全 文 ：·药理与临床·
甘草黄酮对肺部炎症小鼠细胞因子表达和氧化反应的调节作用
管 　燕1 ,2 ,谢强敏2 3
(11 浙江大学医学院附属邵逸夫医院 ,浙江 杭州 　310016 ; 21 浙江大学 国家食品药品监督管理局
浙江呼吸药物研究实验室 ,浙江 杭州 　310058)
摘 　要 :目的 　研究甘草黄酮对抗内毒素脂多糖 (L PS) 诱导小鼠肺部炎症的作用机制。方法 　小鼠气管内滴入
L PS 或生理盐水 ,6 或 24 h 后取支气管肺泡灌洗液 (BAL F) 和肺组织 ,测定 BAL F 中的白细胞总数和中性粒细胞
以及超氧化物歧化酶 (SOD) 活性 ,测定肺组织的含水量和病理变化 ,测定肺组织匀浆和 BAL F 中的髓过氧化物酶
(MPO) 活性、肿瘤坏死因子2α ( TNF2α) 和白细胞介素21β ( IL21β) 的 mRNA 表达以及 TN F2α蛋白水平。结果 　
白细胞计数、肺含水量测定和肺组织病理检查等指标显示 ,小鼠气管内滴入 L PS 引起严重的肺部炎症。甘草黄酮
给药后能预防 L PS 引起的这些变化。甘草黄酮能明显减少 BAL F 中的总白细胞和中性粒细胞的数目 ,升高 SOD
活性。甘草黄酮能明显降低肺组织中的 MPO 活性 ,抑制 TN F2α和 IL21βmRNA 的表达 ,抑制 TN F2α蛋白水平。
结论 　甘草黄酮能改善 L PS 引起的小鼠肺部炎症 ,其抗炎作用可能与抑制细胞因子的表达和调节氧化/ 抗氧化反
应有关。
关键词 :甘草黄酮 ; 抗炎 ; 抗氧化 ; 脂多糖 ; 肺损伤 ; 细胞因子
中图分类号 :R28614 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 0821254206
Regulation of l icorice flavonoids on cytokines mRNA expression and oxidation reaction
in mice with lung inflammation
GUAN Yan1 ,2 , XIE Qiang2min2
(11 Affiliated Sir Run Run Shaw Hospital of Medical College , Zhejiang University , Hangzhou 310016 , China ; 2. Zhejiang
Respiratory Drugs Research Laboratory of SFDA China , Zhejiang University , Hangzhou 310058 , China)
Abstract : Objective 　To st udy t he mechanism of anti2inflammatory effect s of licorice flavonoids (L F)
isolated f rom the root s of Gl ycy rrhi z a uralensis (licorice) on lipopolysaccharide (L PS)2induced lung in2
flammation in mice. Methods 　Mice were int rat racheally instillated wit h eit her L PS (4 mg/ kg) or saline.
At 6 or 24 h af ter L PS int rat racheal instillation , pathological examination and bronchoalveolar lavage were
performed and the lung wet/ dry weight ratio as an index of acute lung injury was assessed. Then , the
numbers of total leukocytes , neut rop hils and t he activity of superoxide dismutase (SOD) and TN F2αpro2
tein in bronchoalveolar lavage fluid (BAL F) were measured. L PS2induced myeloporoxidase (MPO) activi2
ty and expressions of TN F2αand IL21βat t he mRNA levels and TN F2α at t he p rotein level in lung tissues
were determined by R T2PCR and EL ISA. Results 　L PS caused a severe lung inflammation , as indicated by
the pat hological findings and t he lung wet/ dry weight ratio . However , oral L F could at tenuate t hese L PS2
induced abnormalities. L F could decrease t he numbers of total leukocyte cells and neut rop hils , and in2
crease t he levels of SOD and TN F2αBAL F. In addition , L F significantly suppressed t he MPO activity ,
TN F2αand IL21βmRNA expression levels , and TN F2αprotein level in t he lung tissues. Conclusion 　Inhi2
bition of inflammatory cytokines expressions and regulation of oxidation/ antioxidation of L F may be it s
anti2inflammatory mechanism in L PS2induced lung inflammation in mice.
