全 文 ：中国生态农业学报 2015年 10月 第 23卷 第 10期
Chinese Journal of Eco-Agriculture, Oct. 2015, 23(10): 13021311


* 安徽省自然科学基金项目(1408085MD75)和安徽省高校自然科学重点项目(KJ2013A113)资助
** 通讯作者: 朱林, 主要研究方向为土壤生态与环境。E-mail: zhulin@ahau.edu.cn
王伏伟, 主要研究方向为土壤微生物。E-mail: wangfuwei2014@126.com
收稿日期: 20150306 接受日期: 20150805
http://www.ecoagri.ac.cn
DOI: 10.13930/j.cnki.cjea.150267
施肥及秸秆还田对砂姜黑土细菌群落的影响*
王伏伟1 王晓波1 李金才2 叶爱华3 王 妍1 车 威1 朱 林1**
(1. 安徽农业大学资源与环境学院 合肥 230036; 2. 安徽农业大学农学院 合肥 230036;
3. 安徽农业大学生命科学学院 合肥 230036)
摘 要 利用 Illumina 平台 Miseq 高通量测序技术对小麦分蘖期砂姜黑土耕层土壤细菌进行高通量测序, 结
合相关生物信息学分析, 探讨了不施化肥秸秆不还田(CK)、施化肥秸秆不还田(F)以及不施化肥秸秆还田(W)3
种处理土壤细菌群落组成、多样性和结构的变化。结果显示, 测序共获得 14 873个 OTUs, 计 173 323条读数,
平均读长 439 bp。砂姜黑土细菌优势门(相对丰度>10%)为变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、
放线菌门(Actinobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes); 优势纲(相对丰度>10%)为 α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、
β-变形菌纲 (Betaproteobacteria)、酸杆菌纲 (Acidobacteria)、鞘脂杆菌纲 (Sphingobacteriia)和 γ-变形菌纲
(Gammaproteobacteria); 优势属(相对丰度>1%)共 47个, 3个处理中均有分布的优势属 21个, F处理的细菌优势
属的种类最多, 为 39个。相对丰度最大的门、纲和属分别是变形菌门(38.7%~43.1%)、α-变形菌纲(14.5%~18.1%)
和鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas) (4.6%~7.7%)。F处理细菌丰富度指数(Chao1指数和 ACE指数)显著低于 CK
及W处理, W处理和 CK处理土壤细菌丰富度指数无显著差异, 与 CK处理相比, F处理 ACE指数降低 22.8%。
W处理土壤细菌 Shannon多样性指数显著大于 CK及 F处理, W处理 Shannon指数较 CK处理提高 4.1%, 而 F
处理土壤细菌 Shannon指数与CK处理无显著差异。F处理 Simpson指数显著高于CK及W处理; F处理 Simpson
指数较 CK处理提高 38.1%, 而 W处理细菌 Simpson指数最小, 显著低于 CK处理, 较 CK降低 23.8%。分层
聚类图显示在属的水平上, W处理和 CK处理土壤细菌群落结构相似性较高, F处理与 CK处理及 W处理细菌
群落结构差异较大。施化肥对土壤细菌优势类群组成、相对丰度及群落结构的影响大于秸秆还田, 施化肥显
著降低了土壤细菌丰富度, 秸秆还田显著提高了土壤细菌的多样性。
关键词 施化肥 秸秆还田 高通量测序 砂姜黑土 细菌群落
中图分类号: S154.3 文献标识码: A 文章编号: 1671-3990(2015)10-1302-10
Effects of fertilization and straw incorporation on bacterial communities
in lime concretion black soil
WANG Fuwei1, WANG Xiaobo1, LI Jincai2, YE Aihua3, WANG Yan1, CHE Wei1, ZHU Lin1
(1. School of Resources and Environment, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China; 2. College of Agriculture, Anhui
Agricultural University, Hefei 230036, China; 3. School of Biology Sciences, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China)
Abstract Soil bacteria are important drivers of nearly all biogeochemical cycles in terrestrial ecosystems and participate in
most nutrient transformation processes in the soil. Thus knowledge about the shift of microbial community structure and
diversity following different agricultural management practices could improve our understanding of soil processes and help us
to develop agricultural management strategies. Because most soil bacteria are nonculturable, and traditional molecular biology
methods, such as DGGE, are partial, the researches on soil bacterial are limited. High-throughput sequencing technology
provides an effective tool for microbial molecular biology research. In this study, the technology of high-throughput
sequencing on Illumina MiSeq platform was adopted to investigate the effects of fertilization and straw residue incorporation
第 10期 王伏伟等: 施肥及秸秆还田对砂姜黑土细菌群落的影响 1303


