全 文 ：素在膜中可调节药物的释放速度。
参考文献 :
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高速逆流色谱分离纯化钩吻中钩吻素己和 12甲氧基钩吻碱
沈 　洁 ,苏燕评 ,许 　盈 ,刘 　浩 ,刘 　铭 ,俞昌喜 3
(福建医科大学药学院 药理学系 ,福建 福州 350004)
摘 　要 :目的 　建立高速逆流色谱技术分离纯化钩吻素己和 12甲氧基钩吻碱的方法。方法 　采用高速逆流色谱分
离技术分离纯化钩吻生物碱单体 ,以氯仿2甲醇2011 mol/ L HCl (4 ∶4 ∶2)为溶剂体系 ;高效液相色谱技术分析所提
产物的质量分数 ;核磁共振谱、质谱分析确证单体的化学结构。结果 　从 300 mg 钩吻总碱中经过一次高速逆流色
谱技术分离纯化获得 1914 mg 钩吻素己和 2112 mg 12甲氧基钩吻碱 ,质量分数分别为 9514 %、9816 % ;经过电喷雾
质谱及核磁共振的结构鉴定分析 ,证实分离得到的两种生物碱分别是钩吻素己和 12甲氧基钩吻碱。结论 　高速逆
流色谱技术可高效分离纯化钩吻素己和 12甲氧基钩吻碱 ,为钩吻生物碱的研发提供了制备技术。
关键词 :钩吻 ;钩吻素己 ;12甲氧基钩吻碱 ;高速逆流色谱
中图分类号 :R28412 ;R286102 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 0921392204
Isolation and purif ication of gelsenicine and gelsevirine from Gelsemium elega ns
by high2speed counter2current chromatography
SH EN Jie , SU Yan2ping , XU Ying , L IU Hao , L IU Ming , YU Chang2xi
(Department of Pharmacology , School of Pharmacy , Fujian Medical University , Fuzhou 350004 , China)
Abstract : Objective 　To establish a new technique of high2speed counter2current chromatograp hy
( HSCCC) for isolation and p urification of gelsenicine and gelsevirine1 Methods 　The compounds were iso2
lated and p urified by HSCCC , using chloroform2met hanol2011 mol/ L hydrochloric acid (4 ∶4 ∶2) as t he
two2p hase solvent system1 The p urity of t he compounds was analyzed by H PL C1 The st ruct ures of t he
compounds were confirmed by ESI2MS , 1 H2NMR , and 13 C2NMR1 Results 　Gelsenicine (1914 mg) and
gelsevirine (2112 mg) were successf ully obtained f rom crude ext ract (300 mg) of G1 elegans in one2step
separation , wit h p urities of 9514 % and 9816 % by HPL C , respectively1 The st ruct ures of gelsenicine and
gelsevirine were identified by ESI2MS , 1 H2NMR , and 13 C2NMR1 Conclusion 　These result s indicate t hat
HSCCC is a very powerf ul technique for t he isolation and p urification of gelsenicine and gelsevirine1
Key words : Gelsemi um elegans ( Gardn1 et Champ1 ) Benth ; gelsenicine ; gelsevirine ; high2speed
counter2current chromatograp hy ( HSCCC)
