全 文 ：还具有多种成分、多种作用,一直以来人们对其作用
机制尚无明确认识。本研究选择了其中几个环烯醚
萜类成分比较系统地研究了其可能的作用, 计算结
果表明确定多个成分作用于一个靶标, 一个成分作
用于多个靶标的情况, 与中药的治病理念有类似的
地方。本研究只是整个研究的一个方面, 对于阐明
栀子的总体作用,还需要研究尽可能多的成分、量大
的成分各种可能的作用, 以及各成分之间的相互作
用,本研究结果提示理论方法研究中药复杂体系具
有一定的可行性 [ 11]。
本研究是一个初步的虚拟评价研究,之所以称
为虚拟评价是为了区别虚拟筛选的概念。通常虚拟
筛选是利用少量的靶标对大量的分子进行理论筛
选,目的是帮助发现先导化合物,本研究利用大量的
靶标结构对少量的分子进行潜在活性的筛选, 目的
是比较完整地评价分子的潜在作用,故称作虚拟评
价[ 5, 11]。随着越来越多的靶标结构的确定、计算机
计算能力的提高,从理论上预测分子活性的结果越
来越准确,因此,利用虚拟评价的方法研究中药这样
的复杂体系的作用规律具备了一定的可行性, 能够
为实验的研究提供方向性的参考数据。
3 讨论
本研究选择了环烯醚萜苷元、含饱和及不饱和
五元环的环烯醚萜苷共 6 个栀子成分, 利用对接计
算系统研究了其与常见靶标的理论结合能力, 以扣
除非特异得分后的选择性分级判断标准, 虚拟评价
了其与靶标晶体结构作用的选择性。理论上发现环
烯醚萜苷的选择性靶标对应的疾病与文献报道的治
疗疾病及药理作用具有较好的吻合,表明虚拟评价
的技术具有较大的实用性, 为利用理论手段研究中
药的作用机制进行了有益的尝试。
本研究的结果表明,糖基对于环烯醚萜类的作
用具有重要的影响, 饱和五元环对于提高靶标的选
择性具有较大的意义。
本研究表明,环烯醚萜类能够作用的选择性靶
标涉及心衰、高血压、自身免疫疾病、抑郁症、疟疾等
疾病,提示这类成分有可能用于相应疾病的治疗,还
需要实验上进一步的研究和探索。
致谢: 上海超算中心和华南理工大学网络计算
中心提供支持。
参考文献:
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麻黄碱与伪麻黄碱平喘效果及机制比较研究
刘 赜1 ,石 倩2 ,杨 洋1 ,李若洁1 , 朱元元2* ,白 钢1, 2
( 11 南开大学生命科学学院, 天津 300071; 21 南开大学药学院, 天津 300071)
摘 要:目的 探讨麻黄碱与伪麻黄碱在平喘作用效果与机制方面的差异。方法 取麻黄碱、伪麻黄碱和草麻黄
提取物供试样品,分别在分子细胞受体、离体器官及整体动物水平进行实验, 比较其作用效果。结果 麻黄碱、伪
麻黄碱以及草麻黄提取物均可以激动B2 肾上腺素受体, 并且麻黄碱的激动效果 ( EC50 ) 优于伪麻黄碱 ( EC50 ) ; 豚
鼠离体气管平滑肌实验中,麻黄碱对乙酰胆碱 ( Ach) 引起的豚鼠离体气管平滑肌收缩的解痉作用优于同浓度的伪
麻黄碱;麻黄碱可以延长组胺致喘豚鼠的引喘潜伏期, 其作用效果优于同浓度伪麻黄碱的作用, 且草麻黄提取物亦
#771#中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 5 期 2009 年 5 月
* 收稿日期: 2008- 10-14 基金项目:天津市自然科学重点基金项目 ( 07JC ZDJC05000)
* 通讯作者 朱元元 E- mai l: z huyyi@ nankai. edu. cn
有此相同作用。结论 草麻黄提取物含有麻黄碱及伪麻黄碱, 麻黄碱在平喘效果上优于伪麻黄碱, 并且草麻黄中
麻黄碱的量高于伪麻黄碱,草麻黄中主要由麻黄碱起到平喘作用,伪麻黄碱具有辅助的作用。
关键词:草麻黄; 麻黄碱; 伪麻黄碱; B2肾上腺素受体激动剂
中图分类号: R2851 5 文献标识码: A 文章编号: 0253 2670( 2009) 05 0771 04
麻黄为麻黄科植物草麻黄 Ep hed ra sinica
