全 文 ：RP2HPLC法测定转基因贯叶连翘植株中褪黑素
王英娟 ,郝建国 ,贾敬芬 3 ,岑举人 ,赵宇玮
(西北大学生命科学学院 西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室 ,陕西 西安 　710069)
摘 　要 :目的 　建立测定褪黑素的反相高效液相色谱紫外分析方法 ,分析并测定通过组培获得的贯叶连翘不同转
基因株系及其亲本植株的褪黑素。方法 　以 Symmetry C18 (150 mm ×416 mm ,510μm)为色谱柱 ;100 mmol 乙酸
铵2甲醇 (80 ∶20)为流动相 ,体积流量为 018 mL/ min ;检测波长为 26518 nm ,灵敏度为 2100 AU FS。结果 　褪黑素
浓度在 20～500 ng/ mL 线性关系良好 ( R2 = 01999 2) ,平均加样回收率为 98109 %( n = 6) ,RSD 为 2121 % ,最小检
出量为 110 ng/ mL 。褪黑素峰保留时间约为 818 min。结论 　该方法可以简便准确分析不同株系贯叶连翘中的褪
黑激素的量 ;贯叶连翘 YXu55 (含庆大霉素抗性标记和 AANA T2HIOM T 基因) 转基因株系的褪黑素的量均高于
p ZP122 (仅含庆大霉素抗性标记 ,不含 AANA T2HIOM T 基因的空白质粒) 转基因株系和未转基因的对照植株 ;而
p ZP122 转基因株系褪黑素的量跟未转基因的对照植株的量几乎相等。
关键词 :贯叶连翘 ;褪黑素 ;转基因 ;RP2HPLC
中图分类号 :R28216 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 1021651203
　　贯叶连翘 Hy pericum perf oratum L1 属藤黄科
贯叶金丝桃属多年生草本植物 ,在我国民间已有
2 400多年的药用历史 ,有清心明目、调经活血、解毒
消炎、解热利湿等多种功效[1 ] 。现代科学证明 ,贯叶
连翘在抗艾滋病毒、抗抑郁等方面具有较强的疗效 ,
是近年世界最畅销草药之一 ,而且其自身所含的褪黑
素也日益被关注[2 ,3 ] 。笔者前期为提高植物中褪黑素
的量 ,已经利用基因工程技术获得了转褪黑素合成酶
基因 (AANAT 和 HIOMT 基因)的贯叶连翘。
褪黑素 ( melatonin) 是最早发现于牛松果体的
一种吲哚类激素[4 ] ,能改善睡眠 ,对免疫、生殖、神
经、心血管、消化系统等均有作用[5 ] 。1995 年首次
在植物中发现褪黑素[6 ] ,目前关于植物中褪黑素的
研究与动物比较还很少 ,在贯叶连翘及转基因贯叶
连翘中未见利用高效液相色谱法 ( H PL C) 紫外检测
的研究报道。本研究探索出一种高回收率的纯化方
法和高灵敏度的检测手段 ,对后期植物中褪黑激素
的量和功能研究十分重要。
1 　材料
贯叶连翘 (西北大学刘文哲教授鉴定)源于西北
大学生物园 ,通过基因工程技术获得的转基因贯叶
连翘及其亲本植株 (亲本对照 C K) 的组培全苗 ,
55 ℃干燥 20 h ,捣成细粉备用。
Waters 269522996 型高效液相色谱仪 (美国
Waters 公司) ;D H G—9123A 型电热恒温鼓风干燥
箱 (上海一恒科技有限公司) , Eppendorf 离心机 (德
国 Gene Company Limited) ;115 mL Eppendorf 管
若干 ;微量加样器。褪黑素对照品购于 Sigma 公司
(质量分数 ≥9919 %) ;甲醇为色谱纯 ,水为超纯水 ,
乙酸铵、无水乙醇等均为分析纯。
2 　方法与结果
211 　色谱条件 :Symmet ry C18 (150 mm ×416 mm ,
510μm)色谱柱 (美国 Waters 公司) ;流动相为 100
mmol/ L 乙酸铵2甲醇 ( 80 ∶20) ,体积流量为 018
