全 文 ：的大量增殖, 都可能导致胶原总量的增加。因此博莱
霉素致肺纤维化病理过程分两个阶段: 早期为肺泡
炎, 晚期为肺纤维化。肺泡炎阶段, 博莱霉素刺激大
量炎性细胞产生氧自由基、细胞因子和酶参与了肺
损伤, 随后氧自由基刺激成纤维细胞分泌胶原蛋白
形成肺纤维化[7 ]。H yp 是机体胶原蛋白的主要成分
之一, 约占其氨基酸总量的 13% , 其他除弹性蛋白
含有少量 H yp (约1% ) 外, 均不含 H yp。因此组织
中 H yp 水平可作为其胶原组织代谢的重要指标[8 ]。
本实验应用博莱霉素复制小鼠肺纤维化模型,
观察发现模型组第7 天肺泡炎明显, 第14、28 天形成
纤维化, 且第 14、28 天 H yp 水平显著高于对照组
(P < 0105、0101) , 主要病变与指标都与文献报道一
致[9 ] , 说明动物模型复制成功。
在肺纤维化的治疗上, 目前公认疗效确切的糖
皮质激素, 早期应用效果好, 中晚期则疗效不佳, 且
长期应用有不良反应, 严重影响机体免疫功能, 增加
继发感染和呼吸衰竭的可能性。临床资料显示仅少
于 30% 的患者激素治疗有效[10 ]。现代实验研究及
临床应用均表明, 丹参在抗肺纤维化中作用确切、效
果显著[11 ] , 其防治肺纤维化的作用机制与氧自由基
清除有关[12 ]。作为丹参的有效成分丹参总酚酸, 同
样具有很强的抗氧化活性[1 ] , 是否也具有抗肺纤维
化的作用尚不清楚。本研究用丹参总酚酸治疗小鼠
肺纤维化, 观察发现与模型组相比肺指数明显降低;
病理形态学上早期肺泡炎减轻, 晚期纤维化程度减
轻; 肺组织 H yp 水平显著低于模型组。表明丹参总
酚酸对博莱霉素所致小鼠肺纤维化的发生发展有一
定的抑制作用, 其作用机制可能与其抗氧化活性及
抑制成纤维细胞分泌胶原蛋白有关。提示丹参总酚
酸对小鼠肺泡炎及肺纤维化有一定的抑制作用, 为
丹参总酚酸预防和治疗肺纤维化提供了实验依据。
参考文献:
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3101
羟基红花黄色素A 促内皮细胞增殖的机制研究
张　岭1, 宋　艳2, 李长龄2, 朱美才3, 王　卉4, 刘　珂5, 朱海波1Ξ
(11 中国医学科学院 中国协和医科大学药物研究所, 北京　100050; 21 北京大学药学院 分子与细胞药理系,
北京　100083; 31 中国人民解放军空军总医院 分子生物学中心, 北京　100036; 41 军事医学科学院
微生物流行病研究所, 北京　100071; 51 烟台大学药学院, 山东 烟台　264003)
摘　要: 目的　探讨羟基红花黄色素A (H SYA ) 对低氧条件下犬血管内皮细胞 (V EC ) 血管内皮生长因子
(V EGF) 相关信号传导通路的影响。方法　在低氧条件下以 EL ISA 法观察V EGF 抗体及其两种酪氨酸受体 (F lt2
1 和 KDR ) 的抗体对 H SYA 促 V EC 增殖作用及分泌 V EGF 水平的影响; 生物分子相互作用分析法检测 H SYA
与V EGF、F lt21 和 KDR 的相互作用; 硝酸还原酶法测定 V EC 培养液中NO、NO S 的量。结果　10 ΛgömL V EGF、
·304·中草药　Ch inese Traditiona l and Herbal D rugs　第 39 卷第 3 期 2008 年 3 月
Ξ 收稿日期: 2007206210
基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (30370720) ; 国家“863”计划 (2004AA 2Z3815)3 通讯作者　朱海波　T el: (010) 63188106　Fax: (010) 63017757　E2m ail: zhuhaibo@ imm. ac. cn
F lt21 和 KDR 的抗体均能明显抑制 H SYA 的促 V EC 分泌 V EGF 作用; 生物分子相互作用分析结果证实, H SYA
与 V EGF、F lt21 及 KDR 均无明显结合; H SYA 在 1 mmo löL 浓度下能够明显促进低氧条件下 V EC 培养液中的
NO 水平, 而对 NO S 水平没有明显影响。结论　在低氧条件下, H SYA 促 V EC 增殖的作用与 V EGF 及其相关信
号传导通路有关, 但 H SYA 与 V EGF 及其受体无明显结合, 提示可能存在与 V EGF 及其相关信号传导通路相关
的 H SYA 作用靶点。
关键词: 羟基红花黄色素 A (H SYA ) ; 血管新生; 血管内皮生长因子 (V EGF)
中图分类号: R 28515　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 0253- 2670 (2008) 03- 0403- 06
M echan ism of hydroxysaff lor yellow A induced endothel ia l cell prol ifera tion
