全 文 ：华南预防医学2008年2月第34卷第1期 SouthChinaJPrevMed,February2008,Vol34,No.1
钩吻碱(gelsemine)是一种氧化吲哚型生物碱,
存在于马钱科植物中。如钩吻素甲分子式C20H22N2O2。
钩吻碱是极强的神经毒,可直接抑制中枢神经系统,
使呼吸中枢麻痹,导致呼吸衰竭而死亡。0.15～0.3g
钩吻碱便可使人致死,钩吻碱浸膏3.5mL为中毒致
死量。大茶药别名有断肠草、野葛、火把花、大炮叶
等
[1]
,全株有毒,含毒成份即为钩吻碱,其嫩叶毒性
尤强。广东山区清远、梅州等地近年因误服大茶药
中毒、死亡的事件也时有发生。目前,国内外一般采
用高效液相色谱法(HPLC)[2]和气相色谱-质谱联用
仪法
[3]
分析断肠草的生物碱,但这两种方法所用仪
器价格昂贵,国内一些基层检验单位不具备这个条
件。
薄层层析法简称 TLC法,具有设备简单、成本
低、快速,分析结果直观等优点
[4]
,因此我们尝试用
TLC法对断肠草的钩吻碱进行检验分析,探讨解决
基层检验单位对大茶药快速定性检验的方法。
1 材料和方法
1.1 仪器和设备
CAMAG公司薄层色谱仪:自动点样 ATS4;自
动展开仪 AMD2;扫描仪 Scanner3;摄影仪 Re-
porstar3;20cm×20cm荧光 254nm硅胶预制玻璃
板;常压烘箱。
1.2 试剂
1.2.1钩吻素甲标准液 购自Sigma公司,准确称取
钩吻素甲1.104g,用三氯甲烷溶解定容至 100mL,
作为储备液;取标准储备液1mL稀释至100mL,浓
度为110.4mg/L。
1.2.2 展开剂 所用展开剂组成中各物质的体积分
数比为三氯甲烷∶甲醇=90∶10[5]
1.2.3 碘化铋钾显色剂 称取 0.85g次硝酸铋,加
冰醋酸 10mL,水 40mL,溶解后加入 40%碘化钾
20mL,此显色剂应现用现配。
1.2.4 其他 三氯甲烷、氢氧化钠、无水硫酸钠及以
上所用试剂均为分析纯,水为蒸馏水.
1.2.5 大茶药样品 来自广东梅州、韶关、连州和英
德4个地方。
1.3 样品前处理
1.3.1 固体 称取 1.0～5.0g样品,加入 5%氢氧化
钠溶液 40mL,用振荡器振荡提取 5min,超声提取
15min,吸取20mL提取液于125mL分液漏斗中,
加入50mL三氯甲烷振荡提取,待分层后,再用50mL
三氯甲烷提取水相,合并二次提取液,经装有约20g
无水硫酸钠的玻璃漏斗脱水滤入蒸发皿中,再以
40mL三氯甲烷分数次洗涤容器和无水硫酸钠,洗
涤液并入蒸发皿中,在60℃水浴中浓缩至近干,用
三氯甲烷定容至2mL,待测。同法制备阴性对照液。
1.3.2 液体 吸取 10～20mL样品,加入 5%氢氧
化钠溶液40mL,余下操作同。
1.4 洗板
将荧光 254nm硅胶预制玻璃板置于装有异丙
醇的层析缸中,待溶液在层析板上完全展开后,于室
·检验技术·
应用TLC法鉴定断肠草中钩吻碱
黄伟雄 1,李汴生 2,范山湖 3,戴光伟 3,梁春穗 3
【摘要】 目的 探讨建立薄层层析法鉴定断肠草钩吻碱的检验方法。方法 样品用 5%氢氧化钠
浸泡、振荡、超声提取后,再用三氯甲烷萃取,经薄层色谱仪自动点样、展开。结果 采用对钩吻碱有特
征显色的碘化铋钾显色剂显色或在 254nm荧光下观察,可鉴别样品中是否含有钩吻碱。通过薄层色
谱显色试验,确定方法的检测下限为0.5μg,能满足因钩吻碱引起食物中毒的检测要求。结论 该方法
快速、简单、直观、准确,在食物中毒快速检验过程中实用、可靠。
【关键词】 薄层层析法; 断肠草; 钩吻碱
中图分类号:O658.1 文献标识码:B 文章编号:1671-5039(2008)01-0060-03
基金项目:广东省医学科研指令性课题(C2005007)
作者单位:1.广东省疾病预防控制中心,华南理工大学食品与轻
工学院工程硕士在职研究生,广东 广州 510300;2.华南理工大学食
品与轻工学院;3.广东省疾病预防控制中心
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华南预防医学2008年2月第34卷第1期 SouthChinaJPrevMed,February2008,Vol34,No.1
