全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 4 期 2014 年 2 月 ·504·
高纯度积雪草总苷的制备工艺研究
陈 俊 1, 2, 3，张小龙 1, 2，杨 时 1, 2，原少伟 1, 2，丁 岗 1, 2, 3，王振中 1, 2, 3，萧 伟 1, 2, 3*
1. 江苏康缘药业股份有限公司，江苏 连云港 222001
2. 中药制药过程新技术国家重点实验室，江苏 连云港 222001
3. 江苏省企业院士工作站，江苏 连云港 222001
摘 要：目的 研究高纯度积雪草总苷的制备工艺。方法 采用大孔树脂分离技术与重结晶技术相结合的方法，优选最佳积
雪草总苷制备工艺参数，同时建立积雪草总苷 HPLC 检测方法。结果 积雪草药材采用 75%乙醇回流提取、回收乙醇、水
沉、酸沉，通过 HPD-100 大孔树脂柱富集后，再采用醋酸乙酯重结晶方法，可制备质量分数 90%以上的积雪草总苷。结论 该
工艺稳定性高、重复性好，适合于制备高纯度的积雪草总苷。
关键词：积雪草；积雪草总苷；积雪草苷；羟基积雪草苷；积雪草苷 B；HPLC
中图分类号：R284.2 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)04 - 0504 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.04.010
Preparing technology of asiaticosides with high-purity
CHEN Jun1, 2, 3, ZHANG Xiao-long1, 2, YANG Shi1, 2, YUAN Shao-wei1, 2, DING Gang1, 2, 3, WANG
Zhen-zhong1, 2, 3, XIAO Wei1, 2, 3
1. Jiangsu Kanion Parmaceutical Co., Ltd., Lianyungang 222001, China
2. State Key Laboratory of New-tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process, Lianyungang 222001, China
3. Jiangsu Enterprise Academician Workstation, Lianyungang 222001, China
Abstract: Objective To study the preparing technology of asiaticosides with high purity. Methods Macroreticular resin column
chromatography and recrystallization were used to optimize the preparing technology of asiaticosides. HPLC method was established
for the contcent determination of asiaticosides. Results Centella asiatica was subjected to 75% ethanol distilment, water and acid
precipitation, HPD100 macroreticular resin separation, and recrystallization in acetic ester. Then asiaticosides with high purity over
90% were obtained. Conclusion The process is stable and feasible, and it could be used for the preparation of high-purity
asiaticosides.
Key words: Centella asiatica (L.) Urban; asiaticosides; asiaticoside; madecassoside; asiaticoside B; HPLC

积雪草 Centella asiatica (L.) Urban 为伞形科积
雪草属植物，又称崩大碗、马蹄草、老鸦碗、铜钱
草、铁灯盏等，分布于我国陕西、长江流域及以台
湾、福建等南方各省区[1]。该植物全草入药，《神农
本草经》中将其列为中品，性寒，味苦、辛，具有