mL/ min ,柱温 :常温 ;检测波长为 26518 nm ,灵敏度
为 2100 AU FS ,进样量为 10μL 。色谱图见图 1。
212 　对照品溶液的制备 :精密称取褪黑素对照品
1010 mg ,用 1 mL 甲醇将其溶于 115 mL Eppendorf
管中 ,再精确量取 011 mL 用 019 mL 甲醇稀释制成
1100 mg/ mL 褪黑素对照品溶液储备液 ,其他不同
浓度的对照品溶液由储备液精确稀释得到。
213 　供试品溶液的制备 :参考有关方法[ 7 ]进行褪黑
素的微量提取。精密称取 100 mg 干质量的贯叶连
翘组织 ,加入甲醇 210 mL ,称质量 ,超声波 (80 Hz ,
45 ℃)提取 30 min 后 ,再称质量 ,用甲醇补足质量 ,
13 000 r/ min 离心 ,精密移取上清 110 mL ,作为供
试品溶液。
214 　线性关系考察 :精密移取褪黑素对照品储备
液 ,用甲醇稀释成 2010、5010、10010、15010、20010、
30010、50010 ng/ mL 的系列质量浓度溶液 ,平行测
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3 收稿日期 :2008211217　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (30671082) ;陕西省自然科学基金资助项目 (2007C104) ;中国科学院西部之光基金资助项目
(2008DF01) ;陕西省教育厅基金资助项目 (09J K775)
作者简介 :王英娟 (1971 —) ,女 ,陕西西安人 ,讲师 ,博士 ,研究方向为植物生物技术。　Tel :13359200912 　E2mail :jyxwyj @1261com3 通讯作者　贾敬芬　E2mail :jiajf38 @nwu1edu1cn
t/ min
12褪黑素
12melatonin
图 1 　对照品( A)和样品( B) RP2HPLC色谱图
Fig11 　HPLC Chromatograms of reference
substance ( A) and sample ( B)
定 3 次。以平均峰面积 ( Y) 对质量浓度 ( C) 进行线
性回归 ,得褪黑素回归方程和相关系数分别为 Y =
10 120 X - 52 519 , R2 = 01999 2。表明褪黑素在
5010～50010 ng/ mL 线性关系良好。
215 　样品最低检测量试验 :精密移取褪黑素对照品
储备液 ,用甲醇依次 10 倍稀释成系列质量浓度对照
品溶液 ,分别平行测定 3 次 ,以样品峰为 3 倍于基线
噪音即信噪比 3 ∶1 为指标 ,确定出该方法的样品的
最小检出量为 110 ng/ mL 。
216 　干扰性试验 : 用“213”法制备缺贯叶连翘
H PL C 检测的阴性样品 —空白样品溶液 ,进样 ,结果
在褪黑素色谱峰出现的相应位置上 ,阴性样品无其
他色谱峰被检出 ,说明处理中其他成分对褪黑素的
测定不会产生干扰。
217 　精密度试验 :精密吸取贯叶连翘供试品 (C K)
溶液 1010μL ,重复进样测定 6 次 ,褪黑素峰面积积
分值的 RSD 为 1182 % ,说明测定的精密度良好。
218 　稳定性试验 :精确吸取褪黑素对照品溶液 (100
ng/ mL) 1010μL ,在 0、210、410、610、810 h 各测定
一次 ,5 次褪黑素峰面积积分值的 RSD 为 1145 % ,
表明供试溶液在 8 h 内稳定。
219 　重现性试验 :精密称取同一批贯叶连翘 (C K)
干质量叶粉 10010 mg ,6 份 ,制备样品测定褪黑素
的质量分数 ,6 次测定结果的 RSD 为 1149 % ,表明
此方法重现性良好。
2110 　加样回收率试验 :精密称量贯叶连翘叶干粉
