全 文 ：文章编号:2095 － 1116(2014)05 － 0436 － 04 ·基础医学·
收稿日期:2014 － 03 － 18
作者简介:陈健文，本科，主管技师，研究方向:药物药效学，E-mail:
cjw1975@ 263． net．通讯作者陈少锐，博士，讲师，研究方向:心血管药
理学，E-mail:chshaor@ mail． sysu． edu． cn．
草麻黄抗补体组份对血小板变形及内皮细胞损伤作用
陈健文1，张文平2，周长华1，黄守坚1，陈少锐1
(1．中山大学药学院药理与毒理学实验室，广东 广州 510006;2．赣南医学院病原生物学教研室)
摘 要: 目的 从草麻黄中分离抗补体组份并观察其抗补体依赖性的损伤作用。 方法 采用柱层析结合紫
外吸收观察的方法分离抗补体组份;采用比浊法观察组份对眼镜蛇毒因子引起的血小板变形的影响;采用 MTT法观
察组份对异种血清对内皮细胞损伤的影响。 结果 紫外吸收为 196 nm的组份具有抗补体作用，麻黄组份能有效抑
制眼镜蛇毒因子引起的血小板变形，高、中、低剂量对血小板变形的抑制率分别为 49． 8% ± 10． 7%、32． 8% ± 4． 2%、
22. 5% ±6． 2% ;麻黄组份能有效减轻异种血清对内皮细胞的损伤，高、中、低剂量对补体致内皮细胞损伤抑制率分别
为 88． 1% ±7． 1%、79． 8% ±3． 3%、65． 0% ±4． 5%。 结论 麻黄抗补体组份对补体依赖性损伤有保护作用。
关键词: 草麻黄; 补体; 攻膜复合物; 补体依赖性损伤
中图分类号:Ｒ967 文献标识码:A
Isolation of Anti-complement Components from Ephedra Sinica and
its Protective Effect on Complement-dependent Injury
CHEN Jianwen，ZHANG Wenpin，ZHOU Changhua，et al
(Laboratory of Pharmacology and Toxicology，School of Pharmaceutical Sciences，Sun Yat-sen University，
Guangzhou，Guangdong 510006，China)
Abstract: Objective To isolate the anti-complement components from ephedra sinica and investigate its protective
effect on complement-dependent injury． Methods Anti-complement components were seprerated by using column chro-
matography;turbidimetric assay was used to investigate the effect of anti-complement component on CVF-induced platelet
metamorphose;MTT method was used to investigate the effect of anti-complement components on endothelial cells injury
caused by rabbit serum． Ｒesults Anti-complement components effectively reduced CVF-induced platelet metamorphose
and attenuated the endothelial cells injury caused by rabbit serum． Conclusion Anti-complement components may have
protective effect on complement-dependent injury．