http://www.ecoagri.ac.cn
on bacterial communities in lime concretion black soils. The 16S rRNA genes of topsoil bacteria in lime concretion black soil
were sequenced by high-throughput sequencing on Illumina MiSeq platform and related biological analysis conducted to
investigate the changes in soil bacterial composition, diversity and structure under 4 different fertilization practices at wheat
tillering stage. Soil samples were collected in lime concretion black soils in Mengcheng, Anhui Province, China with 3
treatments (CK: no fertilization, no straw return; F: chemical fertilization without straw return; W: straw return without
chemical fertilization). The results showed that 173 323 reads of 14 873 OTUs (operational taxonomic unit) were generated at
3% cutoff level under all treatments with an average length of 439 bp. Bacterial OTUs were classified into 19 different known
phyla and 41 classes. Proteobacteria, Acidobacteria, Actinobacteria and Bacteroidetes were the dominant phyla (with relative
abundance > 10%) in lime concretion black soils. Then Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria, Sphingobacteriia,
Acidobacteria and Gammaproteobacteria were the dominant classes (with relative abundance > 10%). The total number of
dominant genera (with relative abundance > 1%) in all 3 treatments was 47, of which 21 genera were found in all treatments,
and the largest number (39) of dominant genera occurred under F treatment. The dominant phylum, class and genus with the
highest relative abundances were Proteobacteria (38.7%ԟ43.1%), Alphaproteobacteria (14.5%ԟ18.1%) and Sphingomonas
(4.6%ԟ7.7%) in all 3 treatments. The richness indexes (Chao1 and ACE indexes) were significantly lower for F treatment than
for CK and W treatments. ACE index decreased by 22.8% under F treatment compared with CK. The richness indexes (Chao1
and ACE indexes) of CK and W treatments were not significantly different from each other. The Shannon index of W treatment
was significantly higher than that of CK and F treatments, it increased by 4.1% compared with CK. Then the Shannon indexes
of CK and F treatments were also not significantly different from each other. The Simpson index of F treatment was
significantly higher than that of CK and W treatments. The Simpson index of F treatment increased by 38.1% compared with
CK treatment. The Simpson index of W treatment was lowest among 3 treatments, decreasing by 23.8% compared with CK
treatment. Hierarchical cluster analysis showed that CK and W treatments were in the same cluster group, while F was in a
different cluster group. All the above findings suggested that chemical fertilization had a stronger effect on the composition,
relative abundance of the dominant bacterial group and bacterial structure in soils than incorporation of straw residue. While
chemical fertilization decreased soil bacterial richness, it increased bacterial predominance. On the contrary, straw residue
incorporation increased soil bacterial diversity, but decreased bacterial predominance.
Keywords Chemical fertilization; Straw residue incorporation; High-throughput sequencing; Lime concretion black soil;
Bacterial community
(Received Mar. 6, 2015; accepted Aug. 5, 2015)
土壤微生物不仅是土壤的重要组成部分, 更是
土壤养分循环的主要推动者, 土壤微生物群落的变
化在一定程度上可以反映土壤质量的变化趋势[1]。
细菌是土壤中数量最丰富、分布最广泛的微生物类
群, 几乎参与了陆地生态系统所有的生物化学循环,
对于维持农田生态系统健康和土壤生产力具有重要
作用[2]。然而由于大多数土壤细菌是不可培养的, 以
及DGGE等传统分子生物学方法的局限性 , 限制了
土壤细菌的研究[3]。近年来, 高通量测序技术为微生
物分子生态学研究提供了强有力的工具, 在环境及
土壤微生物等领域得到了广泛应用[4]。Chen等[5]应用
基于Illumina平台的Miseq高通量测序技术, 比较了
不同铁矿区土壤细菌群落结构, 研究结果加深了人
们关于重金属污染对土壤细菌群落结构及多样性的
影响机制的理解。田地等[6]利用基于Illumina平台的
Miseq高通量测序技术, 研究了封存CO2泄漏情景下
农田土壤细菌群落丰富度多样性和群落结构的变化,
研究结果表明 , 受封存CO2泄漏影响 , 玉米田土壤
细菌群落结构丰富度和多样性均发生了变化, 土壤
酸杆菌门 (Acidobacteria)细菌相对增多可能作为地
质封存CO2泄漏对土壤生态系统影响的生物监测指
标。高通量测序操作简单、结果稳定, 可重复性强,
测序结果一致性高达99.99%, 为土壤细菌的深入研
究提供了可能[78]。
砂姜黑土是黄淮海平原重要的土壤之一, 在安
徽省北部分布广泛, 面积约164.7万多公顷[9]。农作
物生产过程中所产生的秸秆是重要的有机肥源之一,
同时秸秆还田作为全球有机农业的重要环节, 对维
持农田肥力, 减少化肥使用, 提高陆地土壤碳汇能
力具有积极作用[10]。近年来, 秸秆还田被广泛应用
于农业生产实践, 在培肥砂姜黑土和增加作物产量
方面取得了很好的效果[1112]。施肥是影响土壤质量
及其可持续利用最深刻的农业措施之一, 施肥制度
不同, 土壤微生物种群、数量和活性不同, 导致土壤
生物肥力不同, 而这种差异又会对土壤结构、肥力
和生产力产生深刻影响[13]。
施用化肥及有机肥会对农田土壤微生物群落结
构及多样性产生一定的影响。王轶等[14]的研究表明,
1304 中国生态农业学报 2015 第 23卷