Key words : licorice flavonoids (L F) ; anti2inflammation ; antioxidation ; lipopolysaccharide (L PS) ;
lung injury ; cytokine
　　甘草 Gl ycy rrhi z a uralensis Fisch. 系豆科多 年生草本植物 ,主要含有甘草酸、甘草次酸、黄酮、生
·4521· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 8 期 2009 年 8 月
3 收稿日期 :2009201211　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (30671919 ,30772581) ; 浙江省科技厅重点科研项目 (2006C23009)
作者简介 :管　燕 (1973 —) ,女 ,浙江大学药学院药学专业硕士生 ,主管药师 ,研究方向为呼吸药理学和抗炎免疫药理学。3 通讯作者　谢强敏　Tel/ Fax : (0571) 88208231 　E2mail : xieqm @zju. edu. cn
物碱和氨基酸等成分。甘草黄酮具有广泛的药理活
性 ,包括抗氧化、抗肿瘤、抗 H IV、抗溃疡、保肝等作
用[ 1 ] 。前期的研究表明甘草黄酮对辣椒素引起的豚
鼠咳嗽反射有很强的抑制作用[2 ] ,推测其镇咳作用
机制与抗炎效应有关。甘草黄酮对肺部炎症的实验
研究至今未见报道 , 本研究采用内毒素脂多糖
(L PS) 诱导的小鼠肺部炎症模型探讨甘草黄酮的
抗炎作用 ,并初步研究其抗炎作用机制。
1 　材料与方法
111 　动物 :健康 ICR 小鼠 ,雌雄各半 ,体质量 22～
25 g ,由浙江省实验动物中心提供 ,合格证号 :20032
0001。所有的操作和实验流程均遵守《实验动物管
理条例》,动物在实验过程中自由进食和进水。
112 　主要试剂和设备 :甘草黄酮由浙江大学国家食
品药品监督管理局浙江呼吸药物研究实验室提
取[ 2 ] ,经 HPL C 测定主要成分为甘草黄酮 ,含总黄
酮 50 % 以上。L PS ( Esherichia coli O127 : B8 ,
Sigma 公司 ,批号 056k5602) ;地塞米松磷酸钠注射
液 (湖北天药药业股份有限公司 ,批号 20070810) ;
髓过氧化物酶 ( MPO) 和超氧化物岐化酶 ( SOD)
均购自南京建成生物工程研究所 ;Oligod ( T) 18 ,核
糖核酸分解酶抑制剂 ,逆转录酶 M2ML V ,5′2逆转
录酶 M2ML V 缓冲液 , dN TP Mixt ure , Taq , 100
bp DNA marker 均购于 Takara 公司 ;肿瘤坏因子2
α( TN F2α) 和白细胞介素21β ( IL21β) 以及β2actin
PCR 引物购于上海生物工程有限公司 ; Trizol 试剂
购于 Sigma 公司 ;琼脂糖 ,Biowest A GA ROSE ;聚
山梨酯 20 ,AMRESLO ;溴化乙锭 ( EB) ,上海华美
公司 ;小鼠 TN F2α EL ISA 试剂盒 ( E025809 ,eBio2
science) ;其余试剂 ,国产分析级。冰冻离心机 ( Ep2
pendorf ,德国) ;低温超速离心机 (Beckman ,美国) ;
Elx800 酶标仪 (Bio2Tek Inst rument INC ,美国) ;
PCR 仪 ( Eppendorf , 德国 ) ; 显微镜 ( Olymp us
BX51 ,日本) ;核酸紫外分析仪 ( Eppendorf ,德国) ;
凝胶成像系统 ( UV P Company Limited ,英国) ;水
平电泳仪 (CL P ,美国) 。
113 　实验设计 :将实验动物随机分为 6 组 ,即对照
组、模型组 (L PS) 、甘草黄酮 (3、10、30 mg/ kg) 组
和地塞米松 (1 mg/ kg) 组。小鼠乙醚麻醉后 ,将
L PS 直接气管内滴入 (4 mg/ kg ,20μL/ 10 g) ,对照
组滴入相同容积的生理盐水 ,甘草黄酮组和地塞米
松组分别于造模前 ig 给药 5 次 (间隔 6 h) 和造模
后给药 2 次 (间隔 8 h) ,共 7 次。对照组给予相同
容积的生理盐水。以上设计共使用了 2 批动物 ,一
批用于造模后 24 h 的肺含水量与肺组织学检查 ,另
一批用于造模 24 h 的支气管泡灌洗液 (BAL F) 中
的白细胞总数计数、分类计数 ,MPO 及 SOD 活性 ,
TN F2α mRNA 和 IL21β mRNA 表达的测定。此
外 ,还另设一批动物用于造模 6 h 后的 TN F2α
mRNA、IL21βmRNA 和 TN F2α蛋白水平表达的测
定。造模 6 h 后的小鼠 ,甘草黄酮组和地塞米松组
分别于造模前 ig 给药 5 次 (间隔 6 h) ,造模后不再
给药。
114 　肺水含量与肺组织学检查 :造模 24 h 后将小
鼠麻醉 ,股动脉放血处死 ,暴露气管 ,结扎左肺 ,用
10 % 中性福尔马林固定 , H E 染色后进行肺组织学
检查 ;取右肺称质量 (湿质量) ,置 60 ℃烘箱 48 h
后称干质量 ,计算肺含水量 [肺含水量 = (湿质量 -
干质量) / 湿质量 ×100 %]。
115 　BAL F 中白细胞计数和分类计数 :造模 24 h
将小鼠麻醉 ,股动脉放血处死 ,打开胸腔 ,暴露气管 ,
行气管插管 ,结扎右肺 ,左肺用 PBS 液 115 mL 分 3
次进行支气管肺泡灌洗 ,收集灌洗液 ,4 ℃、1 500 r/