Stapf、中麻黄 Ephedr a intermed ia Schrenk 或木贼
麻黄 Ephedr a equiesti f olia Bunge 的干燥草质
茎[ 1]。麻黄茎中生物碱主要为麻黄碱和伪麻黄碱及
少量的甲基麻黄碱、甲基伪麻黄碱、去甲基麻黄碱、
去甲基伪麻黄碱等[ 2] 。其中麻黄碱和伪麻黄碱是一
对差向异构体[ 3, 4] 。研究表明麻黄碱对机体多个系
统、器官、组织均有作用, 其作用机制复杂,而且涉及
各型肾上腺素受体 [ 5, 6] ; 而伪麻黄碱的研究资料相
对较少,其作用方式多以间接作用为主,临床上主要
作为抗感冒药的成分。本研究分别从细胞受体、离
体器官以及整体动物水平上, 对麻黄碱、伪麻黄碱以
及草麻黄提取物对B2 肾上腺素受体相关的平喘机
制进行了研究, 明确麻黄碱及伪麻黄碱在哮喘治疗
过程中的作用。
1 材料
11 1 仪器: Shimadzu 10A 系列高效液相色谱仪
(日本岛津) , 荧光倒置显微镜 ( Olympus Ù 71, 日
本) , 恒温平滑肌槽、张力传感器以及生物信号采集
系统(盟泰生物技术公司) ,超声波雾化器(亚都科技
有限公司)。
11 2 材料:各种型号树脂均购自南开大学化工厂;
豚鼠购自军事医学科学院实验动物中心; 草麻黄中
药饮片购自天津市药材公司(天津药物研究院张铁
军教授鉴定) ; CHOB2-A R-CRE-GFP 细胞系由本实
验室构建[ 7] 。
11 3 试剂:盐酸麻黄碱及盐酸伪麻黄碱对照品(质
量分数> 99%) ,购自中国药品生物制品检定所; 沙
丁胺醇和乙酰胆碱 ( Ach) 购自 Sigma 公司; 细胞培
养基购 自 GibcoBRL Life T echnolo gies 公司;
HPLC 用试剂均为色谱纯,用水为双蒸水。其余试
剂均为国产分析纯。
2 方法
211 草麻黄提取物的制备: 参照文献方法进行[ 8]。
取草麻黄中药饮片 100 g 水中浸泡过夜,次日超声处
理 30 min,取上清。将上清液调 pH 至11,后经 D151
大孔树脂吸附,用 01 08 mol/ L 盐酸洗脱,提取液经冷
冻干燥后,得到 3871 69 mg 草麻黄提取物。
21 2 HPLC 色谱条件:色谱柱为 Kromasil C18 ( 250
mm @ 4. 6 mm, 5 Lm) ; 流动相: 乙腈-01 2% 磷酸
( 1 B20) ; 体积流量: 01 8 mL/ m in; 检测波长: 205
nm;柱温: 室温; 进样量: 10 LL。
21 3 CHOB2-AR-CRE-GFP 细胞活性检测 [ 7] :取供
试样品经含有 10% FBS 的 RPM I 1640 培养基系
列稀释后,加入稳定转染有 B2肾上腺素受体基因和
GFP 报告基因的 CHOB2-AR-CRE-GFP 细胞 ( 5 @
10
4
) 的 96 孔板中 ( 100 LL/孔)。37 e 、5% CO 2的
条件下孵育 10 h,弃去培养基加入等体积的 PBS 溶
液,置于荧光倒置显微镜下观察拍照, 并用 Image
Pro Plus 5. 1软件 ( Media Cybernet ics, Inc,美国) 进
行荧光强度分析。分别设荧光强度的最大值为
100%、最小值为0,计算细胞产生荧光强度的百分比。
21 4 离体气管收缩实验[ 9] :豚鼠击头致昏,剥取气
管,剪成气管片 ( 4 mm @ 8 mm) , 并固定于盛有
Krebs-H enseleit 缓冲液 ( 20 mL) 的 37 e 恒温浴
槽中,持续通入 95% O 2和 5% CO 2的混合气体,静
息负荷 1 g 重物后, 加入 Ach, 记录最大收缩效应,
作为空白对照。经 Krebs-Henseleit 缓冲液反复冲
洗,待肌张力恢复至基线后,加入待测药物和系列稀
释的 Ach,分别测量量效曲线。
21 5 磷酸组胺致敏的豚鼠哮喘实验[ 10] :取 ( 150 ?
