的可信度取决于其概率和 E 值得分,
肽段质量误差 0.1 Da, TOF-TOF碎片误差 0.3 Da。置
信区间 95%以上。
2 结果与分析
2.1 双向电泳图谱比较
本研究采用等电点聚焦和 SDS-PAGE 双向电泳
的试验方法 , 分别分离 Cd 处理前后龙葵根系和
叶片蛋白样品 , 结果如图 1 所示。植物蛋白大部
分属于酸性蛋白 [19], 故本试验选用 pH 4.0~6.9
的胶条来分离龙葵根系和叶片的蛋白质。双向电
泳试验通过 3 次生物学重复 , 图片中背景清晰 ,
蛋白点清晰 , 横向和纵向拖尾较少 , 且图 1c、d
中 RuBisco 大亚基条带明亮清晰 , 试验结果稳定
可靠。
双向电泳在龙葵根部蛋白至少分离得到 927
个蛋白点 , 其中 Cd胁迫下差异表达的蛋白点有 45
个(图 1a, b); 龙葵叶片中至少分离得到 1 025个蛋
白点 , 其中 Cd 胁迫下差异表达的蛋白点 57 个
(图 1c, d)。

图 1 对照(a, c)和 Cd处理(b, d)龙葵(Solanum nigurm)根部(a, b)及叶片(c, d)双向电泳图谱
Fig. 1 Two-dimensional electrophoresis (2-DE) reference maps of Solanum nigurm with (b, d) or without (a, c) Cd stress
for the root (a, b) and leaves (c, d) proteomes
2.2 质谱鉴定结果分析
对龙葵根系和叶片双向电泳图谱结果进行比较,
从中选取部分Cd胁迫条件下变化幅度在 2倍以上的
蛋白差异点, 进行 MALDI-TOF MS分析, 结果见表
1。在根和叶片中分别鉴定到 9个和 12个蛋白点, 分
别代表 9个和 6个差异表达的蛋白。
根中鉴定出的 9 个差异表达蛋白包括 : 1 个类
细胞死亡相关蛋白(Sn606), 1个 S-腺苷甲硫氨酸合
成酶(SnS602), 1 个 S-腺苷甲硫氨酸(SAM)合酶 2
(Sn680), 1 个硫酸腺苷酰转移酶(Sn692), 1 个 2-磷
酸甘油酸脱水酶(Sn756), 2个 14-3-3蛋白(SnS1213,
SnS1319), 1 个 14-3-3 蛋白 2(SnS1240)和 1 个未知
蛋白(SnS1011)。叶片中鉴定出的 12 个差异表达蛋
白包括 : 1个黄嘌呤脱氢酶 XDH(Sn1155), 1个叶绿
体锰稳定蛋白 MSP-Ⅱ(Sn1262), 8 个 8S 球蛋白 α
亚基前体 (Sn1508, Sn1509, Sn1510, Sn1511,
Sn1514, Sn1516, Sn1522, SnS464), 其中 6 个经鉴
定为同一个蛋白(gi|108743972), 另外 2 个经鉴定
为同一个蛋白(gi|108743974), 因此这 8 个蛋白为
两个差异表达蛋白 , 1 个 1,5-二磷酸核酮糖羧化酶 /
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加氧酶(RuBisco)大亚基(Sn788), 还有 1 个未知蛋
白(Sn1158), 总共为 6 个特意差异表达蛋白。生物
信息学分析表明 , 这些蛋白涉及到激素合成、防御
响应、能量代谢和细胞结构等。图 2 和图 3 直观
地显示出了这些龙葵根部和叶片特异表达蛋白的
差异。

图 2 Cd胁迫条件下龙葵根部特异差异表达蛋白点
Fig. 2 Identified protein spots in the roots of Solanum nigurm under control and Cd stress conditions
2.2.1 Cd胁迫下龙葵根系表达上调的蛋白分析
由表 1 可知, 在龙葵根部, Cd 胁迫下表达上调
的蛋白有: 1个防御响应相关蛋白 SAM合酶 2, 2个
能量代谢相关蛋白硫酸腺苷酰转移酶和 2-磷酸甘油
酸脱水酶。
激素在调节植物对重金属耐受过程中扮演着重
要作用, 但是, 激素是如何调节植物 Cd的耐受过程
还缺乏深入研究。乙烯和多胺是植物响应逆境的两