min 离心 10 min ,取细胞沉淀涂片 ,Wright 染色 ,细
胞分类计数 ;上清液储存于 - 80 ℃备用。右肺取
下后置液氮罐备用。实验时肺组织制成 10 % 组织
匀浆 ,4 ℃,10 000 r/ min 离心 15 min ,分装吸取上
清 , - 80 ℃冰箱保存备用。
116 　MPO 和 SOD 活性测定 :取 - 80 ℃保存的
BAL F 上清 ,测定 SOD 的活性 ,取 - 80 ℃保存的
10 % 右肺组织匀浆上清测定 MPO 活性。BAL F 上
清和右肺组织匀浆上清在 4 ℃、10 000 r/ min 离心 15
min ,取其上清液 ,用试剂盒测定 MPO 和 SOD 的活
性 ,测定方法参照试剂盒生产商提供的使用说明书。
117 　细胞因子 mRNA 表达的测定 :造模 6 h 或
24 h 后将小鼠麻醉 ,股动脉放血处死 ,暴露肺 ,取肺
组织置液氮罐备用。实验时肺组织制成 10 % 组织
匀浆 ,4 ℃、10 000 r/ min 离心 15 min ,分装吸取的
上清置 - 80 ℃冰箱保存备用。采用半定量 R T2
PCR 技术检测。TN F2α和 IL21β引物序列见表 1。
表 1 　TNF2α, IL21β和β2actin 引物序列
Table 1 　Primer sequences of TNF2α, IL21β, andβ2actin
细胞因子 引物序列 (5′23′) 产物长度/ bp
TNF2α 正向 :A GCCGA TGGGTT GTA 266
(NM 013693) 反向 :ACTT GGGCA GA T TGA
IL21β 正向 : GCTTCA GGCA GGCA GTA T 475
(NM 008361) 反向 :ACAAACCGCT TT TCCA TCT
β2actin 正向 :CT GCCCT GTA T GCCTCTG 218
(NM 007393) 反向 :A T GTCACGCACGA T TTCC
·5521·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 8 期 2009 年 8 月
11711 　肺组织总 RNA 抽提 :按照 Trizol 说明书操
作提取 cDNA。取 100 mg 肺组织加 1 mL Trizol
于冰浴下制作匀浆 ,经氯仿处理 ,异丙醇沉淀 ,75 %
乙醇洗涤后 ,略干燥 ,溶于 DEPC 100μL 处理水。
经核酸紫外分析仪检测 ,根据 A 260 / A 280 值 ,确定样
品中 RNA 纯度和含量。
11712 　逆转录步骤 :应用 M2ML V 逆转录酶 , 20
μL 反应体系。置 PCR 仪中 42 ℃反应 60 min ,
72 ℃变性 10 min。
11713 　PCR 条件 : TN F2α和 IL21β (按以下 35 循
环) :94 ℃、3 min ,94 ℃、45 s ,5118 ℃、45 s ,72 ℃、
45 s ,72 ℃、5 min ;β2actin (按以下 35 循环) :94 ℃、
3 min ,94 ℃、45 s ,52 ℃、45 s , 72 ℃、45 s、72 ℃
5 min。PCR 产物检测采用 115 % 琼脂糖凝胶电泳 ,
以β2actin 为阳性对照 ,经凝胶成像分析系统成像、
条带密度扫描 ,以目的条带与参比基因条带积分吸
光度的比值进行半定量分析。
118 　TN F2α蛋白水平的测定 :造模 6 h 后将小鼠
麻醉 ,股动脉放血处死 ,打开胸腔 ,暴露气管行气管
插管 ,结扎右肺 ,左肺用 PBS 液 115 mL 分 3 次进
行支气管肺泡灌洗 ,收集灌洗液 ,4 ℃、1 500 r/ min
离心 10 min ,上清液 ,储存于 - 80 ℃备用。右肺取
下后置液氮罐备用。实验时肺组织制成 10 % 的组
织匀浆 ,4 ℃、10 000 r/ min 离心 15 min ,分装吸取
的上清置 - 80 ℃冰箱保存备用。取 BAL F 灌洗
液和 10 % 肺组织匀浆测定 ;采用酶联免疫吸附法
测定各组小鼠 BAL F 和肺组织匀浆中的 TN F2α蛋
白水平。测定步骤按照试剂盒说明书。
119 　统计学处理 :实验数据以 x ±s 表示 ,采用
Sigma Stat 3. 0 统计 ,方法采用 St udent2Newman2
Keuls 检验。
2 　结果
211 　对肺含水量的影响 : 对照组肺含水量为
(32195 ±3127) % ( n = 8 ) , 模型组为 ( 39148 ±
2106) % ( n = 8) ,与对照组比较显著升高 ( P <
0101) ;甘草黄酮 3 mg/ kg 组为 (36125 ±2174) %
( n = 8) ,与模型组比较显著降低 ( P < 0105) ;甘草
黄酮 10 mg/ kg 组为 (36177 ±1183) % ( P < 0105 ,
n = 8) ; 30 mg/ kg 组为 ( 35106 ±4161) % ( P <
0105 , n = 8 ) ; 地塞米松 1 mg/ kg 为 ( 33147 ±
4151) % ( P < 0101 , n = 8) 。结果表明药物可以改
善炎症引起的肺水肿程度。
212 　对肺组织病理改变的影响 :气道内滴入 L PS
24 h 后 ,模型组小鼠气管周围和肺组织间隙可见大
量中性粒细胞浸润和红细胞渗出 ,肺泡间隙结构增
宽 ,有透明膜存在 ,水肿现象明显。甘草黄酮 10、30
mg/ kg 和地塞米松 1 mg/ kg 能明显改善这些病理
变化 ,甘草黄酮 1 mg/ kg 作用不明显 ,结果见图 1。