　　钩吻为马钱科钩吻属植物钩吻 Gelsemium elegans
( Gardn1 et Champ1 ) Benth1 全草 ,盛产于闽、粤、
桂等地 ,具有广泛的临床药用价值 ,但因其毒性大一
直以外用治疗为主。钩吻的主要有效成分为吲哚类
生物碱。钩吻总生物碱具有显著的抗肿瘤、镇静、镇
痛、促进造血、抑制血小板聚集、免疫抑制等作
用[1 ,2 ] ,但其有效量与中毒量较为接近 ,限制了临床
应用。钩吻素己 (图 12A)为钩吻生物碱中毒性最强
的单体[ 3 ] 。12甲氧基钩吻碱 (图 12B) 为甲氧基取代
钩吻素甲 ,其药理作用未见文献报道。用于分离纯
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基金项目 :福建省科技计划重点项目 (2007 Y0018) ;福建医科大学教授学术发展基金资助项目 (J S06027)
作者简介 :沈　洁 (1983 —) ,女 ,福建长汀人 ,硕士研究生 ,主要从事神经精神药物药理学研究。3 通讯作者　俞昌喜　Tel/ Fax : (0591) 83569311 　E2mail : changxiyu @mai1fjmu1edu1cn
化钩吻素己和 12甲氧基钩吻碱的传统方法为碱性
硅胶柱或氧化铝柱色谱法[3 ] ,但是此方法分离周期
长 ,溶剂消耗大 , 得率低。高速逆流色谱 ( high2
speed counter current chromatograp hy , HSCCC) 是
一种基于液2液分配机制的新型色谱分离纯化技术 ,
可避免液固色谱造成的固体载体对样品的不可逆吸
附 ,分离效率高 ,回收率高 ,制备量大[4 ] 。本实验采
用 HSCCC 技术分离纯化钩吻素己和 12甲氧基钩吻
碱 ,旨在为钩吻生物碱单体的研发提供一种高效分
离纯化制备技术。
图 1 　钩吻素己( A)和 12甲氧基钩吻碱( B)的化学结构
Fig11 　Chemical structures of gelsenicine ( A)
and gelsevirine ( B)
1 　仪器与材料
　　TB E —300A 高速逆流色谱仪 、TBP —50A 恒
流泵、TBD —23 紫外检测器 (上海同田生物技术有
限公司) ;DBS —100 电脑全自动部分收集器 (上海
青浦沪西仪器厂) ; HX —1050 恒温循环器 (北京博
医康实验仪器有限公司) ;1100 高效液相色谱仪 (美
国 Angilent 公司) ; Avance Ⅲ 400M HZ 核磁共振
仪 (瑞士 Bruker 公司) ; L CQ 离子阱质谱仪 (美国
Finnigan Thermo elect ron 公司) 。
　　钩吻药材采集于福州市 ,经本课题组鉴定为钩
吻 G1 elegans ( Gardn1 et Champ1 ) Bent h1 全草。
实验中所用的乙醇、氯仿、甲醇均为分析纯 ,购自天
津巴斯夫化工有限公司 ;高效液相色谱 ( HPL C) 分
析用甲醇为色谱纯 ,购自中国国药集团化学试剂有
限公司 ;实验用水为自制重蒸水。
2 　方法与结果
211 　钩吻粗提物的制备 :将晒干的钩吻根茎适当粉
碎 ,称取钩吻粗粉 500 g ,加入 3 000 mL 95 %乙醇浸
泡过夜。90 ℃水浴加热回流 3 h 后 ,滤过 ,减压蒸
馏回收溶剂。重复上述步骤 ,共回流提取 3 次 ,每次
3 h。将所得滤液合并后减压蒸馏至无醇味 ,再加入
2 %盐酸 300 mL ,使 p H 值小于 2 ,静置过夜。将静
置的溶液抽滤 ,滤液用 50 mL 乙醚萃取 ,除去脂质
和色素 ,弃去乙醚层。然后缓慢加入 100 mL 5
mol/ L 氢氧化钠 ,使 p H 值大于 11。最后依次用氯
仿、醋酸乙酯各萃取 3 次 ,合并萃取液 ,减压蒸馏即
得钩吻总碱浸膏 3106 g ,提取率为 0161 %。
212 　HSCCC 溶剂体系的选择 :采用 HSCCC 分离
天然产物中的化学成分 ,溶剂体系的选择至关重要。
目前常用 HPL C 法测定组分在不同溶剂体系中的
分配系数来指导溶剂体系选择。本研究根据钩吻生
物碱的化学性质 ,选择分离中等极性化合物的 3 类
溶剂体系 :正己烷2醋酸乙酯2甲醇2水、正己烷2醋酸
乙酯2乙醇2水、氯仿2甲醇2盐酸水溶液。
　　配制各种比例溶剂体系 ,静置 2 h。取适量钩
吻总生物碱提取物 ,加入两相体系中的下相中充分
溶解 ,用 H PL C 法测定下相中目标单体的峰面积
( A 1 ) 。然后再加入等体积上相 ,将上下两相剧烈振
荡充分混合 ,待生物碱在两相中分配完全后 ,测定下
