全 文 ：[基金项目 ] 　韶关市医药卫生科研计划项目(2009Y09004)
[作者简介 ] 　邓礼明(1971-),男 ,本科 , 主管技师 ,主要从事理
化检验工作。
【化学测定方法】
基层实验室快速检测断肠草中钩吻碱的技术研究
邓礼明 1 ,黄俊锋 1 ,卢志坚 2 ,苏少芳 2 ,招莉 2 ,张明 1 ,张为朋 1 ,刘青 1 ,谭秀凤 1
(1.广东省仁化县疾病预防控制中心 , 广东仁化　512300;2.广东省韶关市疾病预防控制中心 ,广东韶关　512028)
[摘要 ] 　目的:探讨基层实验室快速检测断肠草钩吻碱的方法 , 为应对断肠草中毒事件提供快速 、简便 、准确 、实用的技
术。方法:根据钩吻碱具有碱性的特点 , 用 5%氢氧化钠浸泡 , 再用超声波提取 , 然后用三氯甲烷萃取。提取物用传统化
学显色法进行初步鉴定 ,再将样品浓缩液点样于荧光 254nm硅胶薄层板上 , 展开后置于荧光灯下观察钩吻碱的展开情
况。结果:模拟断肠草引起的食物中毒方式(植株用米酒浸泡 30 d;嫩叶和花朵用开水浸泡;将植株置于砂锅中小火煲
水),对样品分别取一定量的浸泡液和残渣按照最佳实验条件进行提取鉴定。结果表明样品与标准品 Rf值一致(Rf=
0.60, 25℃), 可鉴别样品中含有的钩吻碱。结论:该法在食物中毒快速鉴定过程中实用 、可靠 , 可供基层实验室参考。
[关键词 ] 　基层实验室;断肠草;钩吻碱;食物中毒;薄层色谱法
[中图分类号 ] 　O658.1　　　　[文献标识码 ] 　A　　　　[文章编号 ] 　1004-8685(2009)04-0777-03
Researchonrapiddetectionforgelseminefromgelsemiumelegansbenthinprimarylabo-
ratory
DENGLi-ming1 , HUANGJun-feng1 , LUZhi-jian2 , SUShao-fang2 , ZHAOLi2 , ZHANGMing1 , ZHANGWei-peng1 , LIUQing1 ,
TANXiu-feng1
(1.RenhuaCenterforDiseaseControlandPrevention, Renhua512300, China;2.ShaoguanCenterforDiseaseControlandPre-
vention, Shaoguan512028, China)
[ Abstract] 　Objective:Toprobeintotherapiddetectionofgelseminefromgelsemiumelegansbenthfortheprimarylaboratory
toprovidespeedy, simple, accurateandpragmatictechnologytodealwithgelsemiumelegansbenthpoisoning.Methods:Since
thegelseminehasalkaline, with5% sodiumhydroxideimmersionfirst, andthenwithultrasonicextraction, weextractgelsemine
withchloroform.Extractedsampleisidentifiedpreliminarilybyatraditionalchemicalmethod.Afteriswasconcentratedliquid
samplepoint-likefluorescent254 nmsilicagelthin-layerboard, weobservedunfoldinggelsemine.Results:Throughtheway
simulatedgelsemiumelegansbenthfoodpoisoningtest(withriceplants30 daysofimmersion.Thetenderleavesandflowerswere
treatedwithboiledwaterimmersion.Afterplantswereplacedinearthenpotwithsmallandmedium-sizedfireboilerwater),
samplesweretakenonacertainamountofsoakliquidandresiduesinaccordancewiththeoptimumconditionsforextractionofi-
dentification.TheresultsindicatedthatthesampleshadthestandardRfvalue(Rf=0.60, 25℃), thusweidentifiedthesamples
containingthegelsemine.Conclusion:Basedontheexperiment, theprocessofrapididentificationforfoodpoisoningispractical
andreliable, soitmayprovidetheprimarylaboratoryunitwithsomereference.
