全 文 ：上海中医药大学学报 第 27 卷 第 1期 2013 年 1月
实验中医
三七及三七花总皂苷对斑马鱼
模型促血管新生作用的研究
张哲睿1 黎 晌1 王佑华1，2 李铭源1 唐靖一2 刘 萍2 周 昕2 魏 莉3 周 端2
1． 中药质量研究国家重点实验室(澳门大学) ，澳门大学中华医药研究院 (澳门 999078)
2．上海中医药大学附属龙华医院高血压研究室 (上海 200032)
3．上海中医药大学中药学院 (上海 201203)
【摘 要】 目的:观察三七及三七花总皂苷对斑马鱼模型促血管新生作用的影响。方法:选择正常健康转
基因斑马鱼及内皮细胞生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(VRI)诱导血管损伤转基因斑马鱼两种模型，分别
予 25、50、100 μg /ml的三七(根)总皂苷(PNS)和三七花总皂苷(Sanqi F)干预处理，观察两者在不同浓度
下对斑马鱼肠下静脉血管(SIVs)和节间血管(ISVs)生长的影响。结果:在正常健康转基因斑马鱼模型上，
Sanqi F比 PNS拥有更为优势的促血管新生的效果，前者出现了明显的 SIVs 区域出芽现象，并呈浓度依赖
性;在 VRI损伤模型中，三七花总皂苷也展示了更为有效的保护和恢复 ISVs和 SIVs血管的效果。结论:在
斑马鱼模型上，三七花总皂苷和三七(根)总皂苷均有促血管新生和保护血管的效果，三七花总皂苷效果更
为明显。
【关键词】 三七总皂苷;三七花总皂苷;血管新生;斑马鱼
【中图分类号】 R285． 5 【文献标志码】A 【文章编号】1008-861X(2013)01-0045-05
［基金项目］ 澳门科学技术发展基金资助项目(45 /2007 /
A2，014 /2011 /A1) ;上 海 市 自 然 科 学 基 金 资 助 项 目
(12ZR1432200)
［作者简介］ 张哲睿，男，在读硕士生，主要从事中医药调节
血管新生作用的临床与基础研究。
［通讯作者］ 王佑华，副主任医师，硕士生导师;李铭源，教
授，博士生导师。
E-mail:doctorwyh@ 163． com;simonlee@ umac． mo
冠心病心肌缺血侧支循环代偿建立不足、创伤
和骨折愈合缓慢、闭塞性脉管炎等都是临床常见病、
多发病，是影响人民群众健康和生活质量的重要因
素，而血管新生不足是这些疾病共同的重要病理生
理基础，因此开展促血管新生作用的研究对诸多血
管新生不足相关疾病的防治有着重要意义。从中药
中寻找更为有效的促血管新生成分 /组分是中医药
研究的关注重点之一。三七［Panax Notoginseng
(Burk)F． H． Chen］是五加科多年生人参属植物，
《本草纲目》载三七“止血，散血，定痛”。《玉揪药
解》言:“(三七)和营止血，通脉行瘀，行瘀血而敛新
血。”近现代中西医汇通大家张锡纯谓三七“能化腐
生新，化瘀血而不伤新血”。1912 年版《中国医药大
辞典》则认为三七“去瘀生新，消肿定痛”。既往多以
根、茎入药，提取物三七总皂苷具有多种药理活性，广
泛用于临床心脑血管等多种缺血性疾病防治。三七
花是三七的干燥花蕾，《中华本草》记载“性甘味凉，
清热生津、平肝降压。主治津伤口渴，咽痛音哑，高血
压病”。民间常用三七花作为高血压及其相关疾病的
保健和治疗用药，虽历时悠久，但目前国内外对三七
花的研究相对较少，其药用价值未被充分开发利用。
斑马鱼在药物筛选上是经广泛验证的通用模式
生物之一［1］，研究表明斑马鱼血管系统及其对调节
血管新生类药物的治疗反应与哺乳动物类似［2］，且
观察药物对斑马鱼模型血管新生的影响简便易行。
本课题组已应用于各种转基因斑马鱼来进行中药成
分促 /抗血管新生的研究［3-5］。本文分别应用正常
健康转基因斑马鱼及内皮细胞生长因子受体酪氨酸
激酶抑制剂(VEGF receptor kinase inhibitor Ⅱ，VRI)
诱导血管损伤转基因斑马鱼两种模型，观察三七
(根)总皂苷(PNS)和三七花总皂苷(Sanqi F)促血
管新生活性的影响，报道如下。
1 材料与方法
1． 1 实验材料
1． 1． 1 动物 转基因斑马鱼 Tg(fli1a-EGFP)y1，由美
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ACTA UNIVERSITATIS TRADITIONIS MEDICALIS SINENSIS PHARMACOLOGIAEQUE SHANGHAI Vol． 27 No． 1 Jan．，2013
国 Zebrafish International Resource Center(Oregon，PO)
公司提供。斑马鱼依据 zebrafish handbook方法饲养。
1． 1． 2 药物、试剂与仪器 三七花，云南文山科创
中心有限公司提供(产地:云南文山)。选用 AB-8
大孔吸附树脂(天津南开大学化工厂) ，装柱径高比