相中目标单体的峰面积 ( A 2 ) 。HPL C 测定时上下
两相的进样体积相同。计算分配系数 [ K = ( A 1 -
A 2 ) / A 2 ] ,结果见表 1。结果显示 ,两种目标化合物
在溶剂体系正己烷2醋酸乙酯2甲醇2水中的分配系数
均小于 015 ,样品出峰太快 ,单体不能实现有效分
离。而在溶剂体系正己烷2醋酸乙酯2乙醇2水 (3 ∶
3 ∶2 ∶3、3 ∶4 ∶2 ∶3) 或氯仿2甲醇2 011 mol/ L 盐
酸 (4 ∶3 ∶2) 中的分配系数在 015～210 ,虽符合要
求 ,但将上述比例的溶剂体系应用于 HSCCC 分离
时 ,发现钩吻素己与其他成分同时出峰 ,样品质量分
数不高。最终选定氯仿2甲醇2 盐酸水溶液 (4 ∶4 ∶
2)作为分离钩吻素己和 12甲氧基钩吻碱的最佳溶
剂系统 ,该溶剂体系水溶液中 011、012 mol/ L 的盐
酸浓度对于分离的效果无显著差异。
表 1 　钩吻素己和 12甲氧基钩吻碱在不同种溶剂体系
中的分配系数
Table 1 　Partition coeff icients of gelsenicine and
gelsevirine in various solvent systems
溶剂体系
分配系数
钩吻素己 12甲氧基钩吻碱
正己烷2醋酸乙酯2甲醇2水 (3 :3 :3 :3) 01 21 01 09
(3 :4 :2 :3) 01 41 01 39
(3 :3 :3 :3) 01 35 01 52
(3 :3 :2 :3) 01 75 01 81
(3 :4 :2 :3) 11 14 11 26
氯仿2甲醇201 1 mol/ L 盐酸 (4 :2 :2) 51 08 21 37
(4 :3 :2) 11 56 01 83
(4 :4 :2) 11 16 01 89
(4 :2 :2) 21 71 01 47
(4 :3 :2) 21 67 01 51
(4 :4 :2) 11 01 01 88
213 　HSCCC仪器参数的优化 :影响分离效果的仪器
参数包括泵的流速、主机转速、恒温浴槽的循环水温。
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21311 　泵的流速的影响 :流速越快则分离时间越短 ,
分离效果越不理想 ;流速越慢则分离效果越好 ,分离
时间越长。本研究考察了 110、115 、210 mL/ min 等
流速 ,其中流速为 115 mL/ min 时分离效果最好 ,上相
保留率为 73 %。
21312 　主机的转速的影响 :由于氯仿2甲醇2盐酸水
溶液形成的两相溶剂体系容易产生气泡 ,为了尽量
减少气泡对分离效果和仪器管路造成的不利影响 ,
实验之前先将上下相超声脱气 30 min ,同时在不影
响分离效果的前提下尽量减慢转速 ,实验发现转速
850 r/ min 比较合适。
21313 　循环水温的影响 :循环水温对分离效果影响
不大 ,最终选用 25 ℃作为分离温度。
214 　HSCCC 分离钩吻素己和 12甲氧基钩吻碱的
操作 : 配制氯仿2甲醇2011 mol/ L HCl 溶剂体系
(4 ∶4 ∶2) ,充分混匀后静置过夜。使用前分离溶剂
体系的上下相 ,上相为固定相 ,下相为流动相 ,分别
超声 30 min。300 mg 钩吻总碱超声溶解在 15 mL
下相中备用。将上相泵入高速逆流色谱仪主机 ,待
上相从管道出口流出时 ,开启恒温循环器 ,调节温度
至 25 ℃,设定流速为 11 5 mL/ min ,泵入下相 ,同时
开启 HSCCC 主机 ,由首端向尾端正转洗脱 ,转速为
850 r/ min。当流动相从主机出口流出 ,表明体系已
经达到流体动力学平衡 ,此时将样品倒吸入仪器螺
旋管柱内 ,检测波长为 254 nm。应用 N2000 色谱
工作站采集紫外吸收信号 ,并根据色谱峰分段收集
样品。300 mg 钩吻总碱粗品经 HSCCC 一次分离
纯化 ,可得到 1914 mg 流份 Ⅰ和 2112 mg 流份 Ⅱ。
其 HSCCC 分离过程的色谱图见图 2。
t/ min
Ⅰ2钩吻素己　Ⅱ212甲氧基钩吻碱
Ⅰ2gelsenicine 　Ⅱ2gelsevirine
图 2 　HSCCC法分离纯化钩吻总生物碱色谱图
Fig1 2 　HSCCC Chromatogram for separation and puri2
f ication of total alkaloids from G1 elegans
215 　质谱和核磁共振分析
　　化合物Ⅰ:电喷雾质谱 ( ESI2MS) m/ z32716 (M +
H + ) ,其相对分子质量应为 32616。该化合物的