图 1 　甘草黄酮对 LPS 诱导肺部炎症小鼠肺组织病理改变的影响 ( HE 染色)
Fig. 1 　Effects of LF on pathological changes of lung tissues in mice with lung inflammation induced by LPS ( HE stain)
213 　对 BAL F 中白细胞总数和中性粒细胞数的影
响 :小鼠气道内滴入 L PS 24 h 后 ,模型组 BAL F 中
的白细胞总数、中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞数
目显著上升 ,白细胞总数、中性粒细胞与对照组比较
分别增加了 816 倍和 515 倍 ( P < 0101) 。与模型
组比较 ,甘草黄酮 3、10、30 mg/ kg 组和地塞米松 1
mg/ kg 组均能显著抑制 BAL F 中的白细胞总数、中
性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞数目的增加 ,结果见
表 2。
214 　对 BAL F 中 MPO 和 SOD 活性的影响 :小鼠
气道内滴入 L PS 24 h 后 ,模型组 BAL F 中的 SOD
活性明显下降 ,肺组织中的 MPO 活性明显升高
( P < 0105) 。与模型组比较 ,甘草黄酮 3、10、30 mg/ kg 组和地塞米松 1 mg/ kg 组均能显著提高BAL F 中的 SOD 活性 ,显著减少肺组织中 MPO 活性 ,结果见表 3。215 　对肺组织匀浆中 TN F2α mRNA 和 IL21βmRNA 表达的影响 :小鼠气道内滴入 L PS 6 h 或24 h 后取肺组织 ,匀浆后测定 TN F2α mRNA 和IL21βmRNA 表达。结果见图 2 和表 4。滴入 L PS6 h 后小鼠肺组织中 TN F2α mRNA 和 IL21βmRNA 水平高于造模后 24 h 肺组织中的表达水平。滴入 L PS 6 h 的 TN F2αmRNA 与对照组比较明显升高 ( P < 0101) ,24 h 的 TN F2α mRNA 与对照组比较无明显差异 ( P > 0105) 。滴入 L PS 6 h 或24 h的 IL21βmRNA表达与对照组比较均明显升
·6521· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 8 期 2009 年 8 月
表 2 　甘草黄酮对 LPS 诱导肺部炎症小鼠 BALF 中
炎症细胞聚集的影响 ( x ±s , n = 12)
Table 2 　Effects of LF on inflammatory cell accumulation
in BALF of mice with lung inflammation
induced by LPS ( x ±s , n = 12)
组别
剂量/
(mg·kg - 1 )
白细胞总数/
(1 ×108 ·L - 1 )
中性粒细胞/
(1 ×108 ·L - 1 )
淋巴细胞/
(1 ×108 ·L - 1 )
巨噬细胞/
(1 ×108 ·L - 1 )
对照 - 2108 ±0164 0132 ±0164 1106 ±0121 0170 ±0161
模型 - 22104 ±3110 # # # 16183 ±1199 # # # 4119 ±2117 # # 1102 ±0157 # #
甘草黄酮 3 5194 ±2184 3 3 3 2103 ±0173 3 3 3 3135 ±2198 0156 ±0107 3 3
10 5138 ±2160 3 3 3 2175 ±1174 3 3 3 2134 ±1109 3 0129 ±0119 3 3
30 3161 ±2108 3 3 3 0152 ±0158 3 3 3 2182 ±0199 3 0127 ±0111 3 3
地塞米松 1 4113 ±2167 3 3 3 1100 ±1101 3 3 3 2163 ±1153 3 0145 ±0146 3
　　与对照组比较 : # # P < 0101 　# # # P < 01 001
　　与模型组比较 : 3 P < 01 05 　3 3 P < 01 01 　3 3 3 P < 01001
　　# # P < 01 01 　# # # P < 01001 vs cont rol group
　　3 P < 0105 　3 3 P < 01 01 　3 3 3 P < 01001 vs model group
表 3 　甘草黄酮对 LPS 诱导肺部炎症小鼠 BALF 中 SOD
活性和肺组织中 MPO 活性的影响 ( x ±s)
Table 3 　Effects of LF on SOD activity in BALF and MPO
activity in lung tissue of mice with lung
inflammation induced by LPS ( x ±s)
组别
剂量/
(mg ·kg - 1)
动物/
只
SOD/
(U ·mL - 1)
MPO/
(U ·g - 1)
对照 - 8 3147 ±01 39 01 89 ±0113
模型 - 8 2141 ±01 70 # 11 30 ±0130 # # #
甘草黄酮 3 8 3188 ±01 56 3 3 01 95 ±0110 3 3
10 8 3177 ±01 27 3 3 01 77 ±0133 3 3 3
30 7 3180 ±01 23 3 3 01 63 ±0111 3 3 3