为 1∶ 10，按每克生药 1． 25 g 干树脂上样，上样生药
浓度为 0． 2 g /ml，充分吸附后，水洗至无 Molish 反
应，后以 3 倍树脂体积的 70%乙醇溶液洗脱，吸附
及洗脱流速均为 2 倍树脂柱体积 /h，洗脱物蒸干后
得到三七花蕾总皂苷的提取物，呈黑褐色。以高效
液相色谱分析法测得含量为 95%以上。PNS 由澳
门大学中华医药研究院张庆文博士提供，以高效液
相色谱分析法测得含量为 95%以上。临用前均用
DMSO配制为 100 mg /ml 储备液，0． 22 μm 滤膜过
滤，-20℃储存。
内皮细胞生长因子受体抑制剂(VRI) ，购于美
国 Calbiochem 公司(Cat． No． 676481) ，溶解在
DMSO中配制为500 μg /ml储备液，－20℃储存;紫外
可见光分光光度计(UV 8453) ，Agilent Technologies
产品;奥林巴斯旋转盘共聚焦显微镜系统，日本
Olympus产品。
1． 2 正常健康转基因斑马鱼模型实验 选择状态
良好，发育至 24 h 的转基因斑马鱼 Tg(fli-1a:
EGFP)y1 胚胎，除去卵壳，将其放入含有饲养液的
12 孔板中(每孔不少于 10 个)。加入用 DMSO溶解
的 25、50、100 μg /ml 的 PNS 和 Sanqi F，以 0． 2%的
DMSO为空白对照，放入 28． 5 ℃的饲养箱里。饲养
至约 48 h时，清洗 12 孔板上的加药孔，重新加入饲
养液和不同浓度的药物，操作同第 1 天。约至 72 h
时，在荧光显微镜下观察斑马鱼肠下静脉血管
(SIVs)的状态。
1． 3 VRI诱导血管损伤转基因斑马鱼模型实验
选择状态良好，发育至 21 h 的斑马鱼胚胎，除去卵
壳，将其放入饲养液的 12 孔板中(每孔不少于
10 个)。预先加入 VRI 500 ng /ml，在饲养箱里处理
3 h，然后用饲养液清洗 3 ～ 4 遍，再加入用 DMSO溶
解的 25、50、100 μg /ml 的 PNS 和 Sanqi F，以 0． 2%
的 DMSO为空白对照，加入 VRI 后加 0． 2% DMSO
组为阴性对照，放入 28． 5 ℃的饲养箱里。饲养至约
48 h时，清洗 12 孔板上的加药孔，重新加药，操作同
前 1 天。约至 72 h时，在荧光显微镜下观察 PNS和
Sanqi F在不同浓度对斑马鱼节间血管(ISVs)以及
肠下静脉血管的影响。
1． 4 观察方法 在正常健康斑马鱼模型上，通过统
计肠下静脉血管的光滑拱形结构外围出芽平均数
(出芽总数除以该组斑马鱼数量)以及出芽斑马鱼
在每组中所占的比例(出芽斑马鱼数目除以总斑马
鱼数目)来评估 PNS 和 Sanqi F 对斑马鱼血管新生
的影响。在 VRI 诱导血管损失模型中，我们将从背
主动脉(DA)或者脊椎主静脉(PCV)发芽延伸并连
接到背部脊索血管(DLAVs)的 ISVs 定义为完整血
管(intact) ，而一些已经从 DA 或者 PCV 延伸出，但
是并无与 DLAVs 相连的 ISVs 定义为缺陷型血管
(defective)。分别对每条斑马鱼的完整型和缺陷型
血管进行统计分析。
1． 5 统计学方法 每组至少 15 条斑马鱼，结果用
x ± s表示，不少于 3 次重复实验。
2 结果
2． 1 对正常健康斑马鱼肠下静脉血管的影响 正
常健康转基因斑马鱼模型实验中发现，在 PNS 和
Sanqi F的最高无毒浓度下，正常斑马鱼的 ISVs 血
管并没有明显变化;相对而言，在 72 h 的 SIVs 区
域，药物干预组与对照组出现了显著的变化。对照
组的 SIVs区域是一个类似于篮网的光滑拱形结构，
内部有 4 ～ 6 根血管;而 25、50、100 μg /ml PNS 和
Sanqi F从 24 h处理到 72 h，光滑的拱形血管外围出
现了不同程度的尖锐的出芽血管。数据分析得出，
在相同浓度下 PNS 的出芽率以及平均出芽数目均
没有 Sanqi F高，并且前者不具有浓度依赖关系。而
Sanqi F在 50、100 μg /ml浓度下均与相同浓度下的
PNS表现出显著性差异。见图 1。
2． 2 对 VRI诱导血管损伤斑马鱼模型节间血管的
保护作用 VRI诱导血管损伤转基因斑马鱼模型实
验发现，空白对照组的 SIVs区域是一个类似于篮网
的光滑拱形结构，内部有 4 ～ 6 根血管，ISVs 区域完
整，平均数目为 28 根，完好连接 DA 和 DLAVs。而
VRI对照组，ISV和 SIVs以及 DLAVs都出现了明显
的缺失。VRI 空白对照组平均有 2 根完整 ISVs，平
均有 3 根缺陷型 ISVs。在 25、50、100 μg /ml PNS加
药组中，在处理 48 h 后显示了明显的保护 ISVs 血
管效果，而且对 SIVs 区域也有一定程度上保护效
果，并呈浓度依赖性。相对而言，25、50、100 μg /ml
的 Sanqi F比前者有着更为明显的保护 ISVs和 SIVs