清热利湿、解毒消肿之功效。《中国药典》2010 年
版收载积雪草为常用中药材，具有清热利湿、解毒
消肿的功效，用于湿热黄疸、中暑腹泻、石淋血淋、
痈肿疮毒、跌扑损伤等；临床上也常用于传染性肝
炎、流行性脑脊髓膜炎的疗效，具有抗氧化、抗胃
溃疡、抑制肿瘤细胞增生等作用[2-4]。现代研究表明
积雪草的主要活性成分为三萜皂苷、黄酮、挥发油、
多炔烯烃等，其中三萜皂苷类成分为积雪草的主要
活性成分，具有显著的抗增生、抗纤维化、抗抑郁、
抗癌症、抗氧化和改善智力等作用[5-13]。《中国药典》
2010 年版收录积雪草总苷为积雪苷片的原料，要求
控制积雪草总苷以羟基积雪草苷和积雪草苷总量
记，不得少于 55.0%[14]。本课题主要针对积雪草苷、

收稿日期：2013-10-09
基金项目：“十一五”国家科技支撑计划（2006BAI11B03）
作者简介：陈 俊，男，工程师，研究方向为中药新药研究与开发。Tel: (025)86587930-8103 E-mail: enjoysuly@163.com
*通信作者 萧 伟，男，研究员级高级工程师，博士，研究方向为中药新药的研究与开发。
Tel: (0518)81152337/13905136437 E-mail: wzhzh-nj@163.net
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 4 期 2014 年 2 月 ·505·
羟基积雪草苷和积雪草苷 B，采用现代提取纯化技
术进行高纯度积雪草总苷的制备工艺研究。
1 仪器与材料
Agilent 1100 高效液相色谱仪，二元泵，DAD
检测器（美国安捷伦科技公司）；Mettler AE 240 电
子天平（德国梅特勒-托利多公司）；SYZ—A 石英
亚沸高纯水蒸馏器（常州普天仪器制造有限公司）；
Buchi R210 旋转蒸发仪（瑞士步琪实验仪器公司）。
积雪草由安徽丰原铜陵中药饮片有限公司提供
（批号 20080214、20080914、20080920、20080926），
经南京中医药大学吴德康教授鉴定为伞形科积雪草
属植物积雪草 Centella asiatica (L.) Urban 的干燥全
草。对照品羟基积雪草苷（批号 110893-200201）、
积雪草苷（批号 110892-200403），中国食品药品检
定研究院；对照品积雪草苷 B（成都曼思特生物科
技有限公司，批号 20030312，98%）。乙腈（色谱
纯，美国 Tedia 公司）；HPD-100、D-101、AB-8 大
孔树脂（河北沧州宝恩化工有限公司）；水（重蒸水）；
甲醇、醋酸乙酯（分析纯，南京化学试剂有限公司）。
2 方法与结果
2.1 积雪草总苷定量测定方法
2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取积雪草苷、羟
基积雪草苷和积雪草苷 B 对照品 12.80、16.00、12.80
mg，以甲醇溶解于同一个 10 mL 量瓶中，定容至刻
度，即得混合对照品储备液。
2.1.2 供试品溶液的制备 取积雪草总苷供试品适
量，精密称定，加甲醇制成积雪草总苷 5 mg/mL 的
供试品溶液，摇匀，即得。
2.1.3 色谱条件 色谱柱为 Phenomenex Luna C18
100 A 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温 30 ℃；
检测波长为 205 nm；体积流量 1 mL/min；流动相为
乙腈-水，梯度洗脱程序：0～30 min，22%乙腈；30～
35 min，22%～28%乙腈；35～45 min，28%乙腈。
2.1.4 线性关系考察 精密吸取一定量的对照品储
备液，用甲醇稀释为积雪草苷和积雪草苷 B 质量浓
度分别为 0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 mg/mL、羟
基积雪草苷质量浓度分别为 0.25、0.5、1.0、2.0、
4.0、8.0 mg/mL 的混合对照品溶液。按上述色谱条
件进样 10 μL 测定。以进样量为横坐标（X），峰面
积积分值为纵坐标（Y），进行线性回归，得积雪草
苷回归方程为 Y＝2 504.566 X－16.043，r＝0.999 9；
羟基积雪草苷回归方程为 Y＝1 722.724 X－8.816，
r＝0.999 8；积雪草苷 B 回归方程为 Y＝2 285.305
X＋27.739，r＝0.999 9。结果表明，积雪草苷和积
雪草苷B在2.0～64.0 μg，羟基积雪草苷在2.5～80.0
