全 文 ：0 005%~ 0 07%,基本上每 10 000 kg 红豆杉树皮
才能提取 1 kg 紫杉醇原料药,按现在的提取纯化技
术,全世界每年需要 25 000 t 树皮,相当于 75 万株
树龄 60 年以上的红豆杉的树皮; 从树皮中获得紫
杉醇必然会对红豆杉这一濒危资源造成毁灭性破
坏。因此利用植物细胞培养法生产紫杉醇已成为一
个有效可取的途径。
从实验结果看,东北矮紫杉愈伤组织的形成较
容易,特别是根与茎在含 2, 4D 的培养基上基本都
能形成, 生长速度也较快, 继代培养后速度更快。
NAA 对东北矮紫杉愈伤组织中紫杉醇和 10乙酰
巴卡亭 的合成均有促进作用, 且 10乙酰巴卡亭
的量均比紫杉醇高。本研究运用正交试验得到了
生产紫杉醇和 10去乙酰巴卡亭 的最佳植物生长
调节剂组合,此研究为解决药用植物东北矮紫杉资
源短缺及实验室生产紫杉醇和 10乙酰巴卡亭 提
供了实验依据, 对今后以组培细胞技术生产东北矮
紫杉原材料具有重要的意义。
参考文献:
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手性流动相添加剂法测定积雪草中积雪草总苷的量及其总苷特征图谱
郏征伟,毛秀红, 陈 钶,王 柯,季 申*
收稿日期: 20100216
作者简介:郏征伟( 1979 ) ,男,上海市人,药师,硕士,主要从事中药质量控制研究。
T el : ( 021) 3883990026126 Email: jiazhengw ei1979@ gmail . com
* 通讯作者 季 申 T el: ( 021) 50798195 Email: jish en2008@ gmail. com
(上海市食品药品检验所,上海 201203)
摘 要:目的 以环糊精为流动相添加剂,拆分积雪草药材及其总苷中羟基积雪草苷和积雪草苷, 建立羟基积雪
草苷和积雪草苷的定量测定方法, 同时建立积雪草总苷的高效液相色谱特征图谱。方法 采用 Dikma Diamon
silTM C18( 250 mm ! 4. 6 mm, 5 m) 色谱柱; 流动相为乙腈2 mmo l/ L 环糊精溶液 ( 24∀ 76) ; 柱温 30 # ;体积流
量 1 0 mL / min;检测波长 205 nm;理论塔板数按积雪草苷峰计算应不低于 4 000。结果 环糊精的加入很好地
分离积雪草药材及其总苷中的羟基积雪草苷和积雪草苷 ,满足了定量分析的要求, 其中有效成分羟基积雪草苷和
积雪草苷的线性范围分别为 0 181~ 18 1 g ( r= 0 999 98) 和 0 195~ 19 5 g ( r= 0 999 98) ,积雪草药材的平
均加样回收率 ( n= 9) 分别为 101 2% 和 101 6% , 积雪草总苷的平均加样回收率 ( n= 9) 分别为 100 3% 和
99 3% , 11 批次的积雪草总苷样品的高效液相色谱特征图谱中确定 6 个共有峰作为定性的指标峰。结论 本法
简便快速、结果准确、重现性好,可用于积雪草药材及其总苷的质量控制。
关键词:积雪草药材; 积雪草总苷; 羟基积雪草苷; 积雪草苷
中图分类号: R286 1 文献标识码: A 文章编号: 0253 2670( 2010) 12 2070 05
Quantitative analysis and HPLC specific chromatogram of Centellae Herba
and its total glucosides by chiral mobile phase additives
JIA Zhengwei, MAO Xiuhong, CHEN Ke, WANG Ke, JI Shen
( Shanghai Instit utie for Food and D rug Contr ol, Shanghai 201203, China)
Abstract: Objective T o separate the isomers of madecassoside in Centel lae H er ba and its total gluco
sides, determine madecassoside and asiat icoside in them , and establish an H PLC specif ic chromatogr am fo r
∃2070∃ 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 12 期 2010 年 12月
Centel lae H er ba to tal gluco sides by using cyclodex t rin as mobile phase addit iv es. Methods T he Dikma
DiamonsilTM C18 column ( 250 mm ! 4. 6 mm , 5 m) w as served as analyt ical column and acetonit rile2
mmo l/ L cyclodex t rin ( 24∀ 76) as mobile phase at a f low rate of 1. 0 mL/ m in, the detect ion w avelength
w as 205 nm and column temperatur e w as 30 # . Theoretical plate number o f asiat icoside w as over 4 000.