[ Keywords] 　Theprimarylaboratory;Gelsemiumelegansbenth;Gelsemine;Foodpoisoning;Thinlayerchromatography
　　断肠草(Gelsemiumelegansbenth)为马钱科胡蔓藤属植
物 , 学名钩吻 ,又名胡蔓藤 、毒根 、大茶药 、野葛 、猪人参等。断
肠草为缠绕常绿藤本植物 ,枝光滑。叶对生 , 卵形至卵状披针
形 , 顶端渐尖 ,基部渐狭或近圆形 , 全缘 。聚伞花序顶生或腋
生 , 花淡黄色 ,花冠漏斗状 , 内有淡红色斑点;蒴果卵形 , 种子
有膜质的翅。花期 8 ～ 11月;果期 11月至翌年 2月。 主产于
亚洲和北美 , 在我国主要分布于浙江 、福建 、广东 、广西 、湖南 、
贵州 、云南等省区的山地灌木丛中 [ 1] 。其性温 、味辛 、苦 , 根 、
茎 、叶 、花和花蜜均含有对人体有剧毒的钩吻生物碱 , 人误食
几片叶就会中毒。断肠草花形与具有清热解毒功能的金银花
极为相似 , 山区群众常采集或购买一些藤状植物煲汤或煮凉
茶喝 , 由于干燥藤状植物较难辨认 , 容易混淆 , 人们易将断肠
草误认为金银花而误食引起食物中毒 , 给人民群众身体健康
带来极大威胁。因此需要一种快速简便的钩吻生物碱的检测
方法。
提取断肠草中钩吻碱的方法 [ 2 ～ 4]主要有溶剂浸提法 、索
氏回流法 、超声波提取法 、固相萃取膜提取法等。溶剂浸提法
和索氏回流法是传统提取生物碱方法 , 虽然提取效率较高 , 但
提取时间较长 , 通常需要 6 h以上 , 固相萃取膜是一种近期内
发展起来的新技术 , 它对液体样品提取量大 , 可同时进行提取
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和浓缩 , 但实验成本较高 , 仍未能在我国实验室内普及使用。
超声波萃取法是 20世纪兴起的提取方法 , 提取效率高 、实验
时间短。钩吻生物碱的检测可用气 -质联用仪 , 但对大多数
基层来说 , 仪器价格昂贵 ,难以普及。 本实验主要利用超声波
法提取断肠草中的钩吻碱 ,用薄层色谱法进行鉴定 ,建立快速
而简便的检测方法 , 有助于基层实验室解决断肠草中毒快速
诊断的问题。
1　材料与方法
1.1　仪器与设备
KQ-250DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限
公司);UV-1型三用紫外线分析仪(上海顾村电光仪器厂);
6202型小型高速粉碎机(北京环亚天元机械有限公司);20 cm
×20 cm荧光 254 nm硅胶预制玻璃板;XK96 -3型微量振荡
器;层析缸;常压烘箱。
1.2　试剂
钩吻素甲标准液 购自 Sigma公司 , 准确称取钩吻素甲
1.000 g, 用三氯甲烷溶解定容至 100 ml, 作为储备液;取标准
储备液 1 ml稀释至 100 ml,浓度为 100mg/L。
硫酸 、三氯甲烷 、氢氧化钠 、无水硫酸钠 、甲醇 、异丙醇 、重
铬酸钾 、钒硫酸试剂(0.1g钒酸铵溶于 10 ml硫酸中)。以上
试剂均为分析纯 , 水为超纯水。
断肠草样品 采集广东山区韶关 、英德 、梅州 、连州四个地
方产的断肠草。
1.3　钩吻碱的提取
将样品粉碎为约 30 ～ 40目的粗粉 , 精密称取 100 g, 加入
适量 5%氢氧化钠溶液拌匀 , 振荡浸泡 30 min。在频率 50Hz、
温度 60℃条件下 , 于超声振荡器中振荡提取 20 min×2次 ,合
并提取液 , 减压回收溶剂。浓缩液用 0.5%盐酸萃取 3次 , 所
得酸液用浓氢氧化钠调至 pH值为 11后 , 再用氯仿萃取 3次。
减压回收氯仿 , 得棕红色流浸膏 ,即为断肠草总碱粗提物。称
取重量后计算提取率 。将粗提物溶于适量氯仿制成浓缩液备
用。同时用金银花做阴性对照实验。
1.4　提取率计算
粗提物提取率(%)=粗提物质量 /g样品质量 /g ×100