μg，均具有良好的线性关系。
2.1.5 测定方法 分别精密吸取对照品溶液与供试
品溶液 10 μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
2.2 药材提取制备
根据文献报道[15-16]，结合积雪草总苷的理化性
质，本研究采用 75%乙醇对积雪草药材进行回流提
取。具体提取方法：加 10 倍量 75%乙醇，提取 2
次，每次 1 h，滤过，合并滤液，回收乙醇备用。
2.3 除杂方法考察
高体积分数的乙醇提取时，在得到积雪草总苷
的同时，也提取出了部分的脂溶性成分，本研究首
先采用醇提水沉的工艺对积雪草提取液进行部分除
杂，即积雪草醇提液减压回收乙醇至无醇味，浓缩
至相当于生药材 1 g/mL，加 4 倍量水，边加边搅拌，
冷藏过夜，离心，取离心液。
文献报道[4-5]积雪草中三萜类成分除积雪草总
苷外，还含有积雪草酸、羟基积雪草酸，均为弱酸
性物质。为了去除积雪草酸、羟基积雪草酸，本研
究采用调节 pH 值至强酸性使之沉淀析出而达到除
杂的目的。经过对比研究，最终确定用 2 mol/L 盐
酸调节水沉上清液 pH 值至 2.0，冷藏过夜后离心，
取离心液，干燥，加适量甲醇溶解，按“2.1”项下
方法测定积雪草总苷的量，测得积雪草苷为 7.5%，
羟基积雪草苷为 9.1%，积雪草苷 B 为 7.4%，3 种
苷总量可提高到 24.0%。实验结果表明，积雪草水
沉上清液调节 pH 值为 2.0 时，可去除部分杂质。最
终确定沉淀法除杂工艺，即积雪草醇提液减压回收
乙醇至无醇味，浓缩至相当于生药材 1 g/mL，加 4
倍量水，边加边搅拌，冷藏过夜，离心，取离心液。
离心液用 2 mol/L 的盐酸调节 pH 值为 2.0，冷藏过
夜，离心，取离心液。
2.4 大孔树脂富集工艺考察
根据相关文献及专利信息，从积雪草中制备积
雪草总苷的方法主要有溶剂萃取法、大孔树脂法，
从产业化的可行性及制备成本考虑，本研究拟利用
大孔树脂来制备积雪草总苷。
2.4.1 大孔树脂型号考察 通过文献调研和前期的
预实验发现苯乙烯型非极性或弱极性的大孔树脂对
积雪草苷类的三萜皂苷吸附分离效果显著，因此本
课题选用价格低廉的生产中比较常用的 3 种苯乙烯
型大孔树脂 HPD-100、D-101、AB-8 进行考察[17]。
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 4 期 2014 年 2 月 ·506·
取酸沉后的积雪草水溶液，平行 3 份，按照生
药材-湿树脂 2∶1 的比例，分别加于已处理好的
HPD-100、D-101、AB-8 大孔树脂柱上（径高比为
1∶10），以 0.5 BV/h 的体积流量过树脂柱，依次用
5 个柱体积（BV）的水、2 BV 的 40%乙醇、5 BV
的 70%乙醇以 1 BV/h 的体积流量洗脱，收集 40%、
70%乙醇洗脱液；回收乙醇，真空干燥，得干膏，
按“2.1”项下方法测定积雪草总苷的量，结果见表
1。实验结果表明，HPD-100 大孔树脂在相同的洗
脱条件下对积雪草总苷的洗脱能力远比 D-101、AB-
8 大孔树脂强，因此选择 HPD-100 大孔树脂对积雪
草总苷进行精制。

表 1 不同型号大孔树脂对积雪草苷量的影响
Table 1 Effects of different kinds of macroporous resins on contents of asiaticosides
树脂型号 样品名称 洗脱液体积 / mL 得膏量 / mg 积雪草总苷 / mg
D-101 40%乙醇洗脱液 157 440.23 20.46
70%乙醇洗脱液 416 304.51 172.13
HPD-100 40%乙醇洗脱液 154 418.26 15.23
70%乙醇洗脱液 402 329.64 303.93
AB-8 40%乙醇洗脱液 190 422.56 13.47
70%乙醇洗脱液 498 341.63 169.82

2.4.2 洗脱液乙醇体积分数的考察 取酸沉后的积
雪草水溶液，平行 9 份，按照生药材-湿树脂 2∶1
的比例分别加于已处理好的 HPD-100 大孔树脂柱
上（径高比为 1∶10），以 0.5 BV/h 的体积流量过树
脂柱，用 5 BV 的水洗涤树脂柱，再分别用 10%、
20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、95%
乙醇以 1 BV/h 的体积流量洗脱，收集 8 BV 的乙醇
洗脱液，回收乙醇，真空干燥，残渣用甲醇溶解并
转移至 5 mL 量瓶中，摇匀，滤过，按“2.1”项下