Key words: ephedra sinica; complement; member attack complex; complement-dependent injury
补体系统(complement system)是由 30 多种蛋
白组成的复杂系统，它由补体固有蛋白、补体调节蛋
白、补体受体组成，补体系统有多种生物学功能［1］。
通常补体系统受到补体调节蛋白的精确调控不会引
起同源组织损伤，如果补体系统在病理条件下过度
激活，就会引起依赖补体的组织损伤，引起包括自身
免疫性疾病、成人呼吸窘迫综合症、非典型性肺炎、
移植中的超急性排斥反应等［2-3］。补体激活产生的
攻膜复合物 C5b6789n (Member Attack Complex，
MAC)能引起血小板活化和血管内皮的损伤［4-5］，该
作用构成了补体依赖性损伤的血管内凝血机制。抑
制补体的激活可以有效地防止一些免疫性损伤。草
麻黄(ephedra sinica)为中国的传统中药，具有广泛
的药理作用。多个治疗免疫性疾病的方剂中含有麻
黄成分［6-7］，研究发现麻黄的水提物能抑制补体的
激活［8］，麻黄的抗补体成分可能参与了免疫性疾病
的治疗。本研究从麻黄中分离出抗补体组份，研究
其抗补体活性，并针对依赖补体损伤的基本病理过
程(血管内凝血机制)，观察麻黄组份的保护作用。
634 Medical Science Journal of Central South China，Sep 2014，Vol． 42，No． 5
DOI:10.15972/j.cnki.43-1509/r.2014.05.003
1 材料与方法
1． 1 材料与试剂
眼镜蛇毒因子(Cobra Venom Factor，CVF):实
验室制备，采自华南眼镜蛇(Naja naja atra);大鼠、
豚鼠、新西兰白兔由中山大学实验动物中心提供;新
生小牛来源于广州奶牛研究所;草麻黄由广州奇星
药厂生药部提供;绵羊血由广州儒林畜牧场提供;
Sephadex G-100 购于 Pharmacia;500 型 Chrono-Log
血小板聚集仪购于 Chrono-Log． USA;810 型 Aggro /
Link电脑接口购于 Chrono-Log． USA。
1． 2 麻黄组份的粗制品的分离
参照文献［8］的方法加以改进:100 g 麻黄用
1 200 mL蒸馏水浸泡24 h，煮沸1 h，趁热用四层纱布过
滤得棕黄色液体。待液体降至室温后，用1 mol /L的氢
氧化钠调液体的 pH为 9． 0出现大量沉淀，搅拌 1 h后
2 000 g离心 30 min，取沉淀用无水乙醇洗涤，2 000 g离
心 30 min 取沉淀。沉淀用50 mL蒸馏水重悬后，用
1 mol /L的盐酸调液体的 pH为 4． 0，搅拌 12 h 后用冷
凝回流烧瓶煮沸 1 h(保持液体体积不变)，冷却至室温
后，1 000 g离心 15 min，取上清液。重复碱沉淀，酸溶
解的步骤 2次，取上清液，即得粗制品溶液。
1． 3 粗制品溶液的层析分离
取 Sephdex G-100 装柱，柱高 55 cm，内径
1． 8 cm，凝胶体积 140 mL。取 5 mL 粗制品上柱进
行层析，洗脱液为 pH 4． 0 的水，操作压 15 cm水柱，
每 15 min收集 1 管，每管 4． 5 mL。以 196 nm 为监
测波长测定吸光度，并定性测定各管的抗补体活性，
收集有抗补体活性的各管，低温真空干燥保存。
1． 4 抗补体活性测定方法
参照文献［9］，设置倍比稀释的麻黄组分管及
对照管，全溶管，测定各管在 541 nm波长的吸光度。
根据溶血率 Y = 样本管 541 /全溶管 541，以
Lg［Y /(1-Y)］为轴，以麻黄组份剂量的常用对数为
X轴，推算回归方程。当 Y /(1 － Y)= 1 时即 50%
溶血时，所对应的剂量即为抑制 50%溶血的剂量。
1． 5 比浊法测血小板变形聚集