Results T he isomer s in Centel lae H er ba and its total g lucosides w ere separated w ith the addit ives of cy
clodex t rin, meet ing the requir ements of quantitativ e analy sis. In w hich, madecasso side and asiat icoside
show ed a good linearity in the range of 0. 181 18. 1 g ( r= 0. 999 98) and 0. 195 19. 5 g ( r= 0. 999 98)
each. T he mean r ecovery of madecassoside and asiat icoside in Centel lae H er ba was 101. 2% and 101. 6%
( n= 9) , and that of it s 11 batches of total glucosides w as 100. 3% and 99. 3%, respect iv ely . U nder the
qualitat iv e conditions, the six common peaks in HPLC specific chromatog ram of its 11 batches of total g lu
cosides could be used as marker peaks for qualitat ive ident ificat ion. Conclusion T he analy tical method is
pro ved to be convenient and accurate, w hich can be used for the quality cont ro l of Centel lae H erba and its
to tal gluco sides.
Key words: Centel lae H er ba; Centel lae H er ba to tal gluco sides; madecasso side; asiaticoside
积雪草为伞形科植物积雪草 Centel la asiati ca
( L . ) U rban 的干燥全草,其提取物可制成如积雪苷
片、积雪苷霜 (脂) 软膏等药品品种, 具有促进伤口
愈合、抑制疤痕增生等功效[ 12]。2005年版%中国药
典&中,积雪草药材项下无定量测定方法; 而其总苷
的质量标准收载于卫生部药品标准中药成方制剂第
十三册积雪苷片剂质量标准的附注项下, 定量测定
方法为紫外分光光度法, 方法操作繁琐,专属性和准
确性差,在控制药品的质量方面尚有所欠缺。为此,
在 2010 年版%中国药典&药品标准研究工作中, 采
用环糊精为流动相添加剂对积雪草中的羟基积雪
草苷和积雪草苷进行分离, 建立了积雪草药材及其
总苷中的主要成分羟基积雪草苷和积雪草苷的定量
测定方法与积雪草总苷的高效液相色谱特征图谱,
从而完善积雪草药材及其总苷的质量标准。
1 仪器与试药
Agilent 1100 Series 高效液相色谱仪, 配二极
管阵列检测器 (美国 Agilent 公司) ; A gilent 1100
Series 高效液相色谱质谱联用仪 (美国 Ag ilent 公
司) ; Sartorius BS2202/ CP225D 型电子天平 (德国
Sartorius公司)。
甲醇、乙腈均为色谱纯 (德国 Merck 公司) ;水
为超纯水 ( MilliQ) ; 环糊精购自国药集团化学试
剂有限公司;其余试剂均为分析纯 (国药集团化学
试剂有限公司)。羟基积雪草苷和积雪草苷对照品
(质量分数> 98% ) 由 Sigma 公司提供; 9 批积雪草
药材和 11 批积雪草总苷样品的来源和批号见表 1。
2 方法与结果
2 1 色谱条件与系统适应性试验: 色谱柱为 Dik
ma DiamonsilTM C18 ( 250 mm ! 4. 6 mm, 5 m) ;流