地塞米松 1 7 3143 ±01 51 3 3 01 74 ±0110 3 3 3
　　与对照组比较 : # P < 01 05 　# # # P < 01001
　　与模型组比较 : 3 3 P < 0101 　3 3 3 P < 01 001
　　# P < 0105 　# # # P < 01 001 vs cont rol group
　　3 3 P < 01 01 　3 3 3 P < 01001 vs model group
图 2 　甘草黄酮对 LPS 诱导肺部炎症小鼠肺组织 TNF2α
mRNA 和 IL21βmRNA 表达的影响 (造模后 6 h)
Fig. 2 　Effects of LF on expressions of TNF2αand IL21β
in lung tissue of mice with lung inflammation
induced by LPS ( 6 h after model was made)
高 ( P < 0105) 。甘草黄酮 30 mg/ kg 能明显抑制滴
入 L PS 6 h 或 24 h 的 IL21β mRNA 表达 ( P <
0105) ,也能明显抑制滴入 L PS 6 h 的 TN F2α mR2
NA 表达 ( P < 0101) ,但对 24 h 的 TN F2α mRNA
表达无作用。地塞米松 1 mg/ kg 仅对 6 h 的 TN F2
αmRNA 和 IL21β mRNA 表达有明显作用 ( P <
0105) ,对 24 h 的两个细胞因子表达均无作用。
216 　对 L PS 气管内滴入 6 h 后的肺组织和 BAL F
中 TNA2α水平抑制作用 :滴入 L PS 6 h 后 BAL F
和肺组织中的 TN F2α蛋白水平与对照组比较有明
显升高 ( P < 01001) 。甘草黄酮 10、30 mg/ kg 明显
抑制 TN F2α蛋白水平的升高 ,地塞米松 1 mg/ kg
也有明显抑制作用 ,结果见表 5。
表 4 　甘草黄酮对 LPS 诱导肺部炎症小鼠肺组织 TNF2α
和 IL21βmRNA 表达影响的半定量分析
( x ±s , n = 5 或 6)
Table 4 　Effects of LF on mRNA expressions of TNF2αand
IL21β in lung tissue of mice with lung inflammation
induced by LPS ( x ±s , n = 5 or 6)
组别
剂量/
(mg ·kg - 1 )
TNF2α/β2actin
6 h 　　 24 h
IL21β/β2actin
6 h 24 h
对照 - 0116 ±0105 0115 ±0103 0140 ±0119 0136 ±0120
模型 - 0131 ±0102 # # 0124 ±0103 0178 ±0128 # 0154 ±0121 # #
甘草黄酮 10 0139 ±0110 0124 ±0108 0179 ±0115 0160 ±0116
30 0124 ±0104 3 3 0123 ±0103 0145 ±0106 3 0130 ±0108 3
地塞米松 1 0124 ±0105 3 0128 ±0104 0157 ±0119 3 0156 ±0118
　　与对照组比较 : # P < 01 05 　# # P < 0101
　　与模型组比较 : 3 P < 01 05 　3 3 P < 0101
　　# P < 01 05 　# # P < 01 01 vs cont rol group
　　3 P < 01 05 　3 3 P < 01 01 vs model group
表 5 　甘草黄酮造模 6 h 后小鼠肺组织和 BALF 中
TNF2α水平的影响 ( x ±s)
Table 5 　Effects of LF on TNF2α level in lung tissue or
BALF in mice induced by LPS after 6 h ( x ±s)
组别
剂量/
(mg ·kg - 1 )
动物/
只
TNF2α
肺组织/ (pg ·mg - 1 ) BAL F/ (pg ·mL - 1 )
对照 - 7 31628 8 ±01270 4 13102 ±　2156
模型 - 8 141617 1 ±21377 5 # # # 405192 ± 43175 # # #
甘草黄酮 10 7 71630 4 ±41255 2 3 3 251147 ±121143 3 3
30 8 61761 1 ±312531 3 3 249150 ± 82191 3 3 3
地塞米松 1 7 61903 4 ±21339 3 3 3 198181 ± 76169 3 3 3
　　与对照组比较 : # # # P < 01 001
　　与模型组比较 : 3 3 P < 0101 　3 3 3 P < 01 001
　　# # # P < 01001 vs cont rol group
　　3 3 P < 01 01 　3 3 3 P < 01001 vs model group
3 　讨论
　　小鼠气管内直接滴入 L PS 可诱导免疫细胞介
导的炎症反应 ,引起一系列的前炎因子释放 ,最终导
·7521·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 8 期 2009 年 8 月
致肺部急性炎症反应[ 3 ] 。本研究应用 L PS 气管内
直接滴入法诱导小鼠肺部炎症反应 ,结果显示滴入
L PS (4 mg/ kg) 24 h 后 BAL F 中的白细胞总数和