http://www.ecoagri.ac.cn
施用有机肥可以更好地提高土壤真菌的多样性; 罗
培宇[15]对棕壤的研究表明长期施肥显著改变了土壤
微生物群落结构及活性, 施肥显著增加了棕壤细菌
及真菌多样性; Sapp等[16]的温室模拟试验表明施肥
对土壤细菌群落产生了一定的影响。因此揭示施肥
后农田土壤细菌群落结构、优势种群及多样性的变
化, 对于维持农田土壤生物肥力及农田生态环境具
有重要意义[17]。目前, 施肥及秸秆还田对砂姜黑土
旱地农田生态系统微生物类群的影响尚少见报道。
因此 , 本文主要采用田间定位试验的方法 , 应用
Illumina平台的Miseq高通量测序土壤细菌16s rDNA,
研究了不同施肥制度对砂姜黑土旱地农田生态系统
细菌组成、结构及多样性的影响, 可以加深对土壤
微生物类群和群落结构变化的认识, 为提高砂姜黑
土的土壤生物肥力提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验地概况和试验材料
试验始于2008年, 在安徽省蒙城县现代农业示
范园内进行。该区属于典型的暖温带半温润气候区,
平均海拔为40 m, 全县年平均气温14.7 , ℃ 平均
光照2 320 h, 年平均无霜期216 d, 平均年降水量
822 mm。土壤类型为砂姜黑土, 0~20 cm土层土壤养
分含量为: 有机质12.46 g·kg1, 全氮136.60 mg·kg1,
碱解氮80.20 mg·kg1。
供试玉米品种为 ‘郑单958’, 供试小麦品种为
‘烟农19’。
1.2 试验设计
试验区土地利用方式为玉米、小麦一年两熟制。
小区面积49.5 m2。试验始于2008年, 为长期定位试
验。试验共设3个处理 , 即不施化肥秸秆不还田
(CK)、施化肥秸秆不还田(F)以及不施化肥秸秆还田
(W), 每个处理3次田间重复。小麦播种行距为20 cm,
播种量为135 kg·hm2, 密度为270万株·hm2。W处理
小区小麦秸秆全量粉碎覆盖还田, 小麦秸秆还田量
约为7 500 kg·hm2。F处理小区在小麦全生育期施纯
N 240 kg·hm2, 基肥追肥比为5.5 4.5∶ ; 结合整地,
基施600 kg·hm2复合肥和42 kg·hm2纯N, 另45%的
氮肥于拔节期追施; 氮肥为尿素, 复合肥N︰P2O5︰
K2O含量为15︰15︰15。玉米等行距播种 , 行距
60 cm, 播种量为37.5 kg·hm2, 密度为6.75万株·hm2。
全生育期施纯N 300 kg·hm2, 播种时基施复合肥
450 kg·hm2, 小喇叭口期配合降雨施纯N 112.5 kg·hm2,
大喇叭口期配合降雨施纯N 120 kg·hm2。采集2013
年小麦分蘖期耕层土壤(0~30 cm), 每个处理小区多
点取样充分混匀, 每份土样分为两份, 一份100 g左
右放入灭菌袋中带回实验室放入80 ℃保存供下一
步分子生物学研究, 剩下约800 g用来分析土壤基本
理化性质(表1), 土壤基本理化性质参照鲍士旦的方
法分析[18]。
表 1 不同处理土壤的基本性质
Table 1 Soil chemical properties of the different treatments
处理 Treatment
代码
Code
描述
Description
pH
有机质
Organic matter
(g·kg1)
全氮
Total N
(g·kg1)
速效磷
Available P
(mg·kg1)
速效钾
Available K
(mg·kg1)
CK
小麦秸秆不还田, 不施化肥
No wheat straw incorporation, no chemical
fertilization
6.69±0.01a 15.08±0.16b 0.99±0.01b 8.01±1.15b 117.72±5.59b
F
小麦秸秆不还田, 施化肥
Chemical fertilization without wheat straw
incorporation
5.37±0.01c 16.95±0.20a 1.12±0.03a 27.09±1.61a 144.63±7.52a
W
小麦秸秆还田, 不施化肥
Wheat straw incorporation without chemical
fertilization
6.21±0.02b 16.23±0.82ab 1.04±0.01b 15.90±4.65b 137.82±5.91ab
同列不同小写字母表示处理间在 0.05水平差异显著, 下同。Different small letters in the same column indicate significant difference among
treatments at 0.05 level. The same below.

1.3 土壤微生物总 DNA的提取及细菌的高通量测序
采用MOBIO公司的强力土壤 DNA提取试剂盒
(PowerSoil® DNA Isolation Kit), 按其操作手册提取
土壤微生物基因组 DNA。所提取的土壤总 DNA 的
浓度和纯度用核酸定量仪 (NanoDrop ND-1000)检
测。各样品纯化后 DNA送至上海美吉生物公司应用
Illumina平台的 MiSeq进行测序。
高通量测序主要步骤如下 : 按指定测序区域 ,
合成带有bar code的特异引物。PCR采用TransGen
AP221-02: TransStart Fastpfu DNA Polymerase; PCR
仪: ABI GeneAmp®9700型。全部样品按照正式实验
条件进行, 每个样品3个重复, 将同一样品的PCR产
物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测, 使用AxyPrep
DNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)切胶回收PCR
产物, Tris-HCl洗脱; 2%琼脂糖电泳检测。PCR的扩
增采用引物对338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-
第 10期 王伏伟等: 施肥及秸秆还田对砂姜黑土细菌群落的影响 1305