ZHAN G L ing1, SON G Yan2, L IU Chang2ling2, ZHU M ei2cai3, W AN G H u i4, L IU Ke5, ZHU H ai2bo 1
(11 Inst itu te of M ateria M edica, Ch inese A cadem y of M edical Sciences, Beijing 100050, Ch ina; 2. D epartm ent of M o lecu lar
and Cellu lar Pharm aco logy, Schoo l of Pharm aceu tical Sciences, Pek ing U niversity, Beijing 100083, Ch ina;
3. M o lecu lar B io logy Center, General Ho sp ita l of A ir Fo rce, PLA , Beijing 100036, Ch ina; 4. Inst itu te
of M icrob io logy Ep idem io logy, A cadem y of M ilitary M edical Sciences, Beijing 100071, Ch ina;
5. Schoo l of Pharm aceu tical Sciences, Yan tai U niversity, Yan tai 264003, Ch ina)
Abstract: Objective　To study the effect of hydroxysaff lo r yellow A (H SYA ) on vascu lar endo thelia l
grow th facto r (V EGF) pathw ay in hypox ic can ine ao rt ic endo thelia l cell (V EC). M ethods　U sing severa l
an t ibodies, the invo lvem en t of V EGF, fam 2like tyro sine recep to r (F lt21) and k inase in sert dom aincon ta i2
n ing recep to r (KDR ) in H SYA 2induced V EC grow th w as determ ined by M T T assay and EL ISA fo r V EGF
secret ion under hypox ic condit ion. Fu rthermo re, the in teract ion s of H SYA w ith V EGF, F lt21 o r KDR
w ere studied by B iomo lecu lar In teract ion A nalysis (B IA ). T he n it ric ox ide (NO ) concen tra t ion and en2
do thelia l n it ric ox ide syn thetase (eNO S) act ivity w ere determ ined by n it ra te reductase assay. Results　A n2
t ibodies of F lt21, KDR o r V EGF sign if ican t ly b locked the p ro lifera t ive effect of H SYA. A lso , an t ibodies
of F lt21 and V EGF attenuated the p romo tion of H SYA on V EGF secret ion. B IA R esu lts revealed that
H SYA had no in teract ion s w ith V EGF, F lt21, and KDR. T he trea tm en t of H SYA 1 mmo löL in hypox ic
cu ltu re resu lted in elevated NO level and in tact NO S level in the endo thelia l cell cu ltu re m edia. Conclusion
　T he p ro lifera t ive effect of H SYA on V EC is p robab ly m edia ted by V EGF pathw ay. How ever, there is no
direct in teract ion betw een H SYA and V EGF o r V EGF recep to rs, w h ich indica tes o ther H SYA targets in
V EGF pathw ay.