中性粒细胞数目明显增加 ;肺水肿明显 ,表现为含水
量增加 ,病理检查肺组织间隙水肿现象明显 ;BAL F
中的 SOD 活性下降 ,肺组织中的 MPO 活性增高 ,
IL21βmRNA 表达水平上升 ,但 TN F2α mRNA 表
达变化不明显。相反 ,L PS 滴入 6 h 后 BAL F 中的
白细胞总数和中性粒细胞数目和肺干/ 湿质量指数
变化不明显 (数据未列出) ,而 TN F2α mRNA 和蛋
白表达则明显增高。提示在 L PS 气道内滴入后首
先诱导 TN F2α上升 ,这与 Remick 等报道[4 ] 的结果
一致。有些报道显示 L PS 气道内滴入后或静脉注
射后诱导 TN F2α快速上升 ,肺灌洗液或血液中的
TN F2αmRNA 表达在 015～2 h 达到高峰[ 5 ] 。L PS
首先激活单核吞噬细胞 ,导致不同的细胞因子和趋
化因子释放 ,其中包括 TN F2α, TN F2α在 L PS 诱导
的炎症反应起着重要的作用 ,可诱导中性粒细胞黏
着于内皮细胞 ,促进中性粒细胞的移动和渗入肺组
织 ,而中性粒细胞活化后释放活性氧代谢产物和蛋
白酶 ,损害靶细胞和靶器官[6 ] 。IL21β晚于 TN F2α
表达和释放。IL21β与 TN F2α一样 ,也是急性肺损
伤病理过程中的一个主要前炎因子 ,单独应用也可
以诱导急性肺损伤 , IL21β诱导的急性肺损伤主要
表现为血管渗透性的增强和形成肺水肿 ,其诱导机
制与黏附分子αvβ6 整联蛋白 (αvβ6 integrin) 和转
移生长因子2β ( T GF2β) 有关 ,抑制αvβ6 integrin
和/ 或 T GF2β可减轻 IL21β诱导的急性肺损伤[7 ] 。
IL21β受体阻断剂可阻断急性肺损伤病人肺水肿液
体诱导的肺泡上皮细胞的修复作用 ,提示在急性肺
损伤后 IL21β有修复损伤肺泡上皮细胞的作用[8 ] 。
此外 , TN F2α与 IL21β也都能通过刺激 N F2κB 信号
传导途径放大炎症介质对靶细胞的作用。
本研究的结果证明甘草黄酮 3、10、30 mg/ kg
呈剂量依赖性抑制气道内滴入 L PS 诱导炎症细胞
在支气管肺组织中的聚集反应 ,表现为 BAL F 中的
白细胞总数、中性粒细胞和巨噬细胞聚集 ,高剂量的
作用强度与阳性对照药地塞米松 1 mg/ kg 相似 ,表
明甘草黄酮对 L PS 诱导的小鼠肺部急性炎症有很
强的保护作用。地塞米松 10 mg/ kg 单次大剂量气
道内直接滴入给药可显著地抑制内毒素 L PS 诱导
的急性肺部炎症反应[9 ] ,而本实验采用小剂量多次
ig 给药同样取得明显的抗炎作用。甘草黄酮也呈
剂量依赖性抑制 L PS 诱导的肺组织 MPO 活性升
高 ;甘草黄酮 3 mg/ kg 即能非常显著地增加 BAL F
中 SOD 活性 ,剂量增加到 10、30 mg/ kg 并没有继
续增加 SOD 活性 , 没有显示明显的量效关系。
MPO 由中性粒细胞释放 ,有很强的氧化作用 ,氧化
反应也是急性肺损伤病理过程中一个重要环节[10 ] 。
SOD 是抗氧化防御体系中重要的金属酶类 ,能够清
除超氧阴离子 ,保护细胞免疫损伤 ,细胞外 SOD 具
有抗氧化作用[11 ] 。体外研究证明 ,甘草总黄酮对氧
自由基的羟自由基有清除和抑制作用 ,且作用强于
维生素 E 和甘露醇[12 ] 。但整体试验是否有抗氧化
作用未见报道 ,本研究结果表明甘草黄酮能下调
MPO 活性 ,上调 SOD 活性 ,对氧化/ 抗氧化反应有
调节作用。甘草黄酮能明显抑制 TN F2α、IL21β
mRNA 和 TN F2α蛋白表达 ,这与其抑制中性粒细
胞的肺内聚集有密切关系。中性粒细胞在急性肺损
伤中是一个主要效应细胞[ 13 ] ,中性粒细胞释放许多
化学介质和细胞因子以及蛋白酶 ,可增加肺毛细血
管的通透性 ,导致肺水肿。甘草黄酮在抑制 BAL F
和肺组织中的中性粒细胞方面表现出很强的作用 ,
因此 ,在病理组织检查中可见甘草黄酮对炎症细胞
浸润、出血、肺泡结构破坏和水肿现象均有明显的改
善作用。
本研究首次发现甘草黄酮对 L PS 气管内滴入
诱导的肺部炎症反应有明显的保护作用 ,其抗炎作
用可能与抑制肺组织 TN F2α mRNA、IL21β mRNA
和 TN F2α蛋白表达水平 ,调节氧化/ 抗氧化反应
有关。
参考文献 :
[1 ] 　季宇彬 , 姜　薇 , 范玉玲 , 等1 甘草黄酮的研究进展 [J ]1 中
草药 , 2004 , 35 (9) : S52S61
[2 ] 　朱一亮 , 谢强敏 , 陈季强 , 等1 甘草黄酮对辣椒素诱导的豚
鼠咳嗽反射的抑制作用 [J ]1 中草药 , 2006 , 37 (7) : 10482
10511
[3 ] 　Faffe D S , Seidl V R , Changas P S , et al . Respiratory
effect s of lipopolysaccharide2induced inflammatory injury in
mice [J ]1 Eur Res pi r J , 2000 , 15 (1) : 852911
[4 ] 　Remick D G , St rieter R M , Eskandari M K , et al . Role of
tumor necrosis factor2alpha in lipopolysaccharide2induced
pat hologic alterations [J ]1 A m J Pathol , 1990 , 136 (1) : 492
601
[5 ] 　Remick D G , St rieter R M , Lynch J P , et al . I n vivo dynam2