http://www.ecoagri.ac.cn
3′) 和 806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′),
此引物扩增土壤细菌16S rDNA的V3~V4区[19]。20 μL
PCR反应体系如下 : 4 μL 5×FastPfu Buffer, 2 μL
2.5 mmol·L1 dNTPs, 0.4 μL Forward Primer (5 μmol·L1),
0.4 μL Reverse Primer (5μmol·L1), 2 μL Template
(10 ng DNA), 0.4 μL FastPfu Polymerase (TransStart
Fastpfu DNA Polymerase, TransGen, China)和10.8 μL
ddH2O。PCR扩增程序如下: 95 ℃预变性2 min; 95 ℃
变性30 s, 55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 共30个循环;
最后72 ℃终延伸10 min结束。根据电泳初步定量结
果, 将PCR产物用QuantiFluor™-ST蓝色荧光定量系
统(Promega公司)进行定量检测, 之后按照每个样品
的测序量要求, 进行相应比例的混合。
1.4 高通量测序数据分析
试验采用双端(pair-end)测序。首先对原始数据
进行质量控制, 用软件Flash连接通过质量控制的序
列, 舍弃无法连接的序列。根据试验要求, 过滤read
尾部质量值20 bp以下的碱基, 设置50 bp的窗口, 如
果窗口内的平均质量值低于20 bp, 从窗口开始截去
后端碱基 , 过滤质控后50 bp以下的 read; 根据PE
reads之间的overlap关系, 将成对reads拼接(merge)成
一条序列 , 最小overlap长度为10 bp; 拼接序列的
overlap区允许的最大错配比率为0.2, 筛选不符合序
列 ; 检测序列末端box序列 , 最小错配数为0, 将起
始端包含box的序列进行反向互补, 并去除box; 检
测序列上的barcode并区分样品, barcode错配数为0,
最大引物错配数为2, 获得最终用于分析的序列[20]。
应用 Qiime (quantitative insights into microbial
ecology), 根据序列的相似度, 将序列归为多个OTU
(operational taxonomic unit)。OTU产出后, 统计各个
样品含有OTU情况及每个OTU中含有序列的数目。
使用 uparse (version 7.1 http://drive5.com/uparse/)方
法进行 OTU聚类, OTU中序列相似性设为 97%, 得
到 OTU的代表序列[21]; 使用 uchime (version 4.2.40
http://drive5.com/usearch/manual/uchime_algo.html)
检测 PCR 扩增中产生的嵌合体序列并从 OTU 中去
除[22]; 使用 usearch_global方法将优化序列map比对
回 OTU 代表序列, 得到 OTU 各样品序列丰度统计
表。为了得到每个 OTU对应的物种分类信息, 采用
RDP classifier贝叶斯算法对 97%相似水平的OTU代
表序列进行分类学分析 , 并在各个水平 (phylum,
class, genus)统计每个样品的群落组成, 我们规定优
势种群在门和纲水平上相对丰度大于 10%, 在属的
水平上相对丰度大于 1%。比对数据库如下: Silva
(Release115 http://www.arb-silva.de)[23]; 选取相似度
在 97%条件下的 OTU生成预期的稀释曲线, 并利用
软件 mothur 计算丰富度指数 Chao1 和 ACE 以及多
样性指数。
2 结果与分析
2.1 土壤样品测序结果、取样深度验证
通过对细菌16s rDNA的V3~V4区进行测序, 将
样品中原始序列过滤掉低质量的序列后, 有效序列
的总数为201 382, 共获得173 323条读数(reads), 并
在97%相似度下将其聚类为用于物种分类的OTU,
统计得到各个样品在不同OTU中的丰度信息, 9个样
品共产生14 873个OTUs。由表2可知, W处理土壤含
有最多数量的OTUs, 其次是CK处理, F处理OTUs数
量最少。与CK相比, F处理土壤OUTs数量减少13.6%,
W处理增加13.2%。
表 2 不同处理土壤细菌序列读数(reads)及 OTUs数
Table 2 Reads and OTUs numbers of soil bacteria sequences
in the different treatments
处理
Treatment
序列读数
Reads
OTUs数
OTUs
CK 15 989±5 379a 1 655±182ab
F 21 739±6 225a 1 430±90b
W 20 047±4 298a 1 873±41a

稀释曲线(rarefaction curve)反映了样品的取样
深度 , 可以用来评价测序量是否足以覆盖所有类
群。图1为本试验所有样品在相似度0.97条件下的稀
释曲线。由图1可知, 所有土壤样品稀释曲线均趋于
平缓, 说明取样合理, 真实环境中细菌群落结构的
置信度较高, 能够比较真实地反映土壤样本的细菌
群落, 但仍有少量细菌种类未被发现。CK-1和F-2测
序量相对其他土壤样品较少, 可能是由土壤总DNA

图 1 相似度为 0.97条件下各土壤样本的稀释曲线
Fig. 1 Rarefaction curves of OTUs clustered at 97% sequence
identity across different soil samples
1306 中国生态农业学报 2015 第 23卷


http://www.ecoagri.ac.cn
提取过程中的操作误差引起 , 因其测序量均达到
10 000 条以上, 可以满足分析要求。
2.2 土壤细菌群落丰富度和多样性分析
细菌群落丰富度用Chao1指数和ACE指数表示,
其值越高表明群落物种的丰富度越高, 其计算方法
参见文献[2425]; Shannon指数反映样品的多样性
程度 , 其值越高表明群落物种的多样性越高 ;
Simpson指数反映了物种的优势度 , 计算方法参见
张等 [24,26]。由表3可以看出, F处理土壤丰富度指数
(Chao1指数和ACE指数)显著低于CK及W处理, W处
理和CK处理细菌丰富度指数无显著差异, 与CK处理
相比, F处理ACE指数降低22.8%。表明施肥显著降低
了土壤细菌物种丰富度, 而秸秆还田对土壤细菌种
群丰富度影响不大。F处理土壤细菌Shannon指数与
CK处理无显著差异, 而W处理土壤细菌Shannon指数
显著高于CK及F处理, 为6.62, 且W处理Shannon指数
较CK处理提高4.1%。表明秸秆还田显著提高了土壤
细菌的多样性, 而施肥对土壤细菌多样性影响不大。
F处理Simpson指数显著高于CK及W处理 , F处理
Simpson指数较CK处理提高38.1%, 而W处理细菌
Simpson指数最小, 显著低于CK处理, 比CK处理降
低23.8%。上述结果表明施肥显著降低土壤细菌种群
丰富度, 增加了土壤细菌优势度; 而秸秆还田提高
了土壤细菌的多样性, 降低了土壤细菌的优势度。
表 3 不同处理土壤细菌丰富度及多样性指数
Table 3 Richness and diversity indexes of soil bacteria in the different treatments
处理
Treatment
ACE指数
ACE index
Chao1指数
Chao1 index
Shannon指数
Shannon diversity index
Simpson指数
Simpson diversity index
CK 2 030±72a 2 011±67a 6.36±0.12b 0.004 2±0.000 8b
F 1 568±106b 1 584±97b 6.22±0.04b 0.005 8±0.000 1a
W 2 120±63a 2 131±52a 6.62±0.02a 0.003 2±0.000 1c