(C K ,质量分数 1182μg/ g) 5010 mg ,共 6 份 ,每份
中分别加入褪黑素对照品 (1μg/ mL) 100μL ,混匀 ,
制备供试品溶液后进行测定。6 次测定平均回收率
为 98109 % ,RSD 为 2121 %。
2111 　样品的测定 :制备供试品溶液 ,每次进样 1010
μL。分别对供试的转基因贯叶连翘不同株系及 CK
株进行测定 ,以 3 次平均峰面积通过回归方程进行计
算 ,得到每个样品中褪黑素的量 (表 1) 。结果表明贯
叶连翘 YXu55 (含庆大霉素抗性标记和 AANAT2HI2
OMT 基因)转基因株系的褪黑素的量约为 pZP122
(仅含庆大霉素抗性标记 ,不含 AANAT2HIOMT 基
因的空白质粒)转基因株系和未转基因的对照植株的
3～4 倍 ;而 pZP122 转基因株系褪黑素的量跟未转基
因的对照植株的量几乎相等。
表 1 　不同贯叶连翘株系植株的褪黑素比较
( x ±s , n = 3)
Table 1 　Comparison of melatonin in different species
of H1 per f oratum ( x ±s , n = 3)
样　品 褪黑素/ (ng ·g - 1)
CK 1 8191800 ±01 872
P1 1 7491717 ±01 705
P2 1 7971003 ±11 136
P3 1 6691767 ±01 561
X4 6 7651354 ±11 054
X5 7 2491792 ±01 953
X6 6 4231468 ±11 207
　　CK 为对照植株 , P1～ 3 为 p ZP122 转基因植株 , X1 ～ 3 为
YXu55 转基因植株
　　CK was wild type , P1 - 3 was pZP122 t ransgenic plant s , X1 - 3
was YXu55 t ransgenic plant s
3 　讨论
褪黑素溶于甲醇 ,不溶于水 ,提取较为简便 ,对
于与褪黑素有相似吸收的杂质只要能有较好的分离
就不需特殊处理[7 ,8 ] ,本研究直接以甲醇作为提取
溶剂 ,减少了提取过程中褪黑素量的损耗 , HPL C 图
杂峰较多 ,但没有对褪黑素的主峰造成很大影响。
该法提取便利、节约。
褪黑素的检测器现在大多应用紫外检测器 ,波
长采用 222～277 nm[5 ,7 ,9 ] 。研究中发现对照品在
223、244、2651 8、277 nm 处均有吸收 ,其中 26518、
277 nm 两处峰形较尖 ,吸收值大 ,而采用 277 nm 作
为检测波长时基线较难稳定 ,对提取物样品和对照
品来说 ,26518 nm 作为 HPL C 的紫外检测波长时
其峰的对称性、分离度、基线稳定性均大有改善 ,且
检测灵敏度高 ,杂质干扰少。
褪黑素的流动相大部分选用甲醇2水 ,仅其比例
不同 ,采用磷酸盐、冰醋酸等调节 H PL C 中的容量
因子 p H 值[7 ,9 ,10 ] 。在以甲醇2水混合液为流动相进
行梯度洗脱时 ,发现加入一定量的乙酸铵后 ,其 p H
值对褪黑素的分离效果理想 ,改善了峰的对称性和
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检测信号 ,使得褪黑素主峰与杂质峰清晰分开。
建立 RP2H PL C 的检测方法 ,可以简便、准确地
测定贯叶连翘的褪黑素量 ,该法测定的贯叶连翘
YXu55 转基因株系的褪黑素量均显著高于 p ZP122
转基因株系和未转基因的 C K 植株 ( T2检测 , 3 P <
0105) ,说明外源褪黑素合成酶基因 AANA T2HI2
OM T 的导入和表达 ,提高了转化植株内源褪黑素
的量 ,同时也为褪黑素功能的研究工作确定了实验
材料。
参考文献 :