3) g、豚鼠,雌雄各半,置玻璃钟罩内, 以超声喷雾器
喷入 ( 01 5 mL/ m in) 01 1% 磷酸组胺 20 s, 记录豚
鼠产生哮喘的时间,即哮喘潜伏期。并将筛选的哮
喘豚鼠进行随机分组 ( n= 6) , 分别为对照组, 阳性
对照沙丁胺醇 ( 11 92、01 192、01 019 2 Lg/ kg ) 组,麻
黄碱 ( 01 67、01 067、01 006 7 Lg/ kg )、伪麻黄碱
( 01 67、01 067、01 006 7 Lg/ kg ) 以及草麻黄提取物
( 51 45、01 545、01 054 5 Lg/ kg ) 组, 喷雾给药或生理
盐水 1 min 后,再将豚鼠放入玻璃钟罩内,并按上述
条件给予 01 1% 磷酸组胺, 记录哮喘潜伏期的变
化。使用 Graph Pad Pr ism 5. 0 软件进行多样本配
对 t检验统计学分析。
3 结果
31 1 草麻黄提取物的 HPLC 分析:取一定量上述
草麻黄提取物样品溶液 ( 100 mg / mL) , 以 HPLC
检测。如图 1 ( A, B) 所示,在该色谱条件下麻黄碱
与伪麻黄碱得到较好的分离, 其保留时间分别为
191 398、211 532 min,经与对照品比较, 其质量分数
分别占草麻黄提取物的 121 3% 和 31 7%。
#772# 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 5 期 2009 年 5 月
1-麻黄碱 2-伪麻黄碱
1-ephedrin e 2- pseu do-ephedrine
图 1 麻黄碱和伪麻黄碱混合对照品(A)及草麻黄提取物
( B) 的 HPLC 色谱图
Fig. 1 HPLCChromatogram of mix reference substance
of ephedrine and pseudoephedrine (A) , and
E. sinica extract ( B)
31 2 草麻黄提取物中B2 肾上腺素受体激动剂的检
测及活性分析: 分别收集草麻黄提取物 HPLC 色谱
峰对应的洗脱液, 除去溶液中的有机相后 10 倍稀
释,利用 CHOB2-AR-CRE-GFP 细胞系, 确定 B2 肾
上腺素受体激动剂的存在部位。结果如图 2 所示,
只有麻黄碱和伪麻黄碱对应色谱峰洗脱液能明显地
刺激细胞表达绿色荧光, 而其他组分均不显示B2 肾
上腺素受体激动活性。
图 2 草麻黄提取物 HPLC 组分对B2 肾上腺素受体
激动能力
Fig. 2 Stimulation of HPLC fractions of E. sinica
extract toB2-AR
31 3 麻黄碱与伪麻黄碱的B2 肾上腺素受体激动效
果:如图 3所示, 与沙丁胺醇 ( EC50 01 283 3 Lmol/
L) 相比,麻黄碱和伪麻黄碱均显示了较强的 B2 肾
上腺素受体激动能力, EC50分别为 171 79 和 511 19
Lmol/ L,伪麻黄碱与麻黄碱相比其 B2 肾上腺素受
体激动能力较弱。
31 4 麻黄碱与伪麻黄碱对豚鼠离体气管收缩的抑
制作用: 设定低剂量 Ach ( 1 nmol/ L ) 的收缩率为
0,而高剂量 A ch ( 1 mmol/ L) 的收缩率为 100%。
如图 4 所示, 空白对照组 EC50值为 81 09 Lmol/ L ,
当加入阳性对照药沙丁胺醇 ( 01 024 Lg/ mL) 后量
效曲线明显右移, EC50为 571 43 Lmol/ L , 为空白对
照组的 71 1 倍。当加入麻黄碱 ( 01 2 Lg / mL)、伪麻
黄碱 ( 01 2 Lg/ mL) 和草麻黄提取物 ( 161 6 Lg/ mL)
后,量效曲线也出现不同程度右移, 其 EC50值分别
为空白对照组的 31 57、21 16、41 35 倍。结果表明草
麻黄提取物对 Ach 引起的豚鼠离体气管平滑肌收
缩有较好的解痉的作用, 而麻黄碱的作用明显强于
伪麻黄碱。
31 5 麻黄碱与伪黄碱对组胺致敏豚鼠的抗哮喘效
果:见表 1。与对照组相比, 高、中、低不同剂量麻黄
碱、伪麻黄碱和草麻黄提取物,均能剂量依赖性地延
长豚鼠哮喘潜伏期 ( P< 01 01) , 且麻黄碱的作用要
明显优于相同剂量的伪麻黄碱 ( P< 01 05)。
4 讨论
构效关系分析表明, 麻黄碱和伪麻黄碱均具有
苯乙胺的基本结构, 一般认为该类药物分子中的氨