比浊法测血小板变形聚集，按文献方法制备血
小板血浆并计数［10-11］，调整血浆血小板数为(6 ～
7)× 1011 /L。加样器取 250 μL 贫血小板血浆
(PPP)和 PＲP富血小板血浆置于已硅化的玻璃管，
PPP 为空白对照，PＲP 置于 Chrono-Log 血小板聚集
仪测定孔并放入硅化搅拌磁棒搅拌(1 000 转 /分)，
37°预热 3 min。起动程序，设定基线并描记 30 sPＲP
基线后加入 CVF 5 μL 描记 15 min 血小板变形，聚
集曲线。实验组同上描记 30 s 基线后加入体积为
25 μL 的倍比稀释的麻黄组份 (低剂量组:
0． 24 g /L、中剂量组:0． 36 g /L、高剂量组:0． 54 g /L)
搅拌 3 min后加入 CVF 5 μL，描记曲线观察麻黄组
份对血小板变形聚集的影响。以 25 μL的生理盐水
代替麻黄组份作为空白对照重复步骤。
1． 6 MTT法观察麻黄组份对兔血清对牛内皮细胞
的损伤
按文献方法取材和原代培养内皮细胞［12］。培养
的细胞经第八因子(Ⅷ因子)相关抗原抗体酶联免疫
法(ABC法染色)，鉴定为内皮细胞。继续培养并传
代，实验用 2 ～ 5 代细胞。将细胞悬液配制成 1 ×
108 /L，接种于 24孔板，每孔 0． 8 mL，待细胞基本融合
进行处理。分对照组、模型组及高、中、低剂量的麻黄
组份组(5、2． 5、1． 25 g /L，每 4 个孔为一个处理组)。
对照组:56 ℃加热 30 min 热灭活的新鲜兔血清用
VBS缓冲液 1∶ 4 稀释 + PBS 缓冲液;模型组:用 VBS
缓冲液 1∶ 4稀释新鲜兔血清 + PBS 缓冲液;高、中、低
剂量的麻黄组份组:用VBS缓冲液1∶ 4稀释新鲜兔血
清 +倍比稀释的麻黄多糖(溶于 PBS 缓冲液)。在各
组中缓冲液或麻黄组份溶液预先与血清混合，在 37°
温箱孵育 10 min后加入 24 孔板中摇匀，置于培养箱
中 4 h，中途再摇匀一次。处理 4 h后，采用MTT法测
定细胞生存率。在酶标仪上测定光密度值(OD值)，
测定波长为 570 nm，参考波长为 630 nm。以细胞生
存率 =处理组 OD/对照组 OD ×100%。
1． 7 统计学方法
应用 SPSS10． 0 软件，各组数值以均数 ±标准差
表示，单因素方差分析后 LSD检验，P ＜ 0． 05 为差异
有显著性。
2 结 果
2． 1 草麻黄抗补体组份的提取与分离
生药麻黄经水煮后，对水溶液进行乙醇的洗涤，
二次的煮沸，以及三次的碱溶液的沉淀、酸溶液的溶
解过程得粗制品溶液。将粗制品经 Sephedex G-100
分子筛层析柱分离，取在 196 nm波长的紫外光有高
吸收峰的组分，并用致敏绵羊红细胞进行抗补体活
性测定。麻黄 100 g 获得有 196 nm 波长吸收特征
的抗补体组份 30． 2 mg，回收率为 0． 3%。
734中南医学科学杂志 2014 年 9 月第 42 卷第 5 期
2． 2 抗补体活性测定结果
富含补体的豚鼠血清能使敏化的绵羊红细胞溶
解。预先将豚鼠血清与麻黄多糖孵育，能抑制其溶
血作用。以系列剂量确定组份的抗补体活性单位，
根据相对溶血率和抗补体组份剂量，计算出组份对
豚鼠血清的的 IC50为 44． 8 mg /L。
2． 3 麻黄抗补体组份对眼镜蛇毒因子致大鼠血小
板变形抑制率
眼镜蛇毒因子引起大鼠血小板显著变形，预先
加入麻黄组份能有效抑制 3 min后加入 CVF引起的
血小板变形。变形抑制率随着麻黄组份剂量的增加
而增加，呈现量效关系，见表 1。
表 1 麻黄组份对 CVF引起的血小板变形抑制率(n = 5)
组别 变形抑制率(%)
生理盐水对照组 9． 3 ± 3． 2
麻黄组份低剂量组(0． 24 g /L) 22． 5 ± 6． 2
麻黄组份中剂量组(0． 36 g /L) 32． 8 ± 4． 2a
麻黄组份高剂量组(0． 54 g /L) 49． 8 ± 10． 7b