动相为乙腈2 mmol/ L 环糊精溶液 ( 24 ∀ 76) ;体
积流量 1 0 mL/ min; 检测波长 205 nm; 柱温
30 # ;进样量 10 L。理论塔板数按积雪草苷峰计
算应不低于 4 000。色谱图见图 1。
2 2 对照品溶液的制备:精密称取羟基积雪草苷和
积雪草苷对照品适量,加甲醇制成质量浓度为0 2
表 1 积雪草药材及积雪草总苷样品的来源和批号
Table 1 Origins and lot number of Centellae Herba and its total glucosides
No. 批 号 积雪草药材样品来源 No. 批 号 积雪草总苷样品来源
1 080703* 浙江中医药大学中药饮片厂 1 090105* 广西昌洲天然产物开发有限公司
2 080815 浙江中医药大学中药饮片厂 2 090110 广西昌洲天然产物开发有限公司
3 080816 浙江中医药大学中药饮片厂 3 090205 广西昌洲天然产物开发有限公司
4 071104 上海康桥中药饮片有限公司 4 080717 上海医药工业研究院
5 2006071125 上海德华国药制品有限公司 5 0802001 上海医药工业研究院
6 070506 上海虹桥中药饮片有限公司 6 080809 上海医药工业研究院
7 2007010216 上海雷允上中药饮片有限公司 7 080505 上海医药工业研究院
8 070819 上海养和堂中药饮片有限公司 8 AG080701 上海医药工业研究院
9 20071208 广东省药材公司中药饮片厂 9 080718 上海医药工业研究院
10 080501 广州环叶制药有限公司
11 080506 广州环叶制药有限公司
* 作为方法学考察用样品
* U sed as sam ple for m ethodological study
∃2071∃中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 12 期 2010 年 12月
1羟基积雪草苷 2积雪草苷
1madecas soside 2asiaticoside
图 1 对照品 (A)、积雪草药材 ( B) 和积雪草总苷 (C) 的 HPLC色谱图
Fig. 1 HPLCChromatograms of ref erence substances (A) , Centellae Herba ( B) , and its total glucosides (C)
mg/ mL 的溶液,即得。
2 3 供试品溶液的制备: 取积雪草药材粉末 (过 2
号筛) 约 0 5 g ,精密称定,置具塞锥形瓶中, 精密加
入 80% 甲醇 20 mL, 称定质量, 超声处理 (功率
180 W,频率 42 kHz) 30 min,放冷,用 80% 甲醇补
足减失的质量, 离心,取上清液,即得。
取积雪草总苷样品约 50 mg ,精密称定, 置 50
mL 量瓶中,加甲醇使溶解,并稀释至刻度, 摇匀, 滤
过,取续滤液,即得。
2 4 方法学考察
2 4 1 线性关系考察:精密称取羟基积雪草苷和积
雪草苷对照品适量, 加甲醇制成约 5 mg/ mL 的对
照品贮备液,再精密吸取上述两种对照品贮备液适
量,制成 0 02、0 05、0 1、0 2、0 5、1 0、2 0 mg / mL
浓度系列的混合对照品溶液。分别精密吸取各混合
对照品溶液 10 L 注入液相色谱仪, 记录峰面积。
以进样量为横坐标, 峰面积为纵坐标, 绘制标准曲
线,进行回归分析。结果羟基积雪草苷在 0 181~
18 1 g 与峰面积值线性关系良好, 回归方程为
Y= 250. 2 X - 9. 423, r = 0. 999 98; 积雪草苷在
0 195~ 19 5 g 与峰面积值线性关系良好,回归方
程为 Y= 265 1 X - 15 211, r= 0 999 98。
2 4 2 精密度试验:精密吸取 0 2 mg/ mL 的混合
对照品溶液 10 L,连续重复进样 6 次,羟基积雪草
苷和积 雪 草苷 峰 面积 RSD 分 别 为 0 36%
和 0 49%。
2 4 3 重现性试验:取同一积雪草药材和积雪草总