种重要激素[2021]。SAM是乙烯和多胺的合成前体[22],
如表 1所示, SAM合酶 2在 Cd胁迫下龙葵根部表达
量上调, 该结果同前人在托鲁巴姆(Solanum torvum)
试验中结果相吻合[23]。SAM合酶 2催化合成乙烯合
成前体 S-腺苷甲硫氨酸 SMA, 进而可以增加植物乙
烯的合成, 对植物增强抗逆性有诸多益处。
龙葵根部两个能量代谢蛋白硫酸腺苷酰转移酶
和 2-磷酸甘油酸脱水酶在 Cd 胁迫条件下都有所增
加。硫在环境中以多种化合价态形式存在, 从+6 价
至2 价 , 在植物同化硫元素的首要一步是在硫酸
腺苷酰转移酶的催化下合成腺苷-5-磷酸硫酸酐
(APX)[24], 硫酸腺苷酰转移酶的增加在一定程度上
反映了硫同化的上升。2-磷酸甘油酸脱水酶催化磷
酸甘油酸形成磷酸烯醇式丙酮酸, 是糖酵解途径的
惟一脱水步骤[25]。2-磷酸甘油酸脱水酶的提升说明,
在 Cd胁迫下, 龙葵根部能量代谢趋于升高。
2.2.2 Cd胁迫下龙葵根系表达下调的蛋白分析
在重金属 Cd 胁迫下, 龙葵根系表达下调的蛋
白主要是防御响应相关蛋白, 包括 1 个类细胞死亡
相关蛋白、1个 S-腺苷甲硫氨酸合成酶、2个 14-3-3
蛋白和 14-3-3蛋白 2。
关于该类细胞死亡相关蛋白(gi|53792869)的功
能尚未揭示, 它在 Cd胁迫后龙葵根部表达下调, 其
作用还有待进一步研究。
本研究发现龙葵根部 14-3-3 蛋白在 Cd 处理下
表达量下调。14-3-3 蛋白以二聚体的形式出现, 在
众多蛋白磷酸化过程中都起重要作用, 缺乏 14-3-3
蛋白的突变体致死 , 可以看出 14-3-3 蛋白在植物
生存过程中的重要性 [26]。14-3-3 蛋白调节植物细
胞膜 H+-ATPases, 有研究表明磷酸化的钙依赖型
蛋白激酶(calcium dependent protein kinase, CDPK)、
H+-ATPases和 14-3-3蛋白在植物胁迫响应途径中相互
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图 3 Cd胁迫条件下龙葵叶片特异差异表达蛋白点
Fig. 3 Identified protein spots in the leaves of Solanum nigurm under control and Cd stress conditions
作用, 激活 H+-ATPases[27]。前人在 Cd胁迫托鲁巴姆
的试验中, 也同样发现Cd胁迫降低了托鲁巴姆根部
14-3-3蛋白 4的丰度[23]。龙葵根系 2个 14-3-3蛋白
和 1个 14-3-3蛋白 2同时下调, 说明 Cd胁迫已经影
响到龙葵 14-3-3 蛋白相关磷酸化作用和其他蛋白间
的互作。14-3-3 蛋白在植物响应重金属途径上的分
子机制有待于进一步揭示。
2.2.3 Cd胁迫下龙葵叶片差异表达蛋白分析
叶片中蛋白的变化也十分明显, Cd 胁迫下表达
量上调的蛋白只有功能未知的 Sn1158蛋白点, 而其
余能量代谢相关和细胞结构相关蛋白都在 Cd 胁迫
下表达量降低。能量代谢相关蛋白包括: 1个黄嘌呤
脱氢酶(XDH), 1 个植物锰稳定蛋白 MSP-Ⅱ, 1 个
1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RuBisco)大亚基。
细胞结构相关蛋白包括 2个 8S球蛋白 α亚基。
Cd 胁迫条件下, 龙葵叶片黄嘌呤脱氢酶(XDH)
含量下降。XDH 催化黄嘌呤和次黄嘌呤生成尿酸,
有研究表明, XDH 还与激素代谢、活性氧代谢、氮
代谢等过程有关[28], XDH 含量的下降表明 Cd 胁迫
使龙葵叶片嘌呤代谢受阻。
与光系统Ⅱ(PSⅡ)相关的 3 个外周多肽, 大部
分功能还未知, 它们携带氧, 并且参与光灭活。有研
究表明, 1个 33 kD的植物锰稳定蛋白 MSP-Ⅱ就是
这 3 个外周多肽之一, 合成受阻就会使植物不能正
常光合自养[29]。高等植物 MSPs 高度保守, 表 1 展
示龙葵叶片 MSP-Ⅱ在 Cd 毒害下丰度下降, 其光合