方法测定积雪草总苷的量，结果见表 2。实验结果
表明，10%、20%乙醇洗脱物中均未检出积雪草苷、
羟基积雪草苷、积雪草苷 B；30%乙醇洗脱物中总
苷的量小于 8 mg，因此选择 30%乙醇作为树脂洗脱
除杂的条件；50%、60%乙醇洗脱物中积雪草苷、
羟基积雪草苷的总量较其他洗脱物高，且 50%、60%
乙醇洗脱物中积雪草苷、羟基积雪草苷的总量相差
不大，考虑生产成本，确定采用 50%乙醇洗脱，收
集 50%乙醇洗脱液。
2.4.3 50%乙醇洗脱用量的考察 取酸沉后的积雪
草水溶液，按照生药材-湿树脂 2∶1 的比例，分别
加于已处理好的 HPD-100 大孔树脂柱上（径高比为
1∶10），以 0.5 BV/h 的体积流量洗脱，依次用 5 BV
水、4 BV 30%乙醇以 1 BV/h 的体积流量洗涤树脂
柱除杂，再用 50%乙醇以 1 BV/h 的体积流量洗脱，
分别收集每个床层体积的洗脱液，共收集 10 BV。
洗脱液回收乙醇，干燥，残渣用甲醇溶解并定容至
10 mL，摇匀，滤过，按“2.1”项下方法测定积雪
表 2 不同体积分数的乙醇洗脱对积雪草总苷量的影响
Table 2 Effects of different concentration of ethanol
on contents of asiaticosides
洗脱液 积雪草苷 / mg
羟基积雪
草苷 / mg
积雪草苷
B / mg
积雪草总
苷 / mg
10%乙醇 － － － －
20%乙醇 － － － －
30%乙醇 1.98 3.21 2.51 7.70
40%乙醇 17.75 21.39 16.98 56.12
50%乙醇 27.37 36.76 25.47 89.60
60%乙醇 27.27 36.90 25.71 89.88
70%乙醇 19.36 26.92 17.50 63.78
80%乙醇 16.91 26.87 14.08 57.86
95%乙醇 14.23 26.86 11.92 53.02

草总苷的量，结果见表 3。实验结果表明，50%乙
醇第 1～4个BV的洗脱液中积雪草总苷的量逐渐上
升，4 倍量时达到最高值，8 倍量时总苷得率已达到
81.7%，而在第 8 个 BV 后，总苷的量已经明显降低。
因此确定 50%乙醇洗脱较佳体积为 8 BV，即上样
后，依次用 5 BV 水、4 BV 30%乙醇以 1 BV/h 的体
积流量洗涤树脂柱除杂，再用 50%乙醇以 1 BV/h
的体积流量洗脱，收集 8 BV 的 50%乙醇洗脱液。
2.5 精制方法考察
通过大孔树脂富集后积雪草总苷的质量分数可
达到 60%～65%，为了制备高纯度积雪草总苷（质
量分数≥90%），必须对积雪草总苷做进一步的纯
化。通过文献调研[18]，纯化积雪草总苷应用较多的
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 4 期 2014 年 2 月 ·507·
表 3 不同用量 50%乙醇对积雪草总苷量的影响
Table 3 Effects of different volumes of 50% ethanol on contents of asiaticosides
洗脱液 / BV 积雪草苷 / mg 羟基积雪草苷 / mg 积雪草苷B /mg 积雪草总苷 / mg 得率 / % 总得率 / %
1 1.72 2.10 1.84 5.66 2.5 2.5
2 3.57 4.47 3.52 11.56 5.2 7.7
3 8.75 10.88 7.94 27.57 12.4 20.1
4 16.47 21.56 16.97 55.00 24.7 44.8
5 13.97 15.88 12.31 42.16 19.0 63.8
6 7.24 8.15 7.02 22.41 10.1 73.9
7 4.15 4.06 4.22 12.43 5.6 79.5
8 1.76 1.60 1.58 4.94 2.2 81.7
9 0.94 1.06 1.10 3.10 1.3 83.0
10 0.65 0.66 0.58 1.89 0.1 83.1

为溶剂提取法和结晶法。分别考察了水饱和正丁醇
萃取、醋酸乙酯结晶、丙酮结晶法对积雪草总苷纯
化的效果。
取积雪草总苷粗品粉末 100 mg，精密称定，平
行 3 份。其中 1 份加 10 mL 水溶解，滤过，用氯仿
振摇提取 2 次，每次 10 mL，弃去氯仿液；水液用
水饱和的正丁醇振摇提取 4 次（20、20、10、10 mL），
合并正丁醇液。正丁醇液蒸干，残渣用甲醇溶解并