温下风干,在 110℃烘箱中活化 1h,置于干燥器中
放冷,待用。
1.5 点样
在层析板距下端8.0mm处点样,设带宽8.0mm,
带距30mm,样品和标准点样量为10μL。
1.6 展开
把点样后的薄层板置于展开仪中,展开剂按三
氯甲烷∶甲醇=90∶10设置,展距90mm,展开后 N2干
燥10min。
1.7 显色
将显色剂均匀地喷雾在薄层板上,若样品中含
有钩吻碱,待薄层板干后,可看到对钩吻碱有特征显
色的橙色斑点出现。或将展开后的薄层板直接置于
254nm的荧光灯下,亦可观察到钩吻碱的展开情况。
2 结果与分析
2.1 样品提取
植物样品中,由于所含化学成分复杂,杂质对待
测的成分形成干扰,特别是在待测成分含量较低,而
其他干扰成分较多时,干扰更为严重。如果直接用有
机溶剂提取,不可避免地带进许多杂质,所以本方法
根据钩吻碱主要呈碱性的性质,根据相似相溶原理,
首先采用5%的氢氧化钠溶液提取植物中碱性的成
分,去除其他非碱性的杂质,达到净化的效果
[6]
。
2.2 点样
由于各种钩吻碱的结构相似,需要采用极性较
大的有机溶剂三氯甲烷作为展开剂,才能将各种钩
吻碱分开,但两斑点之间应相隔 30mm以上,以免
出现斑点相互干扰现象。
2.3 样品展开
对于定性鉴别,斑点越多,可供鉴别判断的信息
越多,分离度越高越好,但由于大多数生物碱的分子
结构相差不大,极性接近,分离效果应用于定性判断
尚可,见图1,而作为定量则其各种生物碱之间的比
移值距离仍需进一步加大,分离度应大于 1.5,才能
准确定量。
2.4 环境影响因素
对于荧光硅胶板,因其吸水性较强,而使用的有
机溶剂是疏水性强的三氯甲烷,环境的相对湿度对
其影响非常大,所以,使用前应置于烘箱中烘干,在
干燥器中放冷至室温;点样后将薄层板放入干燥器
中 15～20min,才置于展开槽内展开。否则,展开后
的色谱图会产生斑点拖尾、歪扭或变形。
2.5 检测限量试验
取与大茶药相似但不含钩吻素的茶叶1.0g,加
入不同含量的钩吻素甲标准,按本方法实验部分进
行样品处理、点样、展开、显色后得薄层色谱图,见图
1。从图中可见,0.4μg与0.6μg之间薄层展开显色后
斑点清晰,所以,本方法确定检测下限为0.5μg。
样品空白 0.2μg 0.4μg 0.6μg 0.8μg 1.0μg
图1 钩吻碱检测限量试验
2.6薄层色谱图
标准品(钩吻素甲110.4mg/L)和来自广东梅
州、韶关、连州和英德4个地方大茶药样品的薄层色
谱图如图2。从薄层色谱图可以看到:梅州样品有4
个斑点;韶关样品有2个斑点;连州样品有4个斑
点;英德样品有5个斑点;而且都含有钩吻素甲的钩
吻碱。为进一步确定斑点是否为生物碱,可采用对生
物碱有特征显色的碘化铋钾显色剂对斑点进行显色
试验,综合上述两种方法的显色试验结果,可以确定
样品中是否含有引起人体中毒的钩吻碱。
标准品 1 2 3 4
注:1.梅州样品;2.韶关样品;3.连州样品;4.英德样品
图2广东部分山区大茶药中钩吻碱薄层色谱图
2.7 应用
2007年5月,清远发生一起怀疑凉茶中含有大
茶药引起的食物中毒事件。我们采用上述的检验方
法,以连州、英德的大茶药作为对照品进行检测,经
检测并与对照品比对后,凉茶中确实含有钩吻碱,而
病人洗胃液则因含量太低未能检出。(见图3)
采用本方法可以简单、快速、直观有效地判断中
毒样品中是否含有钩吻碱,在食物中毒检验中较为
实用;如果要进一步确定钩吻碱的含量,可采用气相
色谱-质谱联用仪方法对样品进行定量分析。
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华南预防医学2008年2月第34卷第1期 SouthChinaJPrevMed,February2008,Vol34,No.1
标准 1 2 3
注:标准为钩吻素甲标准(110.4mg/L);1.清远凉茶样品;2.连州对照品;
3.英德对照品
图3 清远大茶药中毒事件样品检验色谱图
参考文献:
[1] 中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典 1部[M].