2.3 土壤细菌类群分析
在门的分类水平上 , 砂姜黑土细菌分布在 19
个已知细菌门 , 除未被分类 (unclassified)群体外 ,
还有 13 个候选细菌门。如图 2 所示 , 变形菌门
(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌
门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿弯
菌门(Chloroflexi)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、
疣微菌门 (Verrucomicrobia)、蓝藻门(Cyanobacteria)、
厚壁菌门 (Firmicutes)、硝化螺菌门 (Nitrospirae)和
TM7共 11个细菌门相对丰度较大, 其相对丰度之和
在 3 个处理土壤样品中均占到土壤细菌总量的 93%
以上。栖热菌门(Deinococcus-Thermus)、螺旋菌门
(Spirochaetae)和柔膜菌门(Tenericutes)3 个门在不同
施肥处理样品中组成有所差异, 但其相对丰度极小
(相对丰度在 0~0.08%), 其余 16 个已知细菌门在 3
个处理中均有分布。

图 2 不同处理土壤在门分类水平上的细菌类群比较
Fig. 2 Comparison of bacteria groups at phylum level in the different treatment soils
第 10期 王伏伟等: 施肥及秸秆还田对砂姜黑土细菌群落的影响 1307


http://www.ecoagri.ac.cn
CK 和 W 处理中的优势细菌门均为变形菌门、
酸杆菌门、放线菌门和拟杆菌门。秸秆还田增加了
放线菌门及拟杆菌门的相对丰度, 分别增加 17.4%
和 39.1%; 降低了变形菌门及酸杆菌门的相对丰度,
分别降低了 4.0%和 25.5%。施肥(F)处理土壤细菌优
势门的组成和相对丰度与 CK和W处理均存在差异,
F 处理的优势细菌门为变形菌门、放线菌门和拟杆
菌门。与 CK相比, 施肥增加了变形菌门、放线菌门
和拟杆菌门的相对丰度, 分别增加 7.7%、34.7%和
44.3%; 酸杆菌门相对丰度降低 48.3%。
在纲的分类水平上, 共得到 41个已知的细菌纲,
除未被分类的细菌纲外, 还有 40个候选细菌纲。如
图 3所示, α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、β-变形
菌纲(Betaproteobacteria)、酸杆菌纲(Acidobacteria)、
鞘脂杆菌纲(Sphingobacteriia)、放线菌纲(Actinobacteria)、
芽 单 胞 菌 纲 (Gemmatimonadetes)、 δ-变 形 菌 纲
(Deltaproteobacteria)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、
嗜 热 油 菌 纲 (Thermoleophilia) 、 厌 氧 绳 菌 纲
(Anaerolineae)、黄杆菌纲(Flavobacteria)和 TM7类群
等在细菌纲中相对丰度较大, 相对丰度之和在 3 个
处理土壤样品中均占到土壤细菌总量的 80%以上。
除极少数相对丰度极低的细菌纲 , 如异常球菌纲
(Deinococci)、Ignavibacteria纲、柔膜菌纲(Mollicutes)
和 Negativicutes 纲在 3 个施肥处理中的分布有所差
异, 其余已知细菌纲在 3个施肥处理中均有分布。
3 个处理土壤细菌优势纲的组成和相对丰度均
存在差异(图 3), CK 处理的优势细菌纲为 α-变形菌
纲、β-变形菌纲和酸杆菌纲, F处理的优势细菌纲为
α-变形菌纲、鞘脂杆菌纲、放线菌纲和 γ-变形菌纲, W
处理的优势细菌纲为 α-变形菌纲、β-变形菌纲和鞘脂
杆菌纲。与 CK相比, 施肥增加了 α-变形菌纲、放线
菌纲及鞘脂杆菌纲的相对丰度, 分别增加 19.2%、
46.4%和 45.3%; 降低了 β-变形菌纲的相对丰度, 降
低了 36.1%。秸秆还田增加了鞘脂杆菌纲相对丰度,
增加了 36.0%, 降低了 α-变形菌纲、β-变形菌纲和酸
杆菌纲的相对丰度, 分别降低 5.8%、18.8%和 28.1%。