1 H2NMR ( CDCl3 , TMS) 数据表明 : 芳香氢信号
δ7154 ( 1 H , dd , H29) 、7125 (1 H , ddd , H210) 、7107
(1 H ,ddd , H211) 、6188 (1 H ,dd , H212) ,甲氧基信号
δ3195 (3 H , s ,OCH3 ) ,甲基信号δ1129 (3 H , t ,182
H) 。13 C2NMR (CDCl3 , TMS)δ184145 ( C22) 、74192
(C23) 、72146 ( C25 ) 、37168 ( C26 ) 、55180 ( C27 ) 、
132124 ( C28) 、124166 ( C29) 、123133 ( C210) 、128104
(C211) 、106155 ( C212) 、138104 ( C213) 、27100 ( C2
14) 、39178 (C215) 、42151 (C216) 、62110 (C217) 、9197
( C218 ) 、25168 ( C219 ) 、171125 ( C220 ) 、63134
(OCH3 ) 。经与文献报道[3 ] 提供的数据对照 ,确定
该化合物为钩吻素己。
　　化合物 Ⅱ: ESI2MS m/ z 35312 (M + H + ) ,其相
对分子质量应为 35212。1 H2NMR ( CDCl3 , TMS)
数据 :其中芳香氢信号δ7141 ( 1 H , d , H29) 、7114
(1 H ,t , H210) 、7128 (1 H ,t , H211) 、7103 (1 H ,d , H2
12) ,甲氧基信号δ31 99 (3 H , s , OCH3 ) ,甲基信号
δ2173 (3 H , s ,Nb2CH3 ) 。13 C2 NMR ( CDCl3 , TMS)
的信号 :δ170199 ( C22) 、68187 ( C23) 、73136 ( C25) 、
48192 (C26) 、511 47 (C27) 、125182 ( C28) 、127198 ( C2
9) 、123163 ( C210) 、129140 ( C211) 、107181 ( C212) 、
139134 ( C213) 、22139 ( C214) 、34128 ( C215) 、39135
(C216) 、60132 ( C217) 、116186 ( C218) 、133154 ( C2
19) 、34128 ( C220 ) 、63180 ( C221 ) 、63131 ( Na2O2
CH3 ) 、42189 ( Nb2CH3 ) 。经与文献报道[5 ] 数据对
照 ,确定该化合物为 12甲氧基钩吻碱。
216 　组分的质量分数的 H PL C 法测定
21611 　色谱条件 :色谱柱为依利特 Hypersil ODS2
高效液相色谱柱 (250 mm ×416 mm ,5μm) (大连
依利特分析仪器有限公司) ;流动相为甲醇2012 %正
丁胺水溶液 (50 ∶50) ;二极管阵列检测器 ;体积流量
为 110 mL/ min ;检测波长为 256 nm ;柱温为 25 ℃。
21612 　紫外法测定结果 :经 HSCCC 分离得到的流
份 Ⅰ和 Ⅱ在高效液相色谱 190～600 nm 波长扫描
发现 ,两样品在不同检测波长中均为单一的色谱峰。
21613 　H PL C 法测定结果 :采用面积归一化法计
算钩吻素己和 12甲氧基钩吻碱的质量分数分别为
9514 %、9816 % ,见图 3。
3 　讨论
　　分离纯化钩吻生物碱通常采用碱性硅胶或氧化
铝柱色谱等方法[ 3 ] ,此方法分离周期长 ,损失大 ,得
率低 ,操作繁琐。而本研究首次采用高速逆流色谱
技术分离纯化钩吻素己和 12甲氧基钩吻碱 ,大大提
高了分离效率 ,此方法具有分离效果好 ,分离实验周
·4931· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 9 期 2009 年 9 月
t/ min
Ⅰ2钩吻素己　Ⅱ212甲氧基钩吻碱
Ⅰ2gelsenicine 　Ⅱ2gelsevirine
图 3 　经 HSCCC分离得到流份 Ⅰ( A)和流份 Ⅱ( B)的
HPLC色谱图
Fig13 　HPLC Chromatograms of fraction Ⅰ( A)
and fraction Ⅱ( B) by HSCCC
期短 ,样品损失少 ,操作简单等优点 ,为钩吻生物碱
单体的研发提供了一种高效分离纯化的制备技术。
　　本研究采用半制备型高速逆流色谱分离纯化钩
吻生物碱单体 ,一次进样300 mg钩吻总碱粗品可