Key words: hydroxysaff lo r yellow A (H SYA ) ; angiogenesis; vascu lar endo thelia l grow th facto r
(V EGF)
　　红花、当归、桃红及灯盏花等中药均有促进组织
内新血管生成作用[1, 2 ]。由于我国传统中药具有历史
悠久, 疗效确切, 成本低廉等优势, 使从中药中寻找
具有市场前景的血管生成促进剂的几率大大增加,
以传统的活血化瘀类中药为切入点, 寻找天然血管
生成促进剂, 将为动脉缺血性疾病的治疗提供了广
阔的前景。
羟基红花黄色素A (hydroxysaff lo r yellow A ,
H SYA ) 是从传统的活血化瘀类名药红花中分离出
来的, 具有抗心脑缺血性损伤作用的有效单体成分。
前期实验证实[5 ]: H SYA 可使局灶性脑缺血大鼠脑
组织内新生血管数目明显增加, 血管内皮生长因子
(V EGF) 表达显著增强, 提示 H SYA 有较强的促新
血管生成作用, 其机制可能与激活V EGF 及其受体
信号传导途径从而促进血管内皮细胞 (V EC) 增殖
作用相关。本实验室最新研究表明, H SYA 在低氧
条件下明显促进培养的犬 V EC 增殖[3 ] , 但该作用
的机制尚不清楚。鉴于机体血管形成的过程多依赖
于内皮细胞的有丝分裂, 而V EGF 是目前已知的最
强的特异性内皮细胞分裂原,V EGF 的活性主要受
控于与其相互作用的 KDR (k inase in sert dom ain2
con ta in ing recep to r) 和 F lt21 (fam 2like tyro sine re2
cep to r) 两个酪氨酸激酶受体。它们的激活引起内皮
细胞的分裂、增殖和迁移, 诱导血管新生[4 ]。H SYA
的促新血管生成作用与V EGF 的表达呈正相关[5 ] ,
故本研究以 H SYA 对促 V EC 增殖相关的 V EGF
及其受体信号传导通路的影响为切入点, 初步探讨
H SYA 促 V EC 增殖作用与 V EGF 信号传导途径
的关系。
1　材料
111　药品与试剂: H SYA (质量分数 9917% ) 由山
东省天然药物工程技术研究中心提供, 批号
·404· 中草药　Ch inese Traditiona l and Herbal D rugs　第 39 卷第 3 期 2008 年 3 月
20000525; 胰蛋白酶 (1∶250) , Sigm a 产品; 优级胎
牛血清 (FBS) , 杭州四季青公司产品, 批号 031208;
rhV EGF (阳性对照药) , PEPRO 2T ECH 公司产品,
批号 030210; rhF lt21、rhKDR、V EGF 抗体、F lt21
抗体、KDR 抗体和 V EGF EL ISA 试剂盒, 均为美
国 R &D 公司产品; CM 5 蛋白结合芯片, 瑞典 B ia2
co re AB 公司, 批号 1122369; 第Ð 因子鉴定试剂,
K irkegaard & Perry 实验室提供; M T T , Am resco
产品, 批号 0793; NO 与一氧化氮合酶 (NO S) 试剂
盒, 南京建成生物工程研究所产品。
112　动物: 健康雄性杂种犬, 15～ 20 kg, 由北京方
元缘实验动物养殖场提供。
113　仪器: CO 2培养箱及三气培养箱, 美国 Fo rm a
公司; SPECTRA M A X 190 型酶标仪, M o lecu lar
D evices 公司; B IA co re 3000 生物分子相互作用分
析仪, 瑞典Am ersham B io science 公司。
2　方法
211　不同质量浓度的 V EGF 抗体或 V EGF 受体
的抗体对 V EC 增殖的影响: 采用M T T 比色法检
测在低氧低糖条件下孵育 48 h 后, 不同质量浓度抗
体对犬胸主动脉V EC 增殖的影响。参照文献方法
培养犬胸主动脉 V EC [6, 7 ] , 取第 3～ 5 代细胞消化
后, 用DM EM 培养液制备单细胞悬液 1×105ömL ,
接种于 96 孔板内, 每孔接种 100 ΛL , 置于 37 ℃、
5% CO 2培养箱中静置培养。24 h 后更换为含不同
质量浓度抗体的 DM EM 培养液 (包括空白对照