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PR2HPLC法测定甘肃蚤缀中苜蓿素、苜蓿素24′2O2β2愈创木基甘油基酯、
异牡荆素、异金雀花素和苜蓿素272O2β2D2葡萄糖苷
雷 　宁1 ,杜树山2 ,欧阳捷3 ,刘丽宏1 ,王永炎2 3
(11 中国人民解放军第二炮兵总医院 药剂科 ,北京　100088 ; 21 北京师范大学 教育部资源药物工程研究中心 ,北京　100088 ;
31 北京师范大学 分析测试中心 ,北京 　100875)
摘 　要 :目的 　建立 HPLC 法对甘肃蚤缀中苜蓿素、苜蓿素24′2O2β2愈创木甘油基酯、异牡荆素、异金雀花素和苜蓿
素272O2β2D2葡萄糖苷同时定量的方法。方法 　采用反相高效液相色谱法。色谱柱为 Diamonsil TM C18 (250 mm ×
416 mm ,5μm) ,流动相为乙腈2015 %磷酸梯度洗脱 ;体积流量为 110 mL/ min ;柱温为 30 ℃;检测波长为 350 nm ;
进样量为 10μL 。结果 　苜蓿素、苜蓿素24′2O2β2愈创木基甘油基酯、异牡荆素、异金雀花素和苜蓿素272O2β2D2葡萄
糖苷 5 个化合物达到基线分离且线性关系良好 ,线性范围分别为 5144～97192μg/ mL ( r = 01999 2) 、4176～85168
μg/ mL ( r = 01999 2) 、6152～117136μg/ mL ( r = 01999 6) 、4192～88156μg/ mL ( r = 01999 8) 、1160～29134μg/ mL
( r = 01999 1) ,平均加样回收率分别为 100121 % ( RSD = 1194 %) 、97150 % ( RSD = 2150 %) 、100138 % ( RSD =
2146 %) 、98154 %(RSD = 2140 %) 、97145 %(RSD = 3114 %) 。结论 　测定了 4 种来源的甘肃蚤缀样品中 5 个化合
物的量 ,该方法分离度好、快速、简便 ,重现性佳。
关键词 :甘肃蚤缀 ;苜蓿素 ;苜蓿素24′2O2β2愈创木基甘油基酯 ;异牡荆素 ;异金雀花素 ;苜蓿素272O2β2D2葡萄糖苷
中图分类号 :R28216 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 1021653203
　　甘肃蚤缀为石竹科蚤缀属植物甘肃蚤缀 A re2
nari a kansuensis Maxim1 的干燥全草 ,系传统藏药 ,
其味苦、性寒 ,具清热利肺、退热止咳之功效。藏医
常用于治疗各种肺病、淋巴结核、黄疸、风湿、肾结石
以及筋骨疼痛等[1～3 ] 。现代药理学研究表明 ,甘肃
蚤缀具有抗炎、免疫调节、抗缺氧和肿瘤抑制等作
用[ 4 ,5 ] 。早年有研究从甘肃蚤缀中分离得到甾类、
生物碱类和黄酮类化合物。为了寻找其活性成分 ,
研究者曾经对甘肃蚤缀全草 70 %乙醇提取物的大
孔吸附树脂 50 %乙醇洗脱物进行了系统的化学成
分研究 ,发现其含有多种黄酮类化合物 ,其中苜蓿
素272O2β2D2葡萄糖苷、苜蓿素24′2O2β2愈创木基甘油
基酯和异牡荆素为首次从该植物中得到 ,且苜蓿素2
4′2O2β2愈创木基甘油基酯为首次从石竹科植物中分
·3561·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 10 期 2009 年 10 月
3 收稿日期 :2008212214　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
作者简介 :雷　宁 (1978 —) ,女 ,陕西人 ,博士 ,主要从事天然药物药效物质基础与质量控制研究工作。　
Tel : (010) 66343257 　E2mail :lilyzebra @1631com