ics of murine tumor necrosis factor2alpha gene expression.
Kinetics of dexamet hasone2induced suppression [J ]1 L ab I n2
vest , 1989 , 60 (6) : 76627711
[6 ] 　Matt hay M A , Zimmerman G A1 Acute lung injury and t he
acute respiratory dist ress syndrome : four decades of inquiry
into pat hogenesis and rational management [J ]1 A m J Res pi r
Cell Mol B iol , 2005 , 33 (4) : 31923271
[7 ] 　Ganter M T , Roux J , Miyazawa B , et al . Interleukin21β
causes acute lung injury viaαvβ5 andαvβ6 integrin2dependent
mechanisms [J ]1 Ci rc Res , 2008 , 102 (7) : 80428121
[8 ] 　Geiser T , Atabai K , Jarreau P H , et al . Pulmonary edema
fluid f rom patient s wit h acute lung injury augment s in vit ro
alveolar epit helial repair by an IL21β dependent mechanism
[J ]1 A m J Res pi r Crit Care Med , 2001 , 163 ( 6 ) : 13842
·8521· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 8 期 2009 年 8 月
13881
[ 9 ] 　Rocksén D , Lilliehook B , Larsson R , et al . Differential anti2
inflammatory and anti2oxidative effect s of dexamet hasone and
N2acetylcysteine in endotoxin2induced lung inflammation [J ]1
Clin Ex p I mmunol , 2000 , 122 (2) : 24922561
[ 10 ] 　Guo R F , Ward P A1 Role of oxidant s in lung injury during
sepsis [J ]1 A ntiox i d Redox S i gnal , 2007 , 9 ( 11 ) : 19912
20021 [ 11 ] 　Salvemini D , Muscoli C , Riley D P , et al . Superoxide dis2mutase mimetics [J ]1 Pulm Pharmacol Ther , 2002 , 15 (5) :43924471[ 12 ] 　吴碧华 , 杨得本 , 龙存国 , 等1 甘草总黄酮的体外抗氧化作用 [J ]1 中国临床康复 , 2004 , 8 (36) : 8262282631[ 13 ] 　Moraes T J , Zurawska J H , Downey G P1 Neut rophil gran2ule content s in t he pat hogenesis of lung injury [J ]1 CurrOpin Hematol , 2006 , 13 (1) : 212271
苦瓜蛋白酶抑制剂对苦瓜降糖多肽活性的保护作用
付中平 ,刘红雨 ,鲁 　岚 ,陈子君 ,周吉燕 ,王富军 3
(上海中医药大学中药研究所 ,上海 　201203)
摘 　要 :目的 　探讨苦瓜蛋白酶抑制剂对苦瓜降糖多肽口服降糖活性的保护作用。方法 　单次 iv 四氧嘧啶 80
mg/ kg 给药建立糖尿病小鼠模型。以降糖多肽 (20、10、5 mg/ kg) iv 给药 ,于 015、2、4、6、8 h 尾静脉取血测定空腹
血糖 ;测定在不同降糖多肽与蛋白酶抑制剂配伍剂量下 ,ig 给药 21 d 后的空腹血糖值 ;以降糖作用显著的配伍比
例 ,ig 给药 7、14、21 d 和停止给药 7 d 后测定血糖。结果 　降糖多肽于 iv 给药 4 h 后 ,高、中、低 3 个剂量均表现出
显著降血糖效应 ( P < 0105、0101) ;降糖多肽与抑制剂 (300 + 300) 、(100 + 100) 、(100 + 50) 、(100 + 25) mg/ kg 4 个
配伍剂量组 ig 给药 21 d 后表现出显著降血糖效应 ,且以后两个剂量组 ig 给药的降血糖作用为更佳 ,停药 7 d 后
给药组血糖值与模型组无显著差异。结论 　苦瓜蛋白酶抑制剂在 ig 给药过程中能够使苦瓜降糖多肽免遭消化系
统的蛋白水解酶破坏而起保护作用 ,维持其降血糖药效 ,该作用与两者间的配伍剂量有关。
关键词 :苦瓜 ; 降糖多肽 ; 蛋白酶抑制剂 ; 糖尿病
中图分类号 :R28515 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 0821259204