组; F lt21 抗体 10、1、011、0101、01001、010001 Λgö
mL 组; KDR 抗体 10、1、011、0101、01001、010001ΛgömL 组; V EGF 抗体 10、1、011、0101、01001、
010001 ΛgömL 组) , 每组 8 个复孔, 置于 37 ℃、5%
CO 2、10% O 2的三气培养箱中继续培养 48 h 后, 以
M T T 比色法检测细胞增殖。
212　10 ΛgömL V EGF 抗体及其两种酪氨酸受体
F lt21 和 KDR 的抗体对 H SYA 促 V EC 增殖及分
泌 V EGF 的影响: 参考 211 项实验结果, 选择 10ΛgömL 作为观察抗体抑制 H SYA 促 V EC 增殖的
试验质量浓度。前期工作证实, 1 mmo löL H SYA 具
有明确的促内皮细胞增殖作用[5 ]。取第 3～ 5 代培养
犬胸主动脉 V EC 消化, 细胞接种培养方法同 211。
24 h 后更换为含不同药物的DM EM 培养液 (包括
空白对照组; H SYA 1 mmo löL 组; H SYA 1 mmo lö
L + F lt21 抗体 10 ΛgömL 组; H SYA 1 mmo löL +
KDR 抗体 10 ΛgömL 组; H SYA 1 mmo löL + V EGF
抗体 10 ΛgömL 组) , 每组8 个复孔, 置于 37 ℃、5%
CO 2、10% O 2的三气培养箱中继续培养 48 h 后, 以
M T T 比色法检测细胞增殖, 同时采用 EL ISA 法测
定V EC 上清液中V EGF 浓度。
213　H SYA 与 V EGF、F lt21 及 KDR 之间的相互
作用: 生物分子相互作用分析法[8 ] (B iomo lecu lar In2
teract ion A nalysis, B IA ) 系统由微射流卡盘、传感
器芯片和 SPR 光学检测系统3 个核心部分组成, 其
工作原理是基于表面等离子共振传感 ( Su rface
P lasmon R esonance, SPR ) 技术来实时追踪生物分
子间的相互作用。实验时先将一种生物分子固定在
传感器芯片表面, 再通过微射流卡盘将待分析互相
作用的分子溶液传送至传感器芯片表面, SPR 光学
检测系统则跟踪检测溶液与芯片表面的分子结合和
解离的全过程, 数据分析软件 B IA evaluat ion 处理
实验过程中获取的各种特异性信号, 并将其整合成
最终的实验结果。本实验将 V EGF、F lt21、KDR 和
对照蛋白BSA 耦合在传感器芯片上, 通过流动相将
H SYA 样品传至芯片表面, 检测其与耦联蛋白是否
具有相互作用, 以及对蛋白结合活性的影响。
以氨基耦联方式将 rhV EGR 1 (F lt21)、rhV E2
GR 2 (KDR )、rhV EGF (20～ 50 ΛgömL ) 和对照蛋
白BSA (30 ΛgömL ) 耦联于 CM 5 芯片 4 个通道表
面。再 以 50 ΛgömL 的 rhV EGR 1、rhV EGR 2、
rhV EGF 和 H is2HR P IgG 进行芯片表面的结合活
性验证, 以确认耦联蛋白的活性。检测 H SYA 结合
作用, 将 10 ΛL 的 3 m gömL 和 10 m gömL 的
H SYA 以体积流量 5 ΛL öm in 液流方式注入 FC l24,
与芯片上的蛋白反应。在样品的检测过程中, 芯片以
20 mmo löL N aOH 10 ΛL 再生。每10 次样品注射后
需再次验证芯片表面结合活性, 以保持检测的稳
定性。
数据处理: 信号图Y 是共振单位 RU , 以样品注
射后 60 s 时 RU 值减去注射样品前 5 s 记录的 RU
值, 获得实际结合量。
214　低氧条件下 V EC 上清中NO、NO S 水平的影
响: 取第3～ 5 代培养犬胸主动脉V EC 消化后, 细胞
接种方法同 211, 置于 37 ℃、5% CO 2培养箱中静置
培养。 24 h 后更换为含不同药物的 10% FBS
DM EM 培养液 (包括空白对照组, V EGF 0126Λmo löL 组, H SYA 1、011、0101 mmo löL 组) , 每组6
个复孔, 置于 37 ℃、5% CO 2、10% O 2培养箱中静置