图 3 不同处理土壤在纲分类水平上的细菌类群比较
Fig. 3 Comparison of bacteria groups at class level in the different treatment soils
通过 Venn 图(图 4)分析了 3 个施肥处理土壤细
菌共有的优势属(相对丰度>1%)的数量及特有的优
势属, 3个处理优势属共有 47个, 3个处理中均有分
布的优势种属有 21个; F处理中优势属的种类最多,
为 39个; CK处理中优势属的种类最少, 为 28个。施
肥和秸秆还田均显著提高了土壤优势属数量, 其中
施肥处理土壤优势种群最多。3 个处理土壤样品共
有的相对丰度较高的优势属有鞘氨醇单胞菌属
(Sphingomonas)(11.3%~14.4%)、芽单胞菌属(Gemmatimonas)
(2.0%~7.7%)和 Massilia属(4.4%~4.9%)等。CK独有
的优势属为玫瑰弯菌属(Roseiflexus)和 Reyranella属,
W 处理独有的优势属为游动放线菌属(Actinoplanes)
和 Niastella 属, F 处理土壤样品细菌特有的细菌属
数量最多, 为 12个。
用在属的水平相对丰度排名前 50 的细菌属来
构建分层聚类图(hierarchical heatmap)(图 5), 分层聚
类图可以用颜色变化直观地将数据值的大小以定义
的颜色深浅表示出来, 通过颜色的梯度及相似程度
来反映数据的相似性和差异性。由图 5可以看出, 9
个土壤样品明显地分成两大类, CK和W处理的 6个
土壤样品细菌群落结构较接近, 聚为一支, F 处理 3
个土壤样品细菌聚为另一支。由此可以得出, 施肥
1308 中国生态农业学报 2015 第 23卷


http://www.ecoagri.ac.cn

图 4 不同处理土壤优势细菌属维恩图
Fig. 4 Venn diagram of dominant genera among the different
treatment soils
在属的水平上对土壤细菌群落结构的影响大于秸秆
还田。分层聚类图中红色部分是相对丰度最高的属,
可以清晰的看到鞘氨醇单胞菌属在 3 个处理土壤中
相对丰度均是最大。
3 讨论和结论
本研究利用Illumina平台Miseq高通量测序技术
对土壤细菌16s rDNA V3~V4区进行扩增测序, 各样
本的覆盖率指数(good’s coverage)显示在相似度为
0.97的条件下, OTUs涵盖了土壤中99%以上的细菌;
同 时 , 测 序 还 发 现 了 许 多 未 被 分 类 的 细 菌
(unclassified bacteria), 说明高通量测序可以得到较
为全面的生物学信息, 一些未被认识和分类的细菌
也能通过测序有所体现。但3个处理间土壤未被分类
的细菌在各个分类学水平上相对丰度差异并不大。

图5 不同处理土壤属水平上细菌分层聚类图
Fig. 5 Hierarchical clustering diagram of bacteria at genus level in the different treatment soils
第 10期 王伏伟等: 施肥及秸秆还田对砂姜黑土细菌群落的影响 1309


http://www.ecoagri.ac.cn
土壤微生物多样性相对比较稳定, 短期施肥对
土壤微生物的影响不显著 [27], 但长期合理施肥可
以对土壤微生物群落结构和多样性产生一定的影
响 [28]。Liu等[7,29]的研究表明土壤理化性质, 尤其是
土壤pH和土壤有机质对土壤细菌群落组成和多样性
有显著的影响。本文中, 秸秆还田显著提高了土壤
细菌多样性, 这可能是因为秸秆还田分解过程中不
仅增加了土壤的有机质含量, 且秸秆腐解过程中产
生的一些产物, 如糖类、蛋内质、氨基酸、维生素
以及有机酸、酚类等[15], 给微生物提供了丰富的营
养; 同时秸秆还田可以改善土壤结构, 增加土壤透
气性, 从而增加了微生物种类, 导致土壤细菌多样
性的增加。施用化肥显著降低了土壤细菌的丰富度,
且导致土壤pH显著下降、土壤板结, 不利于好氧细
菌的生长。
土壤优势细菌类群相对丰度与土壤理化性质有
一定的相关性[30]。本研究中酸杆菌门的相对丰度与
土壤全氮及速效钾含量呈显著负相关; 拟杆菌门的
相对丰度与土壤全氮、速效钾及速效磷呈显著正相
关; 芽单胞菌门的相对丰度与土壤pH呈极显著正相
关, 与有机质、全氮和速磷呈极显著负相关; α-变形
菌纲的相对丰度与pH呈显著正相关, β-变形菌纲的
相对丰度与pH呈极显著正相关, 与有机质、全氮和
速效磷含量呈显著负相关; γ-变形菌纲的相对丰度
与pH呈极显著负相关, 与有机质、全氮和速效磷含
量呈极显著正相关; 硝化螺菌属(Nitrospira)的相对
丰度与pH呈极显著正相关, 与有机质、全氮及速效
磷呈显著负相关[31]。
砂姜黑土中细菌类群丰富, 优势细菌门为变形
菌门、酸杆菌门、放线菌门和拟杆菌门, 其中变形
菌门相对丰度最大 , 为38.5%~43.2%; 优势细菌纲
为α-变形菌纲、β-变形菌纲、酸杆菌纲、γ-变形菌纲
和鞘脂杆菌纲, 其中α-变形菌纲相对丰度最大。研究
结果与Liu等[7]对东北地区黑土中细菌的研究及Sapp
等[16]结果一致。施用化肥及秸秆还田改变了土壤理
化性质, 因此对土壤中细菌优势类群相对丰度产生
了一定的影响。砂姜黑土中的变形菌门相对丰度在3
个处理之间差异较小 , 作为细菌中最大的一个门 ,
有研究报道其中许多类群可以进行固氮作用, 并且
能够适应各种复杂的环境 [7,15], 因此环境条件的变
化对其分布和相对丰度影响不大。酸杆菌门广泛分
布在土壤及沉积物中, 为嗜酸菌。但在本文中, 施肥
处理土壤pH最小, 酸杆菌门相对丰度也最小, 这印
证了Liu等[7]的研究结果, 表明土壤中酸杆菌门的生
长不仅受到土壤pH的影响, 还可能受到土壤有机质
及作物生长状况等其他因素影响。放线菌门能够促
进土壤中动植物残体的腐烂, 在秸秆还田后秸秆的
腐解过程中起到重要作用, 同时在自然界氮素循环
中也有一定的作用[32]。而施肥处理、秸秆还田处理
均大幅提高了土壤中放线菌门的相对丰度, 这可能
与施肥及秸秆还田处理中全氮含量较高有一定的
关系。施肥及秸秆还田对一些与元素转化相关的功
能菌也产生了一定的影响。如 : 鞘氨醇单胞菌
(Sphingomonas)是一种新型的生物资源 , 主要参与
芳香化合物的分解[15], 与CK相比, 秸秆还田大幅降
低了鞘氨醇单胞菌的相对丰度; 施肥及秸秆还田对
与生物固氮相关的细菌属相对丰度也产生了一定的
影响, 施肥及秸秆还田均大幅低了硝化螺菌属和慢
生根瘤菌属(Bradyrhizobium)的相对丰度, 均大幅提
高了根瘤菌属(Rhizobium)相对丰度; 施肥显著降低
了与磷代谢相关的芽单胞菌属(Gemmatimonas)相对
丰度。
施肥对土壤细菌优势类群组成、相对丰度及群
落结构的影响大于秸秆还田, 施肥显著降低了土壤
细菌丰富度, 秸秆还田显著提高了土壤细菌的多样
性。施肥及秸秆还田对砂姜黑土细菌群落结构的影
响机制还需进一步深入研究。
参考文献
[1] 张薇, 魏海雷, 高洪文, 等. 土壤微生物多样性及其环境影
响因子研究进展[J]. 生态学杂志, 2005, 24(1): 48–52
Zhang W, Wei H L, Gao H W, et al. Advances of studies on
soil microbial diversity and environmental impact factors[J].
Chinese Journal of Ecology, 2005, 24(1): 48–52
[2] 韩亚飞, 伊文慧, 王文波, 等. 基于高通量测序技术的连作
杨树人工林土壤细菌多样性研究[J]. 山东大学学报: 理学
版, 2014, 49(5): 1–6
Han Y F, Yi W H, Wang W B, et al. Soil bacteria diversity in
continuous cropping poplar plantation by high throughput
sequencing[J]. Journal of Shandong University: Natural
Science, 2014, 49(5): 1–6
[3] 曹万举, 隋心, 韩士杰, 等. 分子生物学技术在土壤微生物
多样性中的应用[J]. 生物过程, 2013, 3: 23–28
Cao W J, Sui X, Han S J, et al. Molecular biology technology
and its application in soil microbial diversity[J]. Bioprocess,
2013, 3: 23–28
[4] Bartram A K, Lynch M D J, Stearns J C, et al. Generation of
multimillion-sequence 16S rRNA gene libraries from complex
microbial communities by assembling paired-end Illumina
reads[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2011,
1310 中国生态农业学报 2015 第 23卷