Protection of protease inhibitor of Momordica cha ra ntia on activity
of hypoglycemic peptides from M. cha ra ntia
FU Zhong2ping , L IU Hong2yu , L U Lan , CH EN Zi2jun , ZHOU Ji2yan , WAN G Fu2jun
( Institute of Chinese Materia Medica , Shanghai University of Traditional Chinese Medicine , Shanghai 201203 , China)
Abstract : Objective 　To study t he protection of p rotease inhibitor of M omordica charanti a on activity
of hypoglycemic peptides f rom M. charanti a by ig administ ration. Methods 　An experimental diabetic
mouse model was successf ully induced by once iv injection of alloxan at a dose of 80 mg/ kg. Diabetic mice
were administered wit h the hypoglycemic peptides (20 , 10 , and 5 mg/ kg) by iv injection and blood glucose
level was tested at 0. 5 , 2 , 4 , 6 , and 8 h. Different ratio s of hypoglycemic peptides and p rotease inhibitio r
were given to diabetic mice for 21 d and then t he blood glucose level was determined. The blood glucose
level in the drug administ ration group , which showed significant hypoglycemic effect af ter 21 d ig adminis2
t ration , at different time point s of 7 , 14 , and 21 d af ter ig administ ration and 7 d af ter administ ration with2
draw , was measured. Results 　The hypoglycemic peptides showed significant hypoglycemic effect af ter 4 h
iv injection ( P < 0105 and 0. 01) . Four mixt ures of hypoglycemic peptides and inhibitors [ (300 + 300) ,
(100 + 100) , (100 + 50) , and (100 + 25) mg/ kg ] showed significant hypoglycemic effect af ter 21 d ig ad2
minist ration ( P < 0105 and 0. 01) , and t he hypoglycemic effect s of t he last two group s are bet ter . The
blood glucose level had no statistical difference between t he test group and the cont rol group af ter 7 d ad2
minist ration wit hdraw. Conclusion 　The protease inhibitors of M. charanti a could protect t he activity of
the hypoglycemic peptide during ig administ ration , which relates to the ratio of hypoglycemic peptide and
inhibitors.
Key words : M omordica charanti a L . ; hypoglycemic peptide ; p rotease inhibitor ; diabetes
·9521·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 8 期 2009 年 8 月
3 收稿日期 :2008212222　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
基金项目 :国家“十一五”科技攻关资助项目 (2006BAI06A16) ; 上海市科委资助项目 (04DZ19818)
作者简介 :付中平 (1982 —) ,男 ,江西上高县人 ,硕士研究生 ,主要从事生物活性物质分离纯化与性质研究。
Tel : 15950470592 　E2mail : fzping2003 @hot mail . com3 通讯作者　王富军　Tel : (021) 51322515 　E2mail : wfj @shutcm. edu. cn