分离得到 1914 mg 钩吻素己和 2112 mg 12甲氧基钩
吻碱单体 ,质量分数分别为 9514 %、9816 %。此外 ,
如采用制备型高速逆流色谱仪 ,其进样量大 ,可达
克～100 克量级 ,产量可达较大规模 ,易于衔接工程
化生产制备。有关钩吻素己、12甲氧基钩吻碱药理
作用、毒理作用 ,有待于进一步研究。
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丹参酮自乳化药物传递系统的初步研究
杨小军 ,魏希颖 3 ,徐慧娴
(陕西师范大学生命科学学院 ,陕西 西安 　710062)
摘 　要 :目的 　筛选丹参酮自乳化药物传递系统的处方 ,考察其稳定性。方法 　通过溶解度试验、乳化程度观察 ,
乳化完全时间、乳滴粒径大小测定以及伪三相图绘制 ,确定丹参酮自乳化药物传递系统最佳处方 , HPLC 法测定处
方中药物的量 ,光照、高温、低温条件下考察其稳定性。结果 　丹参酮自乳化药物传递系统最佳处方中的油相为油
酸乙酯 ,乳化剂为 TX10 和聚山梨酯 80 ,助乳化剂为异丙醇 ,四者比例为 60 ∶84 ∶21 ∶35。结论 　所得到的丹参酮
自乳化药物传递系统处方在避光和常温下性质稳定。
关键词 :丹参酮自乳化药物传递系统 ;丹参酮 ;伪三元相图 ;稳定性
中图分类号 :R286102 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 0921395204
Preliminary study on self2emulsifying drug del ivery system of tanshinone
YAN G Xiao2jun , WEI Xi2ying , XU Hui2xian
(School of Life Science , Shaanxi Normal University , Xi′an 710062 , China)
Abstract : Objective 　To screen t he formulation for tanshinone self2emulsifying drug delivery system
( SEDDS) and evaluate it s stability1 Methods 　The optimal tanshinone SEDDS formulation was established
t hrough solubility experiment , emulsion examination , f ully emulsified time , droplet size determination ,
and p seudo2ternary diagram drawing1 The content and stability were evaluated by HPL C assay under t he
condition of illumination , high and low temperat ure1 Results 　The oil p hase , surfactant and co2surfactant
in t he optimal tanshinone SEDDS formulation were et hyl oleate , TX10 , Tween 80 , and isopropyl alcohol
(60 ∶84 ∶21 ∶35)1 Conclusion 　The acquired formulation of tanshinone SEDDS is stable in t he dark and
room temperat ure1
Key words : tanshinone self2emulsifying drug delivery system ( SEDDS) ; tanshinone ; p seudo2ternary
diagram ; stability
·5931·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 9 期 2009 年 9 月
3 收稿日期 :2009201217　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
作者简介 :杨小军 (1984 —) ,男 ,内蒙古乌兰察布人 ,中药学专业硕士研究生 ,本科就读于内蒙古医学院中药学专业 ,研究方向为中药新
剂型及中药药理。E2mail : yxj3905896 @1631com3 通讯作者　魏希颖　E2mail : whm801 @yahoo1com1cn