基、苯环以及在氨基的 B位的醇羟基 3 个部分与受
体形成三点结合。侧链氨基被非极性烷基取代后,
对 B2 肾上腺素受体的选择性也增强; 侧链氨基 A碳
原子上引入甲基, 可阻碍单胺氧化酶( MAO)对氨
#773#中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 5 期 2009 年 5 月
表 1 麻黄碱、伪麻黄碱、草麻黄提取物对组胺致
喘豚鼠的平喘作用 ( x? s, n= 6 )
Table 1 Ant-i asthmatic effects of ephedrine, pseudo-
ephedrine and E. sinica extract on asthmatic
guinea pig induced by His ( x? s, n= 6 )
组别
剂量 /
( ng # kg- 1 )
延喘时间/
s
组别
剂量/
( ng# kg- 1)
延喘时间/
s
对照 - - 111 60 ? 31 45 伪麻黄碱 670 68121? 51 25* *
沙丁胺醇 1 920 3691 23 ? 221 95* * 67 46165? 71 09* *
192 2661 11 ? 171 37* * 61 7 24141? 41 78* *
1912 1701 62 ? 141 55* * 草麻黄提取物 5 450 178173? 71 91* *
麻黄碱 670 1661 20 ? 51 23* * 545 95184? 111 87* *
67 981 00 ? 91 12* * 5415 73185? 31 46* *
61 7 541 77 ? 71 96* *
与对照组比较: * * P < 01 01
* * P< 01 01 v s cont rol gr ou p
基的氧化、代谢脱氧, 可使药物的作用时间延长, 但
伪麻黄碱的 A碳原子上引入甲基的构象正好同麻黄
碱相反,阻碍了铵离子与受体下部的结合因而活性
较小[ 11] 。虽然B2 肾上腺素受体的晶体结构刚刚被
解析, 但受体与激动剂的构效关系还不十分明
确[ 12]。麻黄碱与伪麻黄碱的构效关系见图 5。
图 5 麻黄碱与伪麻黄碱的构效关系分析
Fig. 5 Structure-activity relationship of ephedrine
and pseudo-ephedrine
在不同产地的麻黄药材中,麻黄碱的量一般高于
伪麻黄碱可以达到 3~ 4倍[ 1]。结合本实验结果,不
论是细胞受体、离体器官还是整体动物水平,麻黄碱
均表现出较相同浓度的伪麻黄碱有更强( 2~ 4倍)的
平喘效果。因此在麻黄提取物或制剂中,麻黄碱的平
喘效果可以达到伪麻黄碱 6~ 15 倍。故可以推测麻
黄碱是麻黄及其制剂具有平喘效果的主要因素。
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蕨麻提取物对小鼠缺血再灌注心肌损伤的保护作用
叶 立1, 2 ,陈 洋3 ,李灵芝2, 3* , 张永亮2, 3
( 11 天津医科大学总医院,天津 300052; 21 天津市职业与环境危害生物标志物重点实验室, 天津 300162;
31 中国人民武装警察部队医学院, 天津 300162)
摘 要:目的 研究蕨麻乙醇提取物的抗心肌缺血再灌注损伤作用。方法 采用垂体后叶素+ 硝酸甘油建立小鼠
急性心肌缺血再灌注损伤模型,监测心电图变化; H E 染色法观察心肌病理改变; N agar-Olsen 特殊染色观察心肌缺
血损伤程度;生化方法检测血清乳酸脱氢酶 ( LDH )、肌酸激酶 ( CK )、超氧化物歧化酶 ( SOD ) 活性和丙二醛
( MDA ) 水平。结果 蕨麻乙醇提取物能减轻缺血再灌注导致的心电图 J 点抬高, 提高 SOD 活性, 降低血清
#774# 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 5 期 2009 年 5 月
* 收稿日期: 2008- 11-12 基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 30672774)作者简介:叶 立( 1966 ) ) ,女,浙江杭州人,副主任药师,主要从事临床药学研究。
* 通讯作者 李灵芝 T el: ( 022) 60578184 E-mail: llzh x@ tom . com