培养 48 h 后, 取上清液, 用硝酸还原酶法测定 NO
和NO S 水平。
215　统计学处理: 实验结果以 x ±s 表示, 采用方差
·504·中草药　Ch inese Traditiona l and Herbal D rugs　第 39 卷第 3 期 2008 年 3 月
分析方法 (ANOVA ) 进行组间比较。
3　结果
311　V EGF 抗体、F lt21 和 KDR 的抗体对 H SYA
促V EC 增殖及分泌V EGF 的影响: 由表1 可见, 与
对照组比较, H SYA 1 mmo löL 可明显促进V EC 增
殖 (P < 0101) 及V EGF 分泌 (P < 0105)。10 Λgö
mL 的 V EGF、F lt21、KDR 的 抗 体 均 能 抑 制
1 mmo löL H SYA 的促V EC 增殖作用 (P < 0101)。
10 ΛgömL F lt21 和 KDR 的 抗 体 均 能 抑 制
1 mmo löL H SYA 的促V EC 分泌V EGF 作用, 其中
F lt21 抗体作用显著 (P < 0105)。说明 H SYA 的促
V EC 增殖作用可能与V EGF 或V EGF 受体有关。
表 1　VEGF、Flt-1、KD R 抗体对 HSYA 促 VEC 增殖
及 VEGF 分泌的影响 (x±s)
Table 1　Effect of an tibody of VEGF, Flt-1, and KD R
on HSYA promotion of VEC prol iferation
and VEGF secretion (x±s)
组　别
给药浓度
HSYA ö(mmo l·L - 1)　 抗体ö(Λg·mL - 1) A 值ö(n= 8) V EGFö(pg·mL - 1, n= 5)
对照 - - 01946±01034 1 861±122
HSYA 1 - 11135±010593 3 2 088± 493
HSYA + Flt21 抗体 1 10 01948±01079# # 1 806±104#
HSYA + KDR2抗体 1 10 01899±01082# # 1 928±152
HSYA + V EGF2抗体 1 10 01948±01089# # 　 75± 133 3 # #
　　与对照组比较: 3 P < 0105　3 3 P < 0101
　　与H SYA 组比较: # P < 0105　# # P < 0101
　　3 P < 0105　3 3 P < 0101 vs con tro l group
　　# P < 0105　# # P < 0101 vs H SYA group
312　H SYA 与 V EGF、F lt21 及 KDR 之间的相互
作用: 配体蛋白的耦联: 蛋白目标耦联量为 10 000
RU , 4 种蛋白实际氨基耦联量分别为 rhV EGFR 1:
14 265RU ; rhV EGFR 2: 12 656RU ; rhV EGF:
8 721RU ; BSA : 14 321RU , B IA COR E 以共振单位
(RU ) 来衡量, 1 000 RU 相当于每平方毫米 1 ng
的质量[8 ]。进一步观察V EGF、F lt21 和 KDR 与芯
片各通道的结合能力, 结果见表 2, V EGF 与 F lt21
和 KDR 均发生了明显的结合, RU 值分别为 43110
和 42413; F lt21 结合试验发现, 其与白蛋白结合最
高, 说明该受体蛋白存在非特异性结合, 与其他3 个
通道的结合结果表明, 相对的 V EGF 结合量最大,
说明其除与V EGF 有特异性结合外, 另外其与 F lt2
1 和 KDR 也有一定的结合, 将其稀释 30 倍后重复
试验, 排除蛋白浓度过大造成的影响, 得到类似结
果; KDR 结合试验结果证实, 其与V EGF 存在特异
性结合, 与 F lt21 和 KDR 结合量很低, 说明 KDR
对V EGF 有很高的选择性。
H SYA 与蛋白相互作用实验中, 3、10 m gömL
H SYA 与V EGF、F lt21 和 KDR 的结合量与白蛋白
相类似。由于 F lt21 和 KDR 为基因重组产品, 在序
列中含有多聚组氨酸, 其可以与 H is2HR P IgG 发生
特异性结合, 针对这一点, 将经过 H SYA 处理过的