1.5　钩吻碱的鉴定
1.5.1　快速检测方法　钩吻生物碱能与一些试剂作用而显
色 [ 5] , 其中与重铬酸钾 -硫酸 、钒硫酸试剂显色较特殊 , 灵敏
度也较高 , 操作简便 , 不需要仪器设备 , 可作为现场鉴别筛选
用。
重铬酸钾 -硫酸反应 残渣中加 1小粒重铬酸钾结晶 ,加
浓硫酸 2滴 , 慢慢旋转小瓷皿。 现象:中毒试样及阳性对照
样:蓝紫色条纹渐变红紫 , 最后为墨绿色(钩吻生物碱特殊显
色反应)。阴性对照样:橙色渐变为绿色。
钒硫酸反应 残渣中加 2滴钒硫酸试剂。现象:中毒样品
及阳性对照样:紫红色渐变为紫色 , 最后变蓝色(钩吻生物碱
特殊显色反应)。阴性对照样:橙色渐变为绿色。
以上显色法由于受检材本身颜色影响较大 , 容易出现假
阴性和假阳性 , 逐渐被淘汰。取而代之的是薄层色谱法。
1.5.2　薄层色谱法 [ 6]　将荧光 254 nm硅胶预制玻璃板置于
装有异丙醇的层析缸中 , 待溶液在层析板上完全展开后 , 于室
温下风干 ,在 110℃烘箱中活化 1h,置于干燥器中放冷。取浓
缩液 20 μl点样于荧光 254 nm硅胶薄层板上 , 把点样后的薄
层板置于层析缸中 , 展开剂按三氯甲烷:甲醇 =90:10设置 , 展
距 100 mm,展开后 N2干燥 10 min。 将展开后的薄层板直接
置于 254 nm的荧光灯下 , 观察钩吻碱的展开情况。同时用钩
吻素甲标准作对照。
2　结果与讨论
2.1　断肠草的形态学特征
虽然断肠草的花期(冬春)与金银花的相近 ,花形上有点
相似 ,但两者的差异还是非常明显。一是叶子的质地不同 , 断
肠草为革质叶 , 叶面光滑;而金银花为纸质叶 , 叶面无光泽。
二是花朵的着生方式不同 , 断肠草的花顶生或腋生 , 花为三歧
分枝的聚伞花序;而金银花花朵为腋生 , 一般成对出现。三是
花朵的色彩和形状不同 , 断肠草花冠黄色 , 花形漏斗状 , 是合
瓣花 , 长 1 ～ 1.6cm;而金银花的花冠唇形 , 是离瓣花 , 花筒较
细长 , 花也较断肠草的花小。并且金银花初开时花朵为白色 ,
一二天后才变为金黄 , 新旧相参 , 黄白衬映 , 故名 “金银花” 。
掌握了这三方面的特点 , 就不会混淆断肠草和金银花了。但
是干燥的断肠草与其它藤类植物较难辨认 , 常误食引起中毒
而需进行快速鉴定。
2.2　最佳提取条件的选择
超声波提取法是利用超声波产生的强烈振动 、高的加速
度 、强烈的空化效应 、搅拌作用等 , 可加速生物检材中药毒物
进入溶剂 , 且提取不会乳化 , 可以采用较少的溶剂进行萃取 ,
从而提高了提取率 , 缩短了提取时间 , 节约了溶剂 , 并且免去
了复杂的提取净化过程。按照钩吻碱主要呈碱性的性质 , 根
据相似相溶原理 , 首先采用 5%的氢氧化钠溶液提取植物中碱
性的成分 , 去除其他非碱性的杂质 , 达到净化的效果。此外 ,
钩吻生物碱的极性和三氯甲烷的极性最相近 , 所以提取率最
高 , 虽然甲醇 、乙醇的极性比三氯甲烷大 , 但是它们将试样中
的其他极性成分也溶解出来 , 提取液的杂质较多 , 而生物碱的
提取率相对较低 , 因此 ,本方法采用三氯甲烷作为提取溶剂。
为了获得以三氯甲烷为提取剂时 , 超声波提取断肠草总
碱的最佳提取条件 , 在做预试验的基础上 , 利用正交法 “均衡
分散”的特点 , 以不同氢氧化钠浓度 、不同的提取温度 、不同超
声波提取时间 、不同的提取次数为主要考察因素 , 选用正交表
L9(34), 设计四因素三水平 9个实验 ,以粗提物的提取率为考
察指标 , 确定最佳提取条件。因素水平表见表 1,实验结果见
表 2。
表 1　因素水平表
水平 NaOH浓度 /%A
提取温度 /℃
B
提取时间 /min
C
提取次数
D
1 1.0 40 10 1
2 5.0 50 20 2
3 10.0 60 30 3
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表 2　L9(34)正交实验结果