http://www.ecoagri.ac.cn
77(11): 3846–3852
[5] Chen H, Si Y X, Yi X, et al. Illumina MiSeq sequencing
investigation on the contrasting soil bacterial community
structures in different iron mining areas[J]. Environ-
mental Science and Pollution Research, 2015, 22(14):
10788–10799
[6] 田地, 马欣, 李玉娥, 等. 利用高通量测序对封存 CO2泄漏
情景下土壤细菌的研究 [J]. 环境科学 , 2013, 34(10):
4096–4104
Tian D, Ma X, Li Y E, et al. Research on soil bacteria under
the impact of sealed CO2 leakage by high-throughput
sequencing technology[J]. Environmental Science, 2013,
34(10): 4096–4104
[7] Liu J J, Sui Y Y, Yu Z H, et al. High throughput sequencing
analysis of biogeographical distribution of bacterial
communities in the black soils of northeast China[J]. Soil
Biology and Biochemistry, 2014, 70: 113–122
[8] Zhang Y G, Cong J, Lu H, et al. An integrated study to
analyze soil microbial community structure and metabolic
potential in two forest types[J]. PLoS One, 2014, 9(4):
e93773
[9] 王道中, 郭熙盛, 何传龙, 等. 砂姜黑土长期定位施肥对小
麦生长及土壤养分含量的影响[J]. 土壤通报, 2007, 38(1):
55–57
Wang D Z, Guo X S, He C L, et al. Effect of long-term
fertilization on wheat growth and soil nutrition status in
Shajiang black soil[J]. Chinese Journal of Soil Science, 2007,
38(1): 55–57
[10] 潘剑玲, 代万安, 尚占环, 等. 秸秆还田对土壤有机质和氮
素有效性影响及机制研究进展 [J]. 中国生态农业学报 ,
2013, 21(5): 526–535
Pan J L, Dai W A, Shang Z H, et al. Review of research
progress on the influence and mechanism of field straw
residue incorporation on soil organic matter and nitrogen
availability[J]. Chinese Journal of Eco-Agriculture, 2013,
21(5): 526–535
[11] Zhang B, Pang C Q, Qin J T, et al. Rice straw incorporation in
winter with fertilizer-N application improves soil fertility
and reduces global warming potential from a double rice
paddy field[J]. Biology and Fertility of Soils, 2013, 49(8):
1039–1052
[12] Zhu L Q, Hu N J, Yang M F, et al. Effects of different tillage
and straw return on soil organic carbon in a rice-wheat
rotation system[J]. PLoS One, 2014, 9(2): e88900
[13] 魏巍, 许艳丽, 朱琳, 等. 长期施肥对黑土农田土壤微生物
群落的影响[J]. 土壤学报, 2013, 50(2): 372–380
Wei W, Xu Y L, Zhu L, et al. Effect of long-term fertilization
on soil microbial communities in farmland of black soil[J].
Acta Pedologica Sinica, 2013, 50(2): 372–380
[14] 王轶, 李季, 曹志平, 等. 长期施肥对农田土壤真菌的影响[J].
中国生态农业学报, 2014, 22(11): 1267–1273
Wang Y, Li J, Cao Z P, et al. Effects of long-term fertilization
on soil fungi[J]. Chinese Journal of Eco-Agriculture, 2014,
22(11): 1267–1273
[15] 罗培宇. 轮作条件下长期施肥对棕壤微生物群落的影响[D].
沈阳: 沈阳农业大学, 2014
Luo P Y. Effect of long-term fertilization on microbial
community in a brown soil under crop-rotation system[D].
Shenyang: Shenyang Agricultural University, 2014
[16] Sapp M, Harrison M, Hany U, et al. Comparing the effect of
digestate and chemical fertiliser on soil bacteria[J]. Applied
Soil Ecology, 2015, 86: 1–9
[17] Wu T H, Chellemi D O, Graham J H, et al. Comparison of soil
bacterial communities under diverse agricultural land
management and crop production practices[J]. Microbial
Ecology, 2008, 55(2): 293–310
[18] 鲍士旦. 土壤农化分析[M]. 第 3 版. 北京: 中国农业出版
社, 2000: 25–114
Bao S D. Soil and Agricultural Chemistry Analysis[M]. 3rd ed.
Beijing: China Agriculture Press, 2000: 25–114
[19] Huse S M, Huber J A, Morrison H G, et al. Accuracy and
quality of massively parallel DNA pyrosequencing[J].
Genome Biology, 2007, 8(7): R143
[20] Zhang Y, Wang X, Hu M, et al. Effect of hydraulic retention
time (HRT) on the biodegradation of trichloroethylene
wastewater and anaerobic bacterial community in the UASB
reactor[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2015,
99(4): 1977–1987
[21] Edgar R C, Haas B J, Clemente J C, et al. UCHIME improves
sensitivity and speed of chimera detection[J]. Bioinformatics,
2011, 27(16): 2194–2200
[22] Edgar R C. UPARSE: highly accurate OTU sequences from
microbial amplicon reads[J]. Nature Methods, 2013, 10(10):
996–998
[23] Quast C, Pruesse E, Yilmaz P, et al. The SILVA ribosomal
RNA gene database project: Improved data processing and
web-based tools[J]. Nucleic Acids Research, 2012, 41(1):
590–596
[24] Chao A N. Non-parametric estimation of the number of
classes in a population[J]. Scandinavian Journal of Statistics,
1984, 11(4): 265–270
[25] 赵彤. 宁南山区植被恢复工程对土壤原位矿化中微生物种
类和多样性的影响[D]. 杨陵: 西北农林科技大学, 2014
Zhao T. Effects of vegetations restoration project on microbial
species and diversity of in-situ nitrogen mineralization
process in the hilly area of southern Ningxia[D]. Yangling:
Northwest Agriculture and Forestry University, 2014
[26] 张薇, 胡跃高, 黄国和, 等. 西北黄土高原柠条种植区土壤
微生物多样性分析[J]. 微生物学报, 2007, 47(5): 751–756
Zhang W, Hu Y G, Huang G H, et al. Soil microbial
diversity of artificial peashrub plantation on North Loess
Plateau of China[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2007,
47(5): 751–756
[27] 樊晓刚, 金轲, 李兆君, 等. 不同施肥和耕作制度下土壤微
生物多样性研究进展[J]. 植物营养与肥料学报, 2010, 16(3):
744–751
第 10期 王伏伟等: 施肥及秸秆还田对砂姜黑土细菌群落的影响 1311