转移至 5 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，
取续滤液。另外 2 份加 10 mL 甲醇溶解，滤过，分
别加入 8 倍量的醋酸乙酯、丙酮至析出白色结晶，
边加边搅拌，冷藏 1 h，抽滤，分别用少量醋酸乙酯、
丙酮洗涤结晶，真空干燥。分别取结晶物 10 mg，
精密称定，置 5 mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀释至
刻度，摇匀，滤过，取续滤液。按“2.1”项下方法
测定积雪草总苷的量，结果见表 4。实验结果表明，
正丁醇萃取积雪草总苷的质量分数为 95.40%，醋酸
乙酯结晶积雪草总苷的质量分数为 93.02%，丙酮结
晶为 79.29%，纯化效果依次为正丁醇萃取＞醋酸乙
酯结晶＞丙酮结晶。从产业化的可行性、制备成本
等方面综合考虑，确定醋酸乙酯结晶法为较佳的纯
化方法。
表 4 不同纯化方法对积雪草总苷量的影响
Table 4 Effects of different methods of purification on contents of asiaticosides
纯化方法 称样量 / mg 积雪草苷 / mg 羟基积雪草苷 / mg 积雪草苷 B / mg 积雪草总苷 / %
丙酮结晶 13.11 3.47 3.74 3.18 79.29
醋酸乙酯结晶 13.90 4.36 4.59 3.98 93.02
正丁醇萃取 11.01 3.46 3.81 3.23 95.40

2.6 验证试验
综合以上研究结果，得出高纯度积雪草总苷的
最佳提取工艺：积雪草药材加 75%乙醇回流提取 2
次，每次 10 倍量提取 1 h，滤过，合并滤液；滤液
减压回收乙醇，浓缩至相当于生药材 1 g/mL，冷却
至室温；加 4 倍量水，边加边搅拌，4 ℃冷藏过夜；
离心，取上清液，用 2 mol/L 的盐酸调节 pH 值至
2.0，4 ℃冷藏过夜；离心，取上清液；按生药材-
湿树脂 2∶1 的比例加于已处理好的 HPD-100 大孔
树脂柱上（径高比为 1∶10），提取物水溶液以 0.5
BV/h 的体积流量过树脂柱，先用 5 BV 水洗涤树脂
柱，再用 4 BV 30%乙醇以 1 BV/h 的体积流量洗涤
树脂柱，最后用 50%乙醇以 1 BV/h 的体积流量洗
脱，收集 8 BV 50%乙醇洗脱液；洗脱液减压回收乙
醇至无醇味，干燥，粉碎；用适量甲醇溶解，滤过，
加入 8 BV 醋酸乙酯，4 ℃冷藏 1 h，滤过，以少量
醋酸乙酯洗涤结晶物，真空干燥，粉碎，即得。按
上述优选的制备工艺条件进行验证，所得结果见表
5。3 批验证试验结果表明，积雪草总苷的制备工艺
稳定性良好、可重复性强，工艺合理、可行。
积雪草总苷是积雪草中主要的活性成分，本实
验通过系统的提取、精制、分离、纯化研究，建立
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 4 期 2014 年 2 月 ·508·
表 5 验证试验结果
Table 5 Results of verification test
质量分数 / % 批号 投料量 / g
积雪草苷 B 羟基积雪草苷 积雪草苷 积雪草总苷
积雪草总苷 / g 总苷转移率 / %
20080914 1 000 27.45 37.42 26.12 90.99 8.4 83.7
20080920 1 003 28.77 39.36 26.94 95.07 8.2 81.9
20080926 1 001 28.43 38.70 26.90 94.03 7.9 78.9

了高纯度积雪草总苷的制备工艺，可使积雪草总皂
苷的质量分数到达 90%以上，其中羟基积雪草苷的
质量分数高于 35%、积雪草苷和积雪草苷 B 的质量
分数均高于 25%。该工艺使用有机溶剂少且均可回
收再利用，工艺的稳定性、重复性良好，有望进一
步开发应用于工业化大生产。
3 讨论
在工艺研究预试验中，本课题对不同产地、不
同采集时间的药材进行了对比分析，研究表明秋季
采收药材较佳，可以避免药材中过多的叶绿素影响
分离效果。
在水沉、酸沉考察研究中发现，酸沉、水沉顺
序对实验结果存在不同的影响，研究结果表明，先
酸沉后水沉，其效果优于先水沉再酸沉。
根据预实验结果，结合文献报道，本课题将大
孔树脂上样量定为生药材-湿树脂 2∶1 的比例，但
在实际的生产中，应尽可能提高树脂柱的径高比，
且应着重考察树脂量与药材上样量的比例关系，以
提高树脂的利用率。
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