效果，而且在较高的两个浓度下与 PNS 均有显著性
差异。另外，加药处理 48 h与 24 h的血管数目有着
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上海中医药大学学报 第 27 卷 第 1期 2013 年 1月
A:对照组;B ～ D:分别为 25、50、100 μg /ml PNS组;E ～ G:分别为 25、50、100 μg /ml Sanqi F组。黄色箭头代表出
芽肠下静脉血管。与对照组比较，* P ＜ 0． 05，＊＊P ＜ 0． 01，＊＊＊P ＜ 0． 001;与 50 μg /ml Sanqi F 组比较，
＆P ＜ 0． 05，$ P ＜ 0． 01;与 100 μg /ml Sanqi F比较，# P ＜ 0． 001
图 1 PNS和 Sanqi F对 Tg(fli1a-EGFP)y1 斑马鱼胚胎 SIVs促血管新生活性作用
明显的增多趋势，这说明这两种皂苷不仅对 VRI 诱
导的血管损伤在前期有保护效果，也能够说明在后
期血管发育过程中也具有促血管新生起到恢复的效
果。见图 2。
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ACTA UNIVERSITATIS TRADITIONIS MEDICALIS SINENSIS PHARMACOLOGIAEQUE SHANGHAI Vol． 27 No． 1 Jan．，2013
A:对照组;B:VRI 500 ng /ml处理 3 h，0． 2%DMSO处理 24 h组;C ～ E:分别为 25、50、100 μg /ml PNS 组;F ～ H:
分别为 25、50、100 μg /ml Sanqi F组。A＇～ B＇:为 0． 2%DMSO处理 24 h后 72 h的斑马鱼;C＇～ H＇:分别为 C ～ H组
再加药处理 24 h 后的 72 h 斑马鱼;a ～ h:为 A ＇ ～ H ＇组 SIVs 区域放大 2 倍。与 VRI 组比较，* P ＜ 0． 05，
＊＊P ＜ 0． 01，＊＊＊P ＜ 0． 001;与 50 μg /ml Sanqi F组比较，# P ＜ 0． 001;与 100 μg /ml Sanqi F比较，＆P ＜ 0． 05
图 2 PNS和 Sanqi F对 VRI诱导 Tg(fli1a-EGFP)y1 斑马鱼 ISVs和 SIVs血管损伤模型的保护作用
3 讨论
血管新生与中医学“生脉”理论密切相关，中医
文献中有“生脉”、“生肌”等方面的论述，以及“去瘀
生新”、“活血生肌”等理论，这为中医药促血管新生
作用奠定了理论基础，大量临床研究也已表明活血
化瘀类中药对诸多缺血性疾病具有一定的疗效。三
七总皂苷由人参皂苷 Rg1、Rb1、Re 和三七皂苷 R1
等成分组成，是三七主要活性部位。而三七花蕾中
的总皂苷量高于三七的任何部分，含有人参皂苷
Rb1、Rb2、Rb3、Rd、F 等多种单体皂苷，其中二醇皂
苷 Rb3 和 Rc 含量尤为丰富
［6］，提示三七花总皂苷
与三七总皂苷药理作用可能会有所不同。
本课题组从三七花中得到总皂苷、氨基酸、多
糖、醚提物等组分，并对三七花活性部位进行了心血
管药效学筛选，提取、制备出三七花总皂苷，发现了
三七花总皂苷与三七总皂苷相比较独特的心血管药
理活性［7-10］。本文进一步观察了三七及三七花总皂
苷对斑马鱼模型促血管新生活性的影响。
在斑马鱼的发育过程中，脑部和视网膜等血管
在发育初期就有着极其复杂的蜂窝状血管网络，而
且在后期还能衍生出更微细更复杂的血管［11］，这不
利于我们实验观察和统计，而斑马鱼的 SIVs和 ISVs
区域却能很好地解决这个问题，它不仅在发育的初
期清晰可见，利于观察，而且统计快捷方便，较易获
得客观可信的实验结果［12］。在正常健康斑马鱼模
型中，通过观察 SIVs的状态来判断药物是否具备促
血管新生效果有如下两个依据:一是肠下静脉血管
的光滑拱形结构外围是否有出芽;二是肠下静脉血
管内部是否出现增多的分支血管。由于拱形内部的
血管往往出现纵横交叉错形态，作为评判标准可能
难于数据统计以及不具有足够一致性［13］。故在本
文中仅统计出芽血管作为是否具有促血管新生的评
判依据。另外 VEGFR 络氨酸激酶抑制剂Ⅱ(VRI)
作为在抗血管新生上颇具潜力的小分子化合物，在
抗癌方面亦有不俗的效果［14］，我们利用 VRI来模拟
血管新生功能缺陷的模型，并且靶点清晰，针对性
强。在此设想下，探讨两种皂苷对 VRI 损伤血管的
保护和修复效果，进一步更好地评价两种皂苷在伤
口愈合、局部缺血以及在植入手术方面的潜在效果。
我们不仅在实验中发现 VRI 能够在斑马鱼胚胎中
引起 SIVs 和 ISVs 血管的缺陷，证实了 VRI 能够使
斑马鱼胚胎的血管新生过程受阻。
我们的研究数据表明，在正常健康转基因斑马
鱼模型上，三七花总皂苷比三七(根)总皂苷拥有更