与对照组比较，a:P ＜ 0． 05，b:P ＜ 0． 01
2． 4 麻黄抗补体组份对兔血清对牛内皮细胞损伤
的影响
培养的细胞经Ⅷ因子相关抗原抗体酶联免疫法
ABC法染色，鉴定是内皮细胞。新鲜兔血清能损伤
内皮细胞，细胞生存率降低。麻黄组份预先与兔血
清 37 ℃孵育 10 min 后，能减轻兔血清对培养的牛
内皮细胞的损伤，呈现出剂量关系，见图 1。
图 1 麻黄抗补体组份对兔血清对牛内皮细胞损伤的影响
1:对照组;2:模型组;3:低剂量组;4:中剂量组;5:高剂量组． 与模
型组比较，* :P ＜ 0． 05
3 讨 论
本文根据该组分在酸性液中溶解、在碱性液中
析出的特点，对煮沸后的麻黄水溶液进行多步处理。
在实验过程中，曾对丢弃的沉淀物及上清液进行测
定，发现它们不同程度地具有抑制补体对致敏绵羊
红细胞的溶解作用，即有抗补体活性。推测麻黄煮
沸水解后产生多种产物，具有不同的化学性质，相当
多的物质由于具有某些活性基团而表现出抗补体活
性，本文作者采用的方法分离的只是其中的一部分。
应用分子筛以及活性测定法来对活性组分进行分
离，发现在 196、202 nm有吸收峰组分表现出较高效
价的抗补体活性，其中峰值为 196 nm 的含量最高。
文献采用的薄板层析分离的方法［8］，需反复制备薄
板，一次上样量小的缺点，采用分子筛柱层析配合
196 nm 紫外吸收测定的方法对抗补体成分进行分
离，简便实用，上样量大，重复性好，得率较高，能满
足实验室的需要。
本实验组利用来源于华南地区中华眼镜蛇(na-
ja naja atra)的眼镜蛇毒因子(cobra venom factor，
CVF)建立起激活补体旁路引起血小板变形聚集的
模型。该蛇毒因子同时具有激活 C3、C5 的作用且除
激活补体作用外尚未发现其他直接的生物活性。旁
路激活补体作用于大鼠血小板发生明显的变形和缓
慢的血小板聚集，参与生理性止血或病理性血栓形
成。该作用依赖于补体，因为 56 ℃，30 min 处理血
浆后(热灭活补体)变形聚集作用消失［13-14］。麻黄
抗补体组份能有效减轻血小板的变形作用，表明该
组份对旁路激活途径有抑制作用，提示有防治血管
内凝血的作用。
补体活化能通过多种机制促进血管内凝血的发
生，C5b6789n(攻膜复合物)能溶解内皮细胞，破坏
细胞间连接，暴露并激活内皮下基质，基质粘附并激
活血小板及凝血酶引起凝血反应［15］。补体活化产
生的过敏毒素 C3a、C5a可结合并激活炎症细胞(如
中性粒细胞和巨噬细胞)产生氧自由基及弹性蛋白
酶影响内皮细胞功能并使硫酸化肝素脱落加强了凝
血倾向［16-17］。
异种血清与培养的内皮细胞共同孵育，建立起
超急性排斥的模型已被广泛应用于实验研究当中。
大多数实验研究认为经典激活途径是超急性排斥反
应发生的主要原因［18-20］。由于天然抗体的存在，补
体的激活过程很快，所以补体的细胞毒作用也很迅
速，如 C5a促进黄嘌呤脱氢酶在 5 ～ 10 min 内转化
为黄嘌呤氧化酶，促进氧自由基的生成［21］。在30 ～
60 min被激活的内皮细胞丢失超过 50%的细胞表
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面的硫酸化肝素［22］。MAC 在 5 min 内可在细胞连
接上形成 5 μm直径的小洞［23］。本次实验将新鲜兔
血清与新生小牛胸主动脉内皮细胞孵育 4 h 能使超
急性排斥反应充分发生。麻黄组份预先与血清温育
10 min后，观察到其减弱了新鲜血清对内皮细胞的
损伤作用。可能是由于存在麻黄组份抑制补体活
化，减轻了补体依赖性损伤。本文中发现麻黄组份
能有效地抑制补体引起的血小板激活以及抑制补体
损伤内皮细胞，表明该组份可能防止补体依赖性的
血管内凝血反应，为麻黄治疗免疫性疾病提供了理
论依据，也为进一步研究和开发麻黄做出了初步
探索。
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