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作用也会因此受到妨碍。
叶片的光合作用基于 1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/
加氧酶(RuBisco)的生物作用。RuBisco催化 1,5-二磷
酸核酮糖与 CO2的羧化反应或与 O2的氧化反应[30]。
高等植物碳同化有 3个主要限制因素: CO2的供给、
1,5-二磷酸核酮糖(RuBP)的合成速率和 RuBisco[31]。
Cd胁迫下龙葵叶片 RuBisco大亚基含量大幅度下降
(表 1), 可见 Cd毒害影响龙葵光合作用中的 C同化,
这可能也是导致贮藏蛋白 8S球蛋白 α亚基含量降低
的原因之一。
龙葵叶片MALDI-TOF MS分析, Cd胁迫条件下
有两个 8S球蛋白 α亚基(gi|108743972, gi|108743974)
表达量下降。绿豆贮藏蛋白以 8S球蛋白为主, 占总
球蛋白的 89%, 除此之外还有少量 11S 球蛋白和碱
性 7S球蛋白[32]。8S球蛋白 α亚基在 Cd胁迫条件下
丰度降低, 在一定程度上反映了龙葵自身能量的偏
移, 降解自身贮藏蛋白中的能量。
3 讨论与结论
本试验采用蛋白质双向电泳和 MALDI-TOF
MS 的试验手段, 对比龙葵叶片和根部蛋白组对 Cd
毒害的不同响应。结果表明, Cd胁迫下,龙葵根部表
达上调的蛋白有: 1 个防御响应相关蛋白 SAM合酶
2、2个能量代谢相关蛋白硫酸腺苷酰转移酶和 2-磷
酸甘油酸脱水酶。说明 Cd胁迫下龙葵根部乙烯的合
成和硫的同化增加, 糖酵解途径加剧。糖酵解途径
加剧说明龙葵根系内物质和能量代谢加剧, 异化作
用提升, 能量增加以缓解 Cd 对植物细胞的胁迫程度;
乙烯作为一种公认的抗逆激素, 龙葵通过提高内源
乙烯的含量来提高自身抗逆能力。14-3-3 蛋白参与
众多通路的磷酸化作用 [26], Cd 处理下龙葵根部
14-3-3蛋白下调, Cd具体影响了 14-3-3蛋白参与的
哪条或哪几条通路有待于更深层次的研究。
Cd胁迫下龙葵叶片黄嘌呤脱氢酶(XDH)、植物
锰稳定蛋白 MSP-Ⅱ、1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧
酶(RuBisco)大亚基和 2个 8S球蛋白 α亚基都呈下降
趋势。Xu 等[5]发现 Cd 毒害导致龙葵光合作用率下
降, 本研究也发现 Cd 毒害已经严重威胁到生物的正
常同化作用, 影响植物的光合作用, 通过影响 MSP-Ⅱ,
阻碍了 PSⅡ正常光反应, 通过影响 RuBisco, 阻碍
了 C 的固定, 最终导致光合速率下降, 贮藏蛋白 8S
球蛋白 α亚基含量下降。
植物修复技术(phytoextraction)日渐兴起, 通过
植物对土壤中重金属的吸收、运输和贮藏, 将土壤
中重金属累积到植物茎叶中[33]。可修复重金属污染
程度较轻的土壤, 具有经济成本低、可持续、技术
简单、就地修复、前景广阔的优势, 但是基于植物
吸收的方式往往局限于成效较慢 , 植物生长缓慢 ,
生物量小等缺点[34]。龙葵被发现为新兴的 Cd 重金
属超富集植物 , 其生物量大 , 耐受性好 , 且不被食
草动物取食(不污染食物链), 被视为良好的 Cd、Zn、
Ni 的植物修复材料[8], 这项研究为采用龙葵作为植
物修复技术理想材料奠定了基础。
本文采用蛋白质双向电泳和 MALDI-TOF MS
的试验手段, 鉴定了重金属超富集植物龙葵根中和
叶片Cd胁迫下差异表达的蛋白, 这些蛋白涉及到激
素合成、防御响应、能量代谢和细胞结构等。Cd毒
害下龙葵叶片蛋白丰度增高的未知蛋白尚有待于进
一步研究, 揭示其生理作用和分子机制。目前, 超富
集植物对重金属响应机理的研究集中在转录组学或
生理学方面 , 本文着眼于蛋白组学层面入手研究 ,
这些结果为进一步揭示重金属超富集植物龙葵响应
Cd胁迫的分子调节机制提供了理论依据与验数据。
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