为优势的促血管新生的效果，前者出现了明显的
SIVs区域出芽现象。在 VRI损伤模型中，三七花总
皂苷也展示了更为有效的保护和恢复 ISVs 和 SIVs
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上海中医药大学学报 第 27 卷 第 1期 2013 年 1月
血管的效果。这些结果都清晰地说明了在斑马鱼模
型上，三七花总皂苷比三七(根)总皂苷有着更为优
势的促血管新生和保护血管的效果。进一步的研究
正在进行之中。
参考文献:
［1］ Tran TC，Sneed B，Haider J，et al． Automated，quantitative
screening assay for antiangiogenic compounds using transgenic
zebrafish［J］． Cancer Res，2007，67(23) :11386-11392．
［2］ Langheinrich U． Zebrafish:a new model on the pharmaceutical
catwalk［J］． Bioessays，2003，25(9) :904-912．
［3］ Hu G，Mahady GB，Li S，et al． Polysaccharides from Astragali
Radix restore chemical-induced blood vessel loss in zebrafish［J］．
Vascular Cell，2012，4(1) :2．
［4］Lam IK，Alex D，Wang YH，et al． In vitro and in vivo structure and
activity relationship analysis of polymethoxylated flavonoids:
identifying sinensetin as a novel anti-angiogenesis agent［J］． Mol
Nutr Food Res，2012，56(6) :945-956．
［5］杨彬睿，林衍祺，王佑华，等．甜橙黄酮对斑马鱼及人脐静脉内皮
细胞抗血管新生活性的作用［J］． 上海中医药大学学报，2012，
26(4) :76-80．
［6］Gao XF，Dan M，Zhao AH，et al． Simultaneous determination of
saponins in flower buds of Panax notoginseng using high
performance liquid chromatography［J］． Biomed Chromatogr，2008，
22(3) :244-249．
［7］魏莉，杜奕，周浩． 不同产地和生长年限三七花蕾中总皂苷及单体
皂苷的含量测定［J］．上海中医药杂志，2008，42(4):76-78．
［8］魏莉，周浩． 大孔吸附树脂分离纯化三七花蕾总皂苷的研究
［J］．中药材，2008，31(9) :1418-1421．
［9］周端，王佑华，苑素云，等． 三七花总皂苷对人主动脉血管平滑
肌细胞增殖及细胞内钙离子浓度的影响［J］．上海中医药大学
学报，2007，21(2) :61-63．
［10］Wang YH，Qian PG，Liu P，et al． The effects of Panax notoginseng
flower extract on changes of TGF-β /Smads signaling transduction
pathway in Heart Remodeling of Human Chymase Gene Transgenic
Mice［J］． Mol Med Report，2012，5(6) :1443-1448．
［11］ Stainier DY，Weninstein BM，Detrich HW，et al． Cloche，an Early
Acting Zebrafish Gene，Is Required by Both the Endothelial and
Hematopoietic Lineages［J］． Development，1995，121(10):3141-3150．
［12］Childs S，Chen JN，Garrity DM，et al． Patterning of angiogenesis in
the zebrafish embryo［J］． Development，2002，129(4) :973-982．
［13］ Raghunath M，Sy Wong Y，Farooq M，et al． Pharmacologically
induced angiogenesis in transgenic zebrafish［J］． Biochem Biophys
Res Commun，2009，378(4) :766-771．