苷样品, 各 6 份, 按 2 3 项下的方法分别制备供试
品溶液,进样测定。积雪草药材中羟基积雪草苷和
积雪草苷质量分数 RSD 分别为 1 04% 和 1 83% ,
积雪草总苷中两者质量分数 RSD 分别为 0 14%
和 0 61%。
2 4 4 稳定性试验:取积雪草药材和积雪草总苷样
品,各 1 份, 按 2 3 项下的方法制备供试品溶液, 分
别在 0、1、2、3、6、9、12、18、24 h 时进样测定, 积雪草
药材中羟基积雪草苷和积雪草总苷峰面积 RSD 值
分别为 1 16% 和 0 74% ,积雪草总苷中两者峰面
积 RSD 值分别为 0 16% 和 0 17% ,表明供试品溶
液在 24 h 内稳定。
2 4 5 回收率试验:精密称取已测定的积雪草药材
样品粉末 0 25 g, 一式 9 份, 置具塞锥形瓶中, 以 3
份为一组, 分别精密加入相当于样品中已知量
50%、100%、200% 的对照品溶液, 按 2 3 项下的方
法,制备加样供试品溶液,进样测定。结果羟基积雪
草苷的平均 加样回收率为 101 2%, RSD 为
1 51% ;积雪草苷的平均加样回收率为 101 6%,
RSD 为 1. 72%。另取已测定的积雪草总苷样品粉
末 25 mg ,一式 9 份,同法制备加样供试品溶液,进
样测定, 结果羟基积雪草苷的平均加样回收率为
100 3% , RSD 为 0. 39% ; 积雪草苷的平均加样回
收率为 99 3%, RSD 为 0 30%。
2 4 6 样品测定:取 9 批积雪草药材和 11 批积雪
草总苷样品,分别按 2 3 项下的方法制备供试品溶
液,进样测定,以外标法计算,结果见表 2。
表 2 积雪草药材及积雪草总苷样品中羟基积雪草苷
和积雪草苷的测定 (n= 2)
Table 2 Determination of madecassoside and asiaticoside
in Centellae Herba and its total glucosides ( n= 2)
序号
积雪草药材/ %
羟基积雪草苷 积雪草苷 总和
积雪草总苷/ %
羟基积雪草苷 积雪草苷 总和
1 1 10 0 13 1 23 28 8 37 9 66 7
2 0 97 0 67 1 64 37 2 27 3 64 5
3 0 42 0 50 0 92 34 7 30 9 65 6
4 0 68 0 68 1 36 22 9 36 5 59 4
5 0 56 0 08 0 64 37 3 23 6 60 9
6 0 39 0 00 0 39 22 6 37 7 60 3
7 0 64 0 19 0 82 36 5 27 5 64 0
8 0 85 0 78 1 63 21 8 37 9 59 7
9 0 80 0 08 0 88 35 6 27 3 62 9
10 35 8 28 5 64 3
11 36 0 28 6 64 6
2 5 特征图谱的建立
2 5 1 共有指纹峰的标定: 按照 2 2 和 2 3 项下
∃2072∃ 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 12 期 2010 年 12月
的对照品和供试品溶液的制备方法,对两种对照品
和 11 批次积雪草总苷样品的 HPLC 图谱进行分
析。结果表明各色谱峰在 40 min 内全部出峰,其特
征图谱共包括 6 个共有峰 (占总峰面积的 95% 以
上) , 如图 2所示,其中 2、6 号峰分别为羟基积雪苷
和积雪草苷, 以 2 号羟基积雪草苷峰为内参比峰,
分别计算其他各峰的相对保留时间和相对峰面积。
6个共有峰相对保留时间分别为: 峰1 ( 0 739)、峰2
( 1000)、峰 3 ( 1 308)、峰 4 ( 1 478)、峰5 ( 1 652)、峰
6 ( 2 069) , 11批样品各共有峰相对保留时间的 RSD
值小于 0 5%。共有峰的相对峰面积见表 3。
2 5 2 相似度评价:将所得到的 11 批积雪草总苷
色谱图导入国家药典委员会推荐的∋中药指纹图谱
评价系统 ( 2004A 版) (,剪切掉前 6 m in 的溶剂峰,
通过色谱峰多点校正的方法, 将谱峰自动匹配,然后