序号 因素A B C D
粗提物提
取率 /%
1 1 1 1 1 1.02
2 1 2 2 2 1.25
3 1 3 3 3 1.30
4 2 1 2 3 1.52
5 2 2 3 1 1.47
6 2 3 1 2 1.58
7 3 1 3 2 1.49
8 3 2 1 3 1.45
9 3 3 2 1 1.50
K1 1.190 1.343 1.350 1.330
K2 1.523 1.390 1.423 1.440
K3 1.480 1.460 1.420 1.423
R 0.333 0.117 0.073 0.110
由表 2可看出:极差 RA>RB>RD>RC,由此可知 , 氢氧化
钠浓度是影响提取率的重要因素 , 其次是提取温度 、提取次
数 、提取时间。再根据 K值进行分析 , 得出 A2比 A1、A3好 , B3
比 B
1
、B
2
好 , C
2
比 C
1
、C
3
好 , D
2
比 D
1
、D
3
好 , 因此 , 断肠草总
碱最佳提取工艺条件为 A2B3C2D2 , 即以 5%氢氧化钠作浸泡
液 , 在 60℃条件下 , 超声提取 20 min×2次 , 总碱粗提物得率
最高。
2.3　薄层色谱法的影响因素
薄层色谱法(简称 TLC法)鉴别钩吻碱和以往的特殊显色
法相比 , 具有操作方便 、设备简单 、展开速率快 、分析结果直观
等优点 , 适用于基层实验室应对断肠草中毒事件的鉴定。广
东山区四个地方断肠草样品的薄层色谱图如图 1, 从薄层色谱
图可知:梅州样品有 3个斑点;韶关样品有 4个斑点;连州样品
有 3个斑点;英德样品有 5个斑点;而且都含有钩吻素甲的钩
吻碱。如果要进一步确定钩吻碱的含量 , 可采用气相色谱 -
质谱联用仪方法对样品进行定量分析。
1、梅州样品;2、韶关样品;3、连州样品;4、英德样品;5、标准品
图 1　断肠草中钩吻碱薄层色谱图
该法主要影响因素有:1、有机溶剂:由于各种钩吻碱的结
构相似 , 需要采用极性较大的有机溶剂三氯甲烷作为展开剂 ,
才能将各种钩吻碱分开。 2、点样量:点样量不宜太多 , 一般以
1 ～ 20 μg, 否则会降低各组分之间的比移值(Rf)。 3、环境因
素:对于荧光硅胶板 , 因其吸水性较强 , 而使用的有机溶剂是
疏水性强的三氯甲烷 , 环境的相对湿度对其影响非常大 , 所
以 , 使用前应置于烘箱中烘干 , 在干燥器中放冷至室温;点样
后将薄层板放入干燥器中 15 ～ 20 min, 才置于展开槽内展开。
否则 , 展开后的色谱图会产生斑点拖尾 、歪扭或变形。
2.4　方法的应用
模拟断肠草引起的食物中毒方式 , 对韶关样品分别用几
种不同方法进行处理:1、植株用米酒浸泡 30 d;2、嫩叶和花朵
用开水浸泡;3、将植株置于砂锅中小火煲水。 分别取一定量
的浸泡液和残渣按照最佳实验条件进行提取鉴定。结果表明
样品与标准品 Rf值一致(Rf=0.60, 25℃,图 2)。
1、标准品;2、米酒浸泡;3、开水浸泡;4、煲水
图 2　韶关样品不同处理方法的薄层色谱图
2.5　断肠草中毒时的急救处理
由于断肠草中钩吻碱毒性大 , 致死率较高。而广东地区
广泛分布断肠草 , 常易引起误服 , 建议加强宣传教育 , 使群众
充分认识断肠草的特性 , 避免中毒事件发生。 如果发生疑似
断肠草中毒事件 , 应该综合事件经过 、流行病学调查 、实验室
检验结果 , 方可确定是否为断肠草中钩吻碱引起的中毒。一
旦发生中毒 , 应及时就诊。断肠草中毒无特效药 , 一般的急救
方法是洗胃 、催吐 、导泻 , 静脉补液 , 纠正酸中毒及电解质紊
乱。民间有灌服食草的鸭 、鹅 、羊动物新鲜热血的偏方。有条
件的地方可进行血液透析。
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(收稿日期:2009-02-25)
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