［14］ Reichardt W，Hu-Lowe D，Torres D，et al． Imaging of VEGF
receptor kinase inhibitor-induced antiangiogenic effects in drug-
resistant human adenocarcinoma model［J］． Neoplasia，2005，7
(9) :847-853．
编辑:白玉金
收稿日期: 2012-10-26
Angiogenic Effect of Total Saponins Extracted from Root and Flower
of Panax Notoginseng in Zebrafish Model
ZHANG Zhe-rui1 LI Shang1 WANG You-hua1，2 LI Ming-yuan1 TANG Jing-yi2
LIU Ping2 ZHOU Xin2 WEI Li3 ZHOU Duan2
1． State Key Laboratory of Quality Research in Chinese Medicine，Institute of Chinese
Medical Sciences，University of Macau
2． Longhua Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine
3． School of Chinese Meteria Medica，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine
ABSTRACT Objective: To evaluate the angiogenic effect of total saponins extracted from root and flower of Panax
Notoginseng in zebrafish model． Methods: The healthy transgenic zebrafish and transgenic zebrafish of vascular injury induced
by vascular endothelial growth factor ( VEGF) receptor tyrosine kinase inhibitorⅡ ( VRI) were selected，and the zebrafish
models were treated with the total saponins ( 25 μg /ml，50 μg /ml，100 μg /ml) extracted from root and flower of Panax
Notoginseng respectively． The subintestinal vessels ( SIVs) and intersegmental vessels ( ISVs) in zebrafish were assessed．
Results: In healthy transgenic zebrafish，the total saponins extracted from flower of Panax Notoginseng had better angiogenic
effect than the total saponins extracted from root of Panax Notoginseng with dose-dependent manner，and there were sprouting
vessels from SIVs basket． In transgenic zebrafish of vascular injury induced by VRI，the total saponins extracted from flower of
Panax Notoginseng had protective and recovery effects on the SIVs and ISVs． Conclusion: The total saponins extracted from
root and flower of Panax Notoginseng have angiogenic effect in zebrafish model，especially the total saponins extracted from
flower of Panax Notoginseng．
KEY WORDS Total saponins of Panax Notoginseng; total saponins of Panax Notoginseng flower; angiogenesis; zebrafish
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