生成对照图谱, 进行相似度评价, 结果见图 3 和表
4。11 批积雪草总苷与对照图谱相似度均达到
0 96 以上,相似度良好。
图 2 积雪草总苷标准特征图谱
Fig. 2 Standard HPLC specific chromatogram
of Centellae Herba total glucosides
表 3 各批次积雪草总苷样品共有峰的相对峰面积
Table 3 Relative peak area of common peaks in diff erent batches of Centellae Herba total glucosides samples
峰号 相对峰面积
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
1 0 505 1 0 459 7 0 530 3 0 606 1 0 554 8 0 604 7 0 566 4 0 600 6 0 568 3 0 574 5 0 580 6
2( S) 1 000 0 1 000 0 1 000 0 1 000 0 1 000 0 1 000 0 1 000 0 1 000 0 1 000 0 1 000 0 1 000 0
3 0 065 6 0 036 8 0 044 9 0 107 3 0 036 6 0 108 1 0 044 9 0 104 9 0 045 1 0 046 7 0 047 7
4 0 103 7 0 067 9 0 072 4 0 086 8 0 064 5 0 084 0 0 066 0 0 087 1 0 068 8 0 065 3 0 067 0
5 0 123 2 0 068 3 0 084 9 0 119 6 0 066 2 0 116 2 0 080 3 0 119 6 0 081 6 0 087 5 0 087 4
6 1 381 9 0 776 4 0 943 4 1 756 1 0 674 3 1 747 4 0 806 6 1 756 3 0 807 6 0 834 8 0 838 6
图 3 11 批积雪草总苷样品的 HPLC 色谱图
(自下而上, 依次为样 1 至样 11)
Fig. 3 HPLC Chromatograms of 11 batches of Centellae
Herba total glucosides ( from bottom to top,
followed by sample 1 to sample 11)
表 4 积雪草总苷样品特征图谱的相似度
Table 4 Similarities of specific chromatogram
for Centellae Herba total glucosides
样品编号 相似度 样品编号 相似度
1 0987 7 0 992
2 0991 8 0 968
3 0999 9 0 992
4 0968 10 0 994
5 0980 11 0 994
6 0968
3 讨论
3 1 干扰物的产生与确证:积雪草及其总苷所含的
化学成分较为复杂, 主要有效成分为羟基积雪草苷
和积雪草苷, 因而对分离的要求相对较高。文献曾
报道过采用高效液相色谱法测定积雪草药材、积雪
草总苷及其制剂中羟基积雪草苷和积雪草苷量的方
法[ 36] ,其中大多采用乙腈水或者甲醇水作为流动
相,然而在上述体系的流动相条件下,供试品溶液色
谱图中羟基积雪草苷色谱峰与其他色谱峰产生重
叠。无论采用恒组分洗脱还是梯度洗脱都无法将其
分开,说明该干扰峰与羟基积雪草苷的色谱行为极
为相似,可能为它的同分异构体。
鉴于上述结果,我们尝试采用液相色谱质谱法
并结合细粒径的窄径柱的方法来排除羟基积雪草苷
色谱峰的干扰,尝试了细粒径的窄径柱后,干扰峰与
羟基积雪草苷色谱峰的分离度有了一定的提高, 达
到定量检测的要求, 但窄径柱价格昂贵、柱压高、对
样品前处理要求严格等缺点,限制了该方法的通用
性。其次,从质谱图中可以看出,羟基积雪草苷色谱
峰处的干扰峰同样出现在质谱图中, 说明该干扰物
在离子化后产生的母离子具有与羟基积雪草苷母离
∃2073∃中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 12 期 2010 年 12月