芯片与 H is2HR P IgG 作用, 以考察 H SYA 是否通
过改变某些蛋白的理化特性而发挥作用, 结果证实
H is2HR P IgG 仍和V EGF 受体发生特异性结合, 表
明未见 H SYA 与 V EGF、F lt21 及 KDR 发生直接
或间接的相互作用。
313　低氧条件下 H SYA 对V EC 上清中NO、NO S
水平的影响: 由表3 结果可见, 低氧条件下加药孵育
48 h 时, V EGF 0126 Λmo löL 组细胞培养液中的
NO 水平比对照组显著增高 (P < 0101) ; H SYA 仅
1 mmo löL 剂量组的 NO 水平比对照组显著增高
(P < 0101) , 但仍远远低于 V EGF 216×10- 4mmo lö
L 组; 而 H SYA 011、0101 mmo löL 组的NO 水平与
对照组比较无明显差异 (P > 0105)。各组细胞培养
液中的NO S 水平无明显差异, 这可能由于V EC 培
养液中的NO S 水平较低的缘故。
表 2　HSYA 与 VEGF、Flt-1 和 KD R 的分子间
相互作用 (单位: RU)
Table 2　In teraction between HSYA and VEGF,
Flt-1, KD R (Un it: RU)
流动相
固定相
白蛋白 V EGF F lt21 KDR
V EGF 4816 5114 47414 48116
F lt21 3 65217 3 52618 2 56911 1 66614
F lt21 (1∶30) 53612 73919 77715 28016
KDR 9813 2 17016 38110 - 12718
H SYA (3 m g·mL - 1) - 4418 - 13819 8513 - 3716
H SYA (10 m g·mL - 1) 1316 - 1410 - 3719 - 218
H is2HR P IgG (1∶50) 612 6218 35719 29510
表 3　低氧条件下 HSYA 对 VEC 培养液中 NO
和 NOS 水平的影响 (x±s, n= 6)
Table 3　Effect of HSYA on NO and NOS levels in VEC
culture media under hypox ia (x±s, n= 6)
组别 浓度ö(mmo l·L - 1) NO ö(Λmo l·L - 1) NO Sö(U ·mL - 1)
对照 - 47146± 3128 3184±0121
V EGF 216×10- 4 240165±101633 3 3158±0131
H SYA 1 70112± 51823 3159±0154
011 50175± 4146 3160±0117
0101 49144± 4106 3152±0132
　　与对照组比较: 3 P < 0105　3 3 P < 0101
　　3 P < 0105　3 3 P < 0101 vs con tro l group
4　讨论
　　本实验室最新研究表明, H SYA 可在低氧条件
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下直接作用于培养的 V EC 并显著促进其增殖, 但
对于其作用机制尚不清楚。前期体内研究结果曾提
示, H SYA 在抗脑缺血的治疗浓度下可使V EGF 的
表达明显高于缺血对照组, 且V EGF 强阳性的缺血
组织新生血管数目 (M VD ) 明显高于 V EGF 阴性
或弱阳性的缺血组织, 提示V EGF 促新生血管形成
与其使缺血组织中V EGF 受体表达上调有关[5 ]。
大量研究证实, V EGF 促进 V EC 增殖是其促
血管新生作用的基础和关键。其生物作用是通过与
V EC 表面的特异性受体酪氨酸激酶—V EGF 受体
结合所实现的。这是本实验进一步探讨在低氧条件
下 H SYA 促 V EC 增殖作用与 V EGF 信号传导途
径之间关系的重要原因。据文献报道[9 ] , 在缺血性疾
病中, 低氧可刺激V EGF mRNA 表达上调, 促进
V EC 释放 V EGF 导致新生血管形成最终改善组织
血供。因此在体外低氧状态下, 研究 H SYA 促进
V EC 增殖过程中V EGF 信号传导通路的作用, 将