http://www.ecoagri.ac.cn
Fan X G, Jin K, Li Z J, et al. Soil microbial diversity under
different fertilization and tillage practices: A review[J]. Plant
Nutrition and Fertilizer Science, 2010, 16(3): 744–751
[28] 时鹏, 高强, 王淑平, 等. 玉米连作及其施肥对土壤微生物
群落功能多样性的影响 [J]. 生态学报 , 2010, 30(22):
6173–6182
Shi P, Gao Q, Wang S P, et al. Effects of continuous cropping
of corn and fertilization on soil microbial community
functional diversity[J]. Acta Ecologica Sinica, 2010, 30(22):
6173–6182
[29] Rousk J, Bååth E, Brookes P C, et al. Soil bacterial and fungal
communities across a pH gradient in an arable soil[J].
International Society for Microbial Ecology, 2010, 4(10):
1340–1351
[30] 李聪. 不同林型对林下土壤理化性质与土壤细菌多样性的
影响[D]. 哈尔滨: 东北林业大学, 2013
Li C. Soil physical and chemical properties and soil bacterial
diversity in various forest type of urban forest[D]. Harbin:
Northeast Forestry University, 2013
[31] 王伏伟 . 施肥及秸秆还田对砂姜黑土细菌群落的影响[D].
合肥: 安徽农业大学, 2015
Wang F W. The effects of fertilization and straw residue
incorporation on bacterial communities in lime concretion
black soil[D]. Hefei: Anhui Agricultural University, 2015
[32] Lauber C L, Strickland M S, Bradford M A, et al. The
influence of soil properties on the structure of bacterial and
fungal communities across land-use types[J]. Soil Biology
and Biochemistry, 2008, 40(9): 2407–2415