子一样的分子量,再次证明了我们之前的推断,干扰
物极有可能是羟基积雪草苷的同分异构体。结合相
关文献的报道[ 7] ,推断干扰峰为积雪草苷 B,它与羟
基积雪草苷是一对乌苏烷型和齐墩果烷型结构异构
的同分异构体。
3 2 异构体的分离: 目前对于 HPLC 法拆分异构
体的方法主要有手性试剂衍生、采用手性柱、手性流
动相添加剂法等,其中手性流动相添加剂法有其独
特的优点。据文献报道,潘见等 [ 8]采用 环糊精流
动相添加剂法来分离测定积雪草总苷元中的羟基积
雪草酸。因此我们尝试采用同样的方法来分离积雪
草总苷中的羟基积雪草苷和积雪草苷 B。试验证
明, 环糊精的加入, 使各异构体与环糊精形成不
同空间位阻的包含物, 得到了不同的保留时间。而
且随着环糊精浓度的增加, 羟基积雪草苷峰与积
雪草苷 B峰的分离度越高,而流动相的 pH 值对于
色谱峰形、分离效果等均无显著影响。由于高浓度
的环糊精水溶液存在溶解性的问题 ( 1 85 g/ 100
mL, 25 # ) ,在权衡了各浓度 环糊精条件下的分
离效果后,最终选择乙腈2 mmol/ L 环糊精溶液
( 24∀ 76) 作为流动相条件。
4 结论
本实验对积雪草药材及其总苷的测定方法进行
了研究。通过在流动相中添加 环糊精, 成功地区
分了样品中的异构体, 建立了样品中羟基积雪草苷
和积雪草苷的定量测定方法;同时,在此基础上建立
了积雪草总苷的 HPLC 特征图谱, 所得图谱中共确
定了 6个共有峰,非共有峰面积所占总面积均小于
5% ,各共有峰的相对保留时间均十分稳定。各批号
样品的相似度均在 0 95~ 1 00,表明不同批号样品
间具有很高的相似度。方法快速简便、结果准确、重
现性好,为积雪草药材及其总苷的质量控制提供了
有价值的参考。
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三叶木通 AFLP 反应体系的建立及优化
王 喆1 ,张 铮1, 2, 3 * ,褚会娟1 ,王喆之1, 2, 3
收稿日期: 20100202
基金项目:陕西省科技攻关项目 ( 2010K1705)
作者简介:王 喆( 1985 ) ,女,河北省石家庄市人,硕士,研究方向为植物遗传多样性。Email : w zveta@ gmail. com
* 通讯作者 张 铮 研究方向为植物遗传 Em ail: zhangzheng@ snnu. edu. cn
( 1 陕西师范大学生命科学学院,陕西 西安 710062; 2 陕西师范大学 药用资源与天然药物化学教育部重点实验室,
陕西 西安 710062; 3 西北濒危药材资源开发国家工程实验室, 陕西 西安 710062)
摘 要:目的 为研究三叶木通种质资源遗传多样性,建立并优化三叶木通 AFLP 反应体系。方法 以三叶木通
叶片为材料,对影响 AFLP 反应体系中连接、预扩增和选择性扩增的各因素进行分析, 建立优化的 AFLP 反应体
系。结果 建立三叶木通 AFLP 反应优化体系: 连接体系加入 T 4连接酶 2 U , Mse I 接头 100 pmo l, EcoR I 接头
10 pmo l;预扩增反应总体积 20L ,加入连接产物 2 0L, E0、M0 各 100 ng , dNTPs 0. 250 mmol/ L , Mg2+ 1. 875
mmol/ L , T aq DNA 聚合酶 2 U ;选择性扩增反应总体积 20 L, 加入 5 L 稀释 100 倍的预扩增产物, E3、M 3各
50 ng , dNTPs 0. 250 mmo l/ L, Mg 2+ 1. 875 mmo l/ L, Taq DNA 酶 1 5 U。结论 建立适用于三叶木通种质资源
遗传多样性研究的 AFLP 反应优化体系。
关键词:三叶木通; AFLP; 优化
中图分类号: R282 71 文献标识码: A 文章编号: 0253 2670( 2010) 12 2074 05
∃2074∃ 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 12 期 2010 年 12月