有助于阐明 H SYA 在体内缺血情况下促新生血管
生长的分子基础。本实验结果发现, H SYA 在促进
体外培养的V EC 增殖的浓度下, 可显著增加V EC
的 V EGF 释放量, 这与前期研究体内免疫组化结
果: H SYA 促进V EGF 蛋白水平的表达相一致; 而
在本实验中, V EGF 抗体在 10 ΛgömL 质量浓度
下即能明显拮抗 H SYA 促V EC 增殖作用, 同时伴
有 V EGF 的分泌量显著下降, 且二者呈正相关。
此结果更有力地证明了 H SYA 促进 V EGF 在
V EC 中的释放是其促 V EC 增殖作用的重要机制
之一。
本实验结果还发现, 两个发挥主要功能的
V EGF 受体——F lt21 和 KDR 的抗体均能明显抑
制 1 mmo löL H SYA 的促 V EC 增殖作用, 且作用
强度基本相当, 表明V EGF 及其受体可能是 H SYA
的促 V EC 增殖作用信号传导通路中的重要环节,
但三者所起的作用有所不同。V EGF、F lt21 和 KDR
三者的抗体在 10 ΛgömL 质量浓度下均能明显抑制
H SYA 所致的 V EC 增殖作用, 同时 V EGF 和
F lt21 受体的抗体能够显著抑制 H SYA 促 V EC 分
泌 V EGF 的作用, 以 V EGF 抗体作用最强, F lt21
受体抗体作用次之。分析此现象可能是前者由V EC
中分泌的 V EGF 被其抗体中和后形成复合物很难
被检出, 故其促V EC 增殖作用亦被明显消弱; 而后
者由于V EGF 作用受体被其抗体封闭, 使得V EGF
促 V EC 增殖作用无法得到充分发挥从而使细胞数
量减少, 最终导致V EGF 分泌量下降。但对于 KDR
抗体组在与前两者拮抗 H SYA 促 V EC 增殖作用
强度相当的情况下, 与单纯 H SYA 组相比其细胞释
放V EGF 量无显著差异, 是否可能与其检测标准差
偏大有关, 尚有待于今后进一步探讨。值得肯定的
是, H SYA 的促 V EC 增殖作用与V EGF 及其受体
的信号传导密切相关。
那么, H SYA 是否是通过与 V EGF、F lt21 或
KDR 的直接结合而发挥其促V EC 增殖作用的呢?
为此本研究采用了 B IA 方法进一步检测了 H YSA
与V EGF、F lt21 和 KDR 的相互作用。在实验中, 针
对 H SYA 相对分子质量较小 (约611) 这一点, 首先
将芯片的蛋白耦联量增大 (10 000 RU ) , 以扩大可
能的结合位点, 如果能够结合, 其信号即能够检出;
另外, H SYA 的样品注射质量浓度最大设定为 10
m gömL , 在此质量浓度下, 加之很大的蛋白耦联量,
若未能检出结合信号则可认为二者之间不存在相互
作用。实验结果首先说明, 氨基耦联方法可有效地使
V EGF、F lt21 和 KDR 与芯片相连, 其后的验证实验
还说明该耦联方法结合后蛋白仍保持良好的生物学
功能, 证明了芯片的有效性。从验证实验中还可看
出, F lt21 存在非特异性结合的特点, 而 KDR 与配
体的结合存在很高的选择性, 此与文献报道的相吻
合[10 ]。采用 3、10 m gömL H SYA 与芯片相作用, 从
结果中可以看出 H SYA 与 V EGF、F lt21 和 KDR
没有特异性和非特异性结合。经H SYA 作用后的芯
片与 H is2HR P IgG 相作用, 发现 H is2HR P IgG 仍
能有效的与 F lt21 和 KDR 相结合, 这也说明
H SYA 对V EGF 受体蛋白的理化性质也没有影响,
即不会影响受体与其特异性配体的亲和力。故本实
验从多方面证实, H SYA 没有与 V EGF、F lt21 及
KDR 发生直接或间接的相互作用。由于 H SYA 在
促进 V EC 增殖的同时增加 V EC 促 V EGF 分泌,
该作用可被V EGF 和其受体 F lt21 和 KDR 的抗体
所减弱, 而 H SYA 又不与 V EGF 或其受体相互作
用, 故而推测 H SYA 可能是通过激活 V EGF 信号
传导通路的上游靶分子而起效的。
本研究首次发现, H SYA 促犬胸主动脉 V EC
增殖作用与 V EGF 信号传导通路介导有关, 推
测该作用可能是 H SYA 促新血管生成的作用机制
之一。