北京:化学工业出版社,2000:220.
[2] 韦欣,贺宏升,王曙.HPLC测定秦艽中的生物碱和龙胆苦苷
[J].华西药学杂志 ,2006,21(1):84-86.
[3] 邰昌松,肖惠贞,刘开钳.用气相色谱—质谱联用技术分析钩
吻碱中毒[J]中国卫生检验杂志,1999,9(1):40-41.
[4] 陆冰真,翟永信.薄层层析法在食品分析中的应用[M].北京:
北京大学出版社,1979:176-182.
[5] 孙毓庆.薄层扫描法及其在药物分析中的应用[M].北京:人民
卫生出版社,1990:36-85.
[6] 王宝.谈中药薄层色谱检测提取纯化问题[J].中国中药杂
志,1995,20(3):164-166.
(收稿日期:2007-08-07)
(本文编辑:吕莉)
院、村卫生室(包括个体诊所)监测年平均合格率分别为
94.3%(302/320)、81.4%(716/880)、69.2%(6828/9863),
三率比较差异有统计学意义(!2=143.82,P<0.01)。
2.3 不同类型样品监测结果比较
不同类型样品监测合格率以一次性用品最 高 为
91.6%,最低的是物体表面为 52.6%(!2=1150.55,P<0.01)
(见表2)。
表2 2003-2006年不同类型医疗用品监测合格率
3 讨论
近 4年华容县医疗单位消毒监测结果表明,合格率呈逐
年上升趋势,总合格率为70.9%。说明随着我国《传染病防治
法》和《消毒管理办法》的贯彻落实,卫生行政部门监管力度
的加大,各医疗单位及医务人员认识水平有所提高,法律意
识有所增强,消毒设施及措施有所完善,但离消毒技术规范
的要求还仍有一段距离。
不同类型医疗单位合格率以县直医院最高,乡镇卫生院
次之,村卫生室及个体诊所最低;不同类型样品合格率显示,
物体表面最低,室内空气、医护人员手也较低。提示这些方面
是消毒工作的薄弱环节,也是消毒监测的重点。
医疗单位消毒工作是预防医源性感染的重要措施,也是
保证医疗效果的重要手段。本次消毒效果监测分析揭示华容
县医疗单位消毒工作存在一定的问题,尤其是农村医疗单
位。华容是个农业县,农民看病大多在就近的村卫生室或个
体诊所,而村卫生室及个体诊所多、小、差,农民的医疗安全
难以保障。建议:(1)政府部门应站在关注民生、建设社会主
义新农村的高度加强农村卫生投入,尤其是村卫生室的建
设,在资金和政策上倾斜,努力改善农村卫生工作环境,确保
农民群众的医疗需求。(2)卫生行政部门要加大消毒监督力
度,特别是对村卫生室及个体诊所,对不符合国家卫生标准
的应依法采取停、关、合等强制行政措施,彻底改变目前多、
小、差的局面。(3)各医疗单位及广大医护人员应提高认识,
完善规章制度;加强学习,掌握操作规程和消毒技术;更新消
毒设施,使用新型高效消毒剂,保证消毒效果。从而形成政府
重视、监督得力、自觉履行的长效机制,达到提高医疗单位消
毒质量,保障人民群众身体健康之目的。
(收稿日期:2007-06-04)
(本文编辑:吕莉)
医疗用品类型 监测样品数 合格样品数 合格率(%)
一次性医疗用品 2733 2504 91.6
灭菌医疗用品 264 207 78.4
使用中消毒液 2770 2136 77.1
室内空气 267 162 61.0
医护人员手 2560 1539 60.1
物体表面 2469 1298 52.6
合计 11063 7846 70.9
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