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苦瓜蛋白抗肿瘤作用及其分子机制
熊术道1, 尹丽慧1, 李景荣2, 叶爱芳1, 章圣辉1, 温博贵3Ξ
(11 温州医学院附属第一医院医学科学研究所, 浙江 温州　325000; 21 温州医学院附属第一医院 急诊科,
浙江 温州　325000; 31 汕头大学医学院 分子生物学研究室, 广东 汕头　510031)
摘　要: 目的　探讨苦瓜蛋白对荷瘤小鼠肿瘤生长的影响和荷瘤小鼠血清基质金属蛋白酶 MM P22、MM P29 的活
性及变化以及细胞因子白细胞介素26 ( IL 26) 及肿瘤坏死因子2Α (TN F2Α) 表达的影响。方法　将清洁级 ICR 雄性
小鼠按体重随机分成5 组, 建立肝癌 H 22皮下移植瘤模型, 分为模型组、苦瓜蛋白高、中、低剂量 (100、50、25 m gökg)
组及环磷酰胺组 (CTX, 40 m gökg) , 各组均 ip 给药, 观察苦瓜蛋白对肿瘤生长的影响; 分离血清, 明胶酶谱法检测
荷瘤小鼠血清基质金属蛋白酶MM P22、MM P29 的活性及其变化, EL ISA 检测细胞因子 IL 26 及 TN F2Α表达。结果
　苦瓜蛋白组与模型组相比, 肿瘤质量明显减轻 (P < 0101) , 小鼠体重也较模型组小鼠轻 (P < 0101) ; 苦瓜蛋白
(100、50、25 m gökg) 组及 CTX 组抑瘤率分别为 85181%、66189%、52105%、65110% ; 各苦瓜蛋白组与模型组相
比,MM P22、MM P29 的活性降低, 酶原表达下调 (P < 0101) ; 细胞因子 IL 26 及 TN F2Α表达明显下调 (P < 0101) ,
上述作用与苦瓜蛋白剂量相关。结论　苦瓜蛋白具有较强的体内抗肿瘤活性; 其抗肿瘤作用可能与苦瓜蛋白抑制
MM P s 的活性及表达, 以及调节 IL 26 及 TN F2Α等细胞因子的表达水平有关。
关键词: 苦瓜蛋白; 移植性肿瘤; 基质金属蛋白酶
中图分类号: R 286191　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 0253- 2670 (2008) 03- 0408- 04
　　苦瓜蛋白 (momo r charin glycop ro tein s) 是从
苦瓜籽中分出的一种相对分子质量约为 30 000 的
碱性糖蛋白质, 属于 I型核糖体失活蛋白 ( ribo som e
inh ib it ing p ro tein, R IP)。R IP 具有明显的抗肿瘤、
抗病毒作用, 具有极高的药用价值[1, 2 ]。前期研究表
明苦瓜蛋白可以明显诱导 K562 细胞产生细胞凋
亡[3 ]。为进一步研究苦瓜蛋白对动物移植性肿瘤的
作用及分子机制, 笔者研究了不同剂量苦瓜蛋白对
移植性肝癌 H 22荷瘤小鼠的抗肿瘤作用及其对荷瘤
小鼠基质金属蛋白酶 (m atrix m eta llop ro tease,
MM P s) MM P22、MM P29 的活性与变化以及细胞 因子白细胞介素26 ( IL 26) 及肿瘤坏死因子2Α(TN F2Α) 表达的影响。1　材料111　仪器及试剂: Im age m aster 凝胶成像系统( GE health )、EL x800 酶 标 仪、IL 26 及 TN F2ΑEL ISA 试剂盒购自B io sou rce 公司。112　实验动物与细胞株: 清洁级 ICR 雄性小鼠, 体重 18～ 22 g, 温州医学院实验动物中心提供。 ICR小鼠 H 22腹水瘤细胞由浙江中医药大学生命科学系惠赠。2　方法
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Ξ 收稿日期: 2007207207
基金项目: 浙江省中医药管理局资助课题 (2002C080) ; 广东省教育厅自然科学研究项目 (Z02041) ; 浙江省教育厅研究项目 (20062
1779)
作者简介: 熊术道 (1970—) , 男, 硕士, 助理研究员, 研究方向为肿瘤分子生物学及抗肿瘤药理学。
T el: (0577) 86550296　E2m ail: xshdao@ 163. com3 通讯作者　温博贵